Fermenteringsprocessen – fra upstream til downstream

Denne underside udgør fjerde del af teorien for Biotech Academys materiale om Fermenteringsteknologi.

I industrien omtaler man fermenteringsprocessen som en proces, der som helhed er sammensat af to delprocesser, nemlig en upstream-proces og en downstream-proces (se figur 13):

• Upstream-processing er produktfremstilling, som er den første del af fermenteringsprocessen. Det er alle processerne inden og under fermenteringen, som sikrer, at produktet bliver fremstillet i en stor mængde.
• Downstream-processing er produktoprensning, som er den anden del af fermenteringsprocessen. Det er alle processerne efter fermenteringen, som sikrer, at produktet bliver oprenset med et stort udbytte – og evt. med en stor renhed.

Figur 13. Upstream-processing vs. downstream-processing. Upstream-processen er produktfremstillingen, hvilket omfatter celleudvikling, mediesammensætning, sterilisering og podning samt selve produktionen. Downstream-processen er produktoprensningen, hvilket omfatter en række af oprensningsprocesser.

Der er forskellige beslutninger forbundet med delprocesserne: Hvor upstream-processen fokuserer på at fremstille produktet, fokuserer downstream-processen på at oprense det. Eftersom forskellige produkter har meget forskellige egenskaber, kan én fremgangsmåde umuligt bruges som platform til produktion af alle produkter. For lavværdi-produkter som kemikalier er kriteriet for en succesrig fermenteringsproces kvantitet over kvalitet, og der prioriteres i rækkefølgen udbytte – produktivitet – produktkoncentration – og renhed. For højværdi-produkter som lægemidler er succeskriteriet helt omvendt, og produktets renhed prioriteres over dets udbytte. Upstream- og downstream-processerne vil derfor variere alt efter det ønskede produkt.

Upstream-processing: produktfremstilling

Celleudvikling

Celleudvikling er udtænkning og udvikling af den produktionsorganisme, der bruges til produktion af det ønskede produkt. Produktionsorganismen kan overordnet være enten en pro- eller eukaryot celle, hvilket er de to domæner af liv. Prokaryoter er encellede organismer uden cellekerne, mens eukaryoter er en- eller flercellede organismer, der indeholder en cellekerne sammen med andre celleorganeller.

Bakterier er prokaryote organismer, som er simple, billige og effektive producenter. Bakterier har høj vækstrate og høj produktivitet. Bakterierne Escherichia coli og Bacillus subtilis er de mest anvendte prokaryote produktionsorganismer, og de anvendes til produktion af organiske syrer, alkoholer og vitaminer. Et problem ved prokaryote organismer er, at de indimellem er for simple producenter i forhold til eukaryote organismer. I visse tilfælde vil man derfor vælge en eukaryot – fremfor en prokaryot – cellefabrik.

Gær er eukaryote organismer, der lever som enkeltcellede svampe. Gær er de mest simple eukaryote producenter – ligesom bakterier er de billige og effektive producenter. De vokser hurtigt men typisk med en lavere vækstrate end bakterier. Bagegæren Saccharomyces cerevisiae er den mest anvendte eukaryote produktionsorganisme, og den anvendes til produktion af alt fra ethanol til insulin. Tilsvarende er der skimmelsvampe, der lever som flercellede svampe. Skimmelsvampe gror som kæder af celler, der vokser og forgrener sig. Skimmelsvampe som Aspergillus oryzae og Aspergillus niger er ofte anvendt som producenter af industrielle enzymer og sekundære metabolitter.

Dyre- og planteceller er eukaryote organismer, som er de mest avancerede producenter. Dyre- og planteceller kan udføre sofistikerede modifikationer af proteiner, hvilket gør dem egnede til produktion af lægemidler. Heriblandt er pattedyrceller en vigtig kategori, fordi de minder om menneskeceller. Pattedyrceller er ofte afledt af hamstere, mus eller mennesker selv. Med cellernes kompleksitet følger der imidlertid udfordringer: de har lav vækstrate og lav produktivitet. Derudover har dyre- og planteceller ekstremt høje krav til temperatur, pH, tryk, luftning og omrøring i fermenteringstanken.

