Antimikrobielle peptider: Historie, fremkomst og fremtid

Ved at kende til forskellene på bakterie- og menneskeceller er det muligt at finde og designe lægemidler, der effektivt rammer bakterier uden at påvirke resten af kroppen. Dermed undgår man bivirkninger ved medicinen, som kan være til gene for patienten. Målet med designet er at gå efter mekanismer eller strukturelle egenskaber, der er unikke for bakterier og derfor ikke findes i humane celler. Inden for medicinalkemien siger man, at man leder efter nogle specifikke ’targets’, dvs. mål hos bakterien, som lægemidlet skal angribe. Denne viden om bakteriers ’targets’ er en meget vigtig del af antibiotikadesign. Især i løbet af 1900-tallet er der sket store fremskridt mht., hvordan man bedre kan bekæmpe bakterielle infektioner. Denne udvikling førte til, at en amerikansk kirurg i 1967 udtalte: “The time has come to close the book on infectious diseases. We have basically wiped out infection in the United States”. Dette er desværre i høj grad blevet modbevist efterfølgende, idet der siden udtalelsen er fremkommet mange nye bakterielle infektionssygdomme.

Men hvordan kan der være fremkommet så mange nye bakterieforårsagede sygdomme, når der er sådan en rig forekomst af antibiotika?

En lemfældig omgang med antibiotika som en nem og hurtig behandlingsform har medført, at mange bakterier enten har været udsat for så små mængder af antibiotika, at det ikke har dræbt alle bakterierne, eller for antibiotika, der ikke angriber bakteriens ’targets’. Hvis en bakterie overlever en antibiotikabehandling kan dette enten skyldes, at behandlingen ikke er blevet ført til ende og derved ikke har dræbt eller hæmmet alle bakterierne, eller der kan være forekommet en mutation i et eller flere af bakteriens ’targets’, hvorved bakterien ikke længere kan genkendes af antibiotikummet. Herved bliver bakterien mere modstandsdygtig næste gang den bliver udsat for samme antibiotikum. Dette har ført til en stigende forekomst af resistente bakterier. Bakterier kan udvikle resistens over for flere forskellige typer antibiotika, hvilket kaldes multiresistens.

I dag kan vi i bagklogskabens lys se, at udtalelsen i 1967 var fejlagtig, idet det fortsat er nødvendigt at forske i måder, hvorpå vi kan bekæmpe bakterier, der enten allerede er blevet resistente over for antibiotika på markedet, eller hvor vores antibiotika ikke virker særlig godt. Vi er på udkig efter antibiotika, der gør det sværere for bakterien at blive resistent.

Netop her kommer antimikrobielle peptider (AMP’er) ind i billedet. Det er nemlig især AMP’ers virkningsmekanismer, der i de seneste år har ført dem ind i et forskningsmæssigt ”spotlight”. Disse små molekyler er en vigtig del af vores immunforsvar og har derved haft til opgave at bekæmpe bakterier i flere årtusinder! Der er på det seneste opstået en interesse for at undersøge, om AMP’er kan benyttes som lægemidler.

Men hvad gør AMP’er egentlig?

AMP’er er specielle, da de i modsætning til traditionelle antibiotika har flere forskellige virkningsmekanismer. AMP’er har nemlig mange forskellige ’targets’ på bakterier, som gør det svært for mikroorganismerne at blive resistente over for peptiderne. Hvis der forekommer en mutation i ét af AMP’ernes ’targets’, vil der stadig være processer, som AMP’er kan gå ind og ødelægge. Alle AMP’er har evnen til at binde sig til bakterielle cellemembraner og interagere med dem. De fleste AMP’ers primære virkningsmekanisme ligger i deres evne til at lave huller i cellemembraner, hvorved den gøres permeabel (gennemtrængelig) for forskellige molekyler, og der sker derfor et tab af livsvigtige ioner og andre cellulære komponenter (se figur 6). Dette resulterer i øjeblikkelig celledød. De fleste eksperimentelle studier med AMP’er fokuserer på deres membranødelæggende egenskaber, men nogle AMP’er har vist sig at kunne trænge gennem cellemembranen og ind i cellen, hvorved de også kan udøve en effekt på intracellulære områder. Disse AMP’er kan gå ind og påvirke dannelsen af cellevæggen, eller de kan påvirke DNA-syntesen. AMP’ers membranødelæggende effekt og brede spektrum af virkningsmekanismer gør det svært for bakterier at udvikle resistens over for dem. De fleste AMP’er har ligesom antibiotika kun en effekt på bakterieceller. Forskelle i prokaryote og eukaryote cellers overflade og deres biologiske cellemembran gør, at AMP’er kan skelne mellem de to typer af celler. Bakteriers cellemembran har en negativ ladning, mens den humane cellemembran oftest er neutral. Derudover er bakterier beskyttet af en ekstern cellevæg, der ligesom den bakterielle cellemembran er anionisk, dvs. negativt ladet. Tykkelsen af cellevæggen varierer fra bakteriecelle til bakteriecelle, hvilket resulterer i, at man kan inddele bakterier i de såkaldte Gram-positive og Gram-negative bakterier.