Medieformulering

Vækstmediet er den næringsopløsning, der anvendes til dyrkning af produktionsorganismen. Vækstmediet skal indeholde alle næringsstoffer, som er krævet for produktion af biomasse og produkt: Dvs. en energikilde, en kulstofkilde, en nitrogenkilde og andre næringsstoffer.

Vækstmediet kan være et defineret eller komplekst medie (se tabel 2). Et defineret medie fremstilles ved at tilsætte præcise mængder af organiske og/eller uorganiske kemikalier til destilleret vand. Fordi næringsstofferne og deres sammensætning er kendt, er mediet lavet til den organisme, som man ønsker at dyrke i sin fermentering. Et komplekst medie er sammensat af vand tilsat et vandopløseligt ekstrakt af mikrobielle produkter eller plante- eller dyremateriale, for eksempel af gærceller, sojabønner eller kødekstrakt. Da den nøjagtige sammensætning er ukendt, er mediet udefineret eller komplekst. Ekstrakterne skaber imidlertid et medie med nærings- og vækststoffer, som kan bruges til dyrkning af flere forskellige mikroorganismer.

Tabel 2. Oversigt over definerede og komplekse medier.

Downstream-processing: produktoprensning

Oprensningsprocesserne

Efter cellernes vækst og produktion i fermenteringstanken er substraterne i vækstmediet blevet omdannet til en fermenteringsvæske indeholdende en blanding af mange og alsidige, store og små molekyler. Oprensningsprocesserne er en række af oprensningstrin, hvor produktet først adskilles fra molekyler, som er meget forskelligt fra det selv, og sidst adskilles fra molekyler, som ligner det selv meget. Sammensætningen af oprensningsprocesserne varierer alt efter de fysiske og kemiske egenskaber af produktet samt den ønskede renhed af produktet.

De fire stadier for oprensningsprocesserne

Der er tre muligheder for det ønskede produkts tilstand: Produktet er cellerne (dvs. biomasse), produktet er inden i cellerne (et intracellulært produkt), eller produktet er uden for cellerne (et extracellulært produkt). Produktets tilstand er afgørende for, hvordan produktet adskilles fra affaldsprodukter. Der er overordnet fire stadier for oprensningsprocesserne, som hver indeholder en eller flere oprensningstrin (se figur 14):

Figur 14. Oversigt over stadierne for oprensningsprocesserne ved downstream-processing.

1. Adskillelse af cellemasse og fermenteringsvæske. Cellerne adskilles fra fermenteringsvæsken for enten at opsamle eller bortskaffe cellerne. Adskillelsen sker typisk ved metoder som filtrering, sedimentering og centrifugering, hvor molekyler adskilles ud fra deres størrelse, form og/eller densitet. Efter adskillelsen har man en slamfase med cellemasse samt en væskefase.

Hvis produktet er udenfor cellerne, udtrækkes det fra fermenteringsvæsken ved den efterfølgende produktisolering og -oprensning. Hvis produktet derimod er indeni cellerne, hvilket er tilfældet for en hel del enzymer og rekombinante proteiner, skal det udtrækkes fra cellemassen. Udtrækningen af produktet sker ved cellelysering, hvor cellernes membran sprænges for at frigive produktet. Celler er hårdføre overfor cellelysering, og derfor er det meget mere besværligt at oprense et intracellulært produkt end et ekstracellulært produkt.

2. Produktisolering. Produktet isoleres fra urenheder, der har meget anderledes egenskaber end produktet selv. Vand er typisk en af de vigtigste urenheder. Isoleringen sker ved metoder som udfældning og udtrækning, hvor molekyler adskilles ved hjælp af opløsningsmidler.

3. Produktoprensning. Produktet oprenses fra de resterende urenheder, der har lignende egenskaber som produktet selv. Oprensningen sker ved metoder som søjlekromatografi (se figur 15). Der er forskellige typer af kromatografi, men princippet bag dem er det samme: Materialet med det ønskede produkt (den mobile fase) føres igennem en søjle (den stationære fase), hvormed molekylerne adskilles ud fra deres størrelse, ladning, polaritet og/eller affinitet for søjlematerialet.

4. Færdiggørelse af produkt. Det nu oprensede produkt skal gøres klar til opbevaring. For at forbedre produktets holdbarhed behandles det ved metoder som frysetørring, varmetørring eller krystallisering.

Figur 15. Princippet bag søjlekromatografi. Ved søjlekromatografi føres en opløsning med det ønskede produkt gennem en søjle. Opløsningsmidlet betegnes som den mobile fase, og søjlematerialet betegnes som den stationære fase. Forskellige stoffer bevæger sig gennem søjlen med forskellig hastighed. Det er interaktionen mellem stofferne og den mobile fase, som afgør hastigheden, hvormed stofferne frigives fra den stationære fase. Inden prøven tilsættes, gøres søjlematerialet fugtigt ved at tilsætte en buffer. Efter prøven er tilsat, tilsættes der en elueringsbuffer, som gør, at prøven løber gennem søjlen. Prøven deles dermed i sine bestanddele, og man kan efterfølgende opsamle det ønskede protein.

Opsummering: samspillet mellem upstream- og downstream-processing

Udgifterne til downstream-processing udgør typisk den største udgift af produktionen. I princippet kan omkostningerne til oprensningsprocesserne variere fra så lavt som 15% af de samlede produktionsomkostninger til så højt som 90%. Der bruges gerne fem, ti eller flere oprensningstrin for at oprense et produkt – men for hvert oprensningstrin i downstream-processen, stiger omkostningerne af produktionen, mens udbyttet af produkt falder (se figur 16). Oprensningsprocesserne forudsætter nemlig sofistikerede midler og metoder, hvilket gør oprensningsprocesserne rigtigt omkostningsfulde.

Figur 16. Udbytte af produkt versus antallet af oprensningstrin for oprensningsprocesserne ved downstream-processing. Hvis der er 10 oprensningstrin, og udbyttet pr. trin er 99%, er det endelige udbytte 90% (jf. udregningen: 0,99¹⁰ = 0,90). Hvis der er 10 oprensningstrin, og udbyttet pr. trin derimod er 95%, er det endelige udbytte kun 60% (jf. udregningen 0,95¹⁰ = 0,60).

En vigtig tankegang, som man arbejder med i industrien, er ’starting with the end in mind’. Alle områderne for designet af fermenteringsprocessen – fra produktfremstilling til produktoprensning – er forbundet med hinanden. Fordi forbedring af et område kan være ufordelagtigt for et andet, bør man designe en gennemarbejdet fermenteringsproces, der er gennemtænkt fra start til slut. Det medfører ofte, at upstream-processen bør modificeres for at gøre downstream-processen mere ligetil.

Profit – økonomien bag fermentering

Det er udbyttet, der sammen med prisen på henholdsvis substratet, produktet og selve produktionen afgør profitten af fermenteringsprocessen. Produktionen omfatter alle omkostningerne af fermenteringsprocessen, herunder udgifter til kontorer, laboratorier og fabrikker; og arbejdskraft i form af ingeniører, laboranter og operatører. Den potentielle økonomiske profit af en fermentering er dermed en variabel, som er afhængig af sammensætningen af mediet (omkostning af upstream-processing), omsætningsprocessen i cellen (udbytte af produkt) og oprensningen af produktet (omkostning af downstream-processing):

En fermenteringsproces er økonomisk rentabel, hvis profitten er positiv – og omvendt er den dermed ikke økonomisk rentabel, hvis profitten er negativ. Prisen af substratet og produktet er styret af markedskræfter, og derfor kan profitten optimeres ved at enten (1) maksimere udbyttet, eller (2) minimere produktionsomkostningerne, dvs. udgifterne ved upstream- og særligt downstream-processing.

Det gælder derfor, at et lavværdi-produkt (f.eks. en organisk syre eller et industrielt enzym) kræver en billig upstream- og downstream-proces, for at fermenteringsprocessen er økonomisk rentabel. Eftersom et højværdi-produkt (f.eks. et antibiotisk stof eller et farmaceutisk peptid) typisk er så værdifuldt, gør det sig omvendt gældende, at produktionsomkostningerne til upstream- og især downstream-processerne kan være ganske dyre, mens fermenteringsprocessen stadig er økonomisk rentabel.