Den negative overflade, som bakterieceller har, er grunden til, at AMP’er kun har en effekt på bakterier. AMP’er er nemlig kationiske, altså de har en overordnet positiv ladning, og derfor vil de tiltrækkes af bakteriens negativt ladede overflade, hvorefter de kan udøve deres effekt.

Figur 6. Figuren illustrerer den negativt ladede bakterielle membranoverflade, som AMP’er, på det første billede, binder sig til. AMP’erne tiltrækkes den bakterielle cellemembran på grund af deres positive ladning og kan efterfølgende bore sig ned i membranen, hvilket resulterer i øjeblikkelig celledød.

Hvad er forklaringen bag virkningsmekanismen af antimikrobielle peptider?

I de seneste 20 år er mere end 1000 naturlige AMP’er blevet identificeret i forskellige organismer. AMP’er er meget forskellige i deres opbygning, struktur og længde, men fælles for AMP’er er, at de er små proteiner opbygget af mellem 10 og 80 aminosyrer, samt at de er bakteriocidale. Ligesom alle andre proteiner produceres de inde i vores celler ud fra generne kodet i vores DNA. Proteiner kan have mange forskellige destinationer i eller uden for cellen og for at guide dem hen til det rigtige sted, indeholder de fleste proteiner et signalpeptid. Signalpeptidet på AMP’er medfører, at de secerneres (udskilles) af cellen. Når de er blevet secerneret fra vores celler, kan de angribe patogene bakterier ved at binde sig til bakteriernes negativt ladede overflade. Det er sammensætningen af aminosyrer i AMP’er, der giver dem deres positive ladning. AMP’ers nettoladning varierer meget, idet den oftest ligger mellem 0 og +16, men de fleste aktive AMP’er har en ladning, der ligger nogenlunde midt i mellem disse to ydre værdier.

Antimikrobielle peptider er ikke bare lige kæder af aminosyrer. De folder sig sammen og får en tredimensionel struktur, som har betydning for, hvordan de binder til bakterier. Den tredimensionelle foldning er karakteristisk for proteiner generelt, idet de på denne måde opnår deres endelige funktionelle struktur. AMP’er kan groft inddeles i følgende grupper på baggrund af deres sekundære proteinstruktur:

1. α-helix AMP

2. Cystein-stabiliserede β-sheet AMP

3. AMP’er rige på specifikke aminosyrer

AMP’er kan bestå af en enkel af ovenstående strukturer, men også indeholde flere af disse. Som eksempel på forskellige strukturer af AMP’er kan nævnes de to overordnede grupper af AMP’er, der findes i mennesker. Disse er defensiner og cathelicidiner. Defensiner er kationiske peptider, der tilhører gruppen af cystein-stabiliserede β-sheet AMP’er, hvilket vil sige, at peptiderne indeholder aminosyren cystein, som kan lave disulfidbroer, der stabiliserer AMP’er (se figur 7). Cathelicidiner er også positivt ladede, men indeholder ingen disulfidbroer, og strukturen udgøres af en α-helix. Selvom der er forskel på den tredimensionelle struktur af AMP’er, har de det fællestræk, at de er amphipatiske. Dette betyder, at de polære aminosyrer er adskilt fra de upolære aminosyrer i kæden, og overordnet set vil AMP’er derfor bestå af en hydrofob og en hydrofil del. Omtrent 50 % af aminosyrerne er hydrofobe hos de fleste antimikrobielle peptider, og den hydrofobe del, samt adskillelsen af denne fra den hydrofile del af AMP’et, er essentiel for AMP’ers antimikrobielle effekt.

Figur 7. To cysteinenheder sammenkobles i en oxidationsreaktion, hvorved der dannes en disulfidbinding.

AMP’ers umiddelbare binding til cellemembraner sker gennem interaktioner mellem den kationiske del af AMP og den negativt ladede bakterielle cellemembran. Efter umiddelbar tiltrækning og binding af AMP’er til cellemembranen ophobes de for at kunne udøve deres effekt. Når der kun er få AMP’er til stede befinder de sig parallelt med cellemembranens overflade, og det ser ud som AMP’erne ligger på cellemembranen. Efterhånden som der tiltrækkes flere peptider til cellens overflade, vil de begynde at bore sig ned i cellemembranen. Peptiderne binder sig sammen og danner en transmembran (membrangennemborende) kanal. På denne måde skaber peptiderne et hul i cellemembranen. AMP’erne sætter sig sammen således, at peptidernes hydrofobe side vender ud mod cellemembranens hydrofobe fedtsyrer, mens deres hydrofile side vender ind mod de andre peptiders hydrofile side. Når der er et hul i cellemembranen kan hydrofile (polære) stoffer og ioner, der ellers ikke ville kunne passere cellemembranen, nu bevæge sig frit frem og tilbage gennem hullet, hvorved cellen dør.

Som det fremgår af ovenstående, er den hydrofobe del af AMP’er vigtig i ødelæggelsen af bakterielle cellemembraner. Dog kan det være et problem, hvis der er for mange hydrofobe aminosyrer i dem, da specificiteten over for bakterielle cellemembraner mindskes. Dette skyldes, at de hydrofobe regioner på peptidet tiltrækkes af hydrofobe regioner på eukaryote cellemembraner. Herved kan man risikere, at cellemembranerne hos de eukaryote celler vil blive ødelagt sammen med eller i stedet for de prokaryote cellemembraner hos bakterierne. Hvis de antimikrobielle peptider har denne effekt på humane celler, siges de at være toksiske over for mennesker. De fleste AMP’er i naturen er ikke hydrofobe nok til at udvise denne toksicitet over for mennesker og udviser kun eller næsten kun toksicitet over for bakterier.

Hvordan kan vi bruge antimikrobielle peptider som lægemidler? Det er vigtigt at forstå de molekylære mekanismer bag AMP’ers antibakterielle effekt for at kunne designe syntetiske AMP’er og derved bruge dem som lægemidler. Selvom der stadig er uklarhed omkring AMP’ers præcise virkningsmekanismer, hersker der ingen tvivl om, at en del af AMP’ers antibakterielle effekt ligger i deres interaktion med cellemembraner. Derudover har mange AMP’er vist sig at virke hæmmende på cellevægssyntese og celledeling, idet nogle AMP’er kan bevæge sig ind i cellen og påvirke intracellulære processer. Et eksempel på en AMP, der virker hæmmende på cellevægssyntesen er Plectasin.

Den stigende forekomst af resistente bakterier er hovedårsagen til vores interesse for AMP’er. Mange forsøg med AMP’er tyder på, at de kan være fordelagtige at anvende som antimikrobielle lægemidler i stedet for konventionelle antibiotika. Da AMP’er er specifikke over for en så fundamental del af cellen som dennes membran, er sandsynligheden for, at der udvikles resistens, minimal. Det ville kræve meget af bakterien, hvis den skulle til at ændre sin cellemembran og udvikle en resistensmekanisme til at bekæmpe AMP’ers membranødelæggende effekt. Derudover gør AMP’ers mange virkningsmekanismer det svært for mikroorganismer at blive resistente over for dem. Grunden til dette er, at hvis der forekommer en mutation i ét af AMP’ernes ’targets’, vil der stadig være andre processer, som AMP’er kan gå ind og ødelægge, hvilket forhindrer bakterien i at vokse. Idet de fleste AMP’ers primære virkningsmekanisme er gennemhulning af cellemembranen, siger man, at AMP’er er bakteriocidale frem for bakteriostatiske. På grund af deres amphipatiske natur binder de sig desuden effektivt til den bakterielle cellemembran, som hos både Gram-positive og Gram-negative bakterier er negativt ladet. Dog skal det nævnes, at forskellige AMP’er kan have meget forskellig aktivitet over for de to typer af bakterier. Nogle AMP’er udviser kun en effekt på Gram-positive bakterier, nogle udviser kun en effekt på Gram-negative bakterier og andre har en effekt på både Gram-positive bakterier og Gram-negative bakterier. I mange af de forsøg, der er blevet lavet med diverse AMP’er, viser det sig, at der ikke skal tilsættes særlig meget af peptidet for at dræbe bakterierne. Man siger, at AMP’er har en lav ”Minimal Bacteriocidal Concentration” (MBC).

Det tyder på, at AMP’er er de perfekte lægemidler, men hvorfor er de så ikke på markedet endnu? Processen, man skal igennem fra opdagelsen af et stof, der har potentiale til at blive et godt lægemiddel, til produktionen og indførelsen af dette på markedet, er mildt sagt lang og sej. Et potentielt lægemiddel skal igennem en lang række forsøg i laboratoriet før det må testes på mennesker i kliniske studier. Lægemiddeludviklingsprocessen er tidskrævende og dyr, og det tager i gennemsnit 14 år og koster 3 milliarder kroner at få et lægemiddel på markedet. Der forekommer mange forhindringer på vejen mod design af AMP’er som lægemidler, men den stigende forekomst af resistente bakterier skal bekæmpes på en eller anden måde. Flere AMP’er har også vist sig at være meget lovende.

Hvordan opdager man lægemidler ved en tilfældighed? Hele vores antibiotikahistorie startede med en tilfældig opdagelse, nemlig opdagelsen af penicillin. Det har siden hen ikke været en sjældenhed, at potentielle lægemidler er blevet opdaget ved en tilfældighed. I 2002 undersøgte en forsker fra Novozymes den lille sorte svamp Pseudoplectania Nigrella, idet han var på udkig efter enzymer med signalsekvenser, der transporterer enzymerne ud af cellen. Han benyttede sig af computerbaserede metoder til at undersøge gensekvenserne, han fandt fra svampen, og faldt pludselig over en lille DNA-sekvens, der i høj grad mindede om humane defensiner. Kunne dette være et AMP? Ja, det viste sig netop at være tilfældet. Det var ikke alene et AMP, det var tilmed et effektivt ét af slagsen. Forskeren lavede senere en undersøgelse af en sandorm, idet målet endnu engang var at finde enzymer, der nu skulle kunne bruges i vaskemiddel. Her blev det lille cystein-stabiliserede β-sheet AMP Arenicin 3 fundet, som viste sig at have en utrolig effekt på Gram-negative bakterier. Arenicin 3 har fået sit navn, fordi der tidligere er blevet fundet to AMP’er, Arenicin 1 og Arenicin 2, som det strukturelt set ligner meget. Disse to AMP’er havde vist sig at have en effekt på både Gram-positive og Gram-negative bakterier.

Er antimikrobielle peptider så fremtidens antibiotika? Dette spørgsmål kan du måske være med til at svare på? Forskningen inden for AMP’er er stadig en åben bog, og vi kan ikke gøre andet end at læse videre. Man vil selvfølgelig gerne sætte en stopper for den stigende fremkomst af resistente bakterier, men er det muligt at designe og producere tilstrækkelige antibiotika til at stoppe fremkomsten? Hvis resistensudvikling skal begrænses, kræver det, at man er restriktiv med brugen af antibiotika. Lægerne må kun udskrive recepter på antibiotika, når de er sikre på, at der er tale om en bakterieinfektion, og det er vigtigt, at man som patient nøje følger lægens vejledning og ikke stopper antibiotikabehandlingen for tidligt.