Vækst og produktion

Denne underside udgør anden del af teorien for Biotech Academys materiale om Fermenteringsteknologi.

Ved fermentering opereres der til dels med vækst af mikroorganismer og til dels med mikroorganismernes omsætning af substrat til produkt. Ved en mikroorganismes vækst menes der en forøgelse i cellestørrelse og den følgende celledeling – dvs. at vækst er en forøgelse af biomassen, den levende masse af celler.

Alle levende mikroorganismer er sammensat af seks grundstoffer: kulstof (C), hydrogen (H), oxygen (O), nitrogen (N), fosfor (P) og svovl (S). Grundstofferne bruges som byggesten i mikroorganismens stofskifte, til opbygningen og nedbrydningen af kulhydrater (indeholdende C, H, O), fedtstoffer (C, H, O), proteiner (C, H, O, N, S) og nukleotider (C, H, O, N, P) samt andre større og mindre cellekomponenter. Vand udgør som tommelfingerregel 70% af cellers vægt; tørstoffet udgør 30% af cellers vægt, og det er dét stof, som egentligt betegnes og medregnes som biomasse. Sammensætningen af biomasse for en typisk celle ses i figur 4.

Figur 4. Sammensætningen af biomasse for en celle. Cellens sammensætning er udgjort af proteiner, fedtstoffer, kulhydrater og nukleotider (DNA og RNA, herunder mRNA, rRNA, tRNA osv.) samt metabolitter.

Mangler der bare ét af disse grundstoffer, vil der ikke være vækst af mikroorganismen. I en fermentering er det derfor vigtigt, at mikroorganismerne befinder sig i et vækstmedie, som forsyner dem med de rette byggesten. Mikroorganismer som bakterie- og svampeceller har simple krav til næringsstoffer, mens det typisk er vanskeligere at sammensætte et vækstmedie for organismer som dyre- og planteceller.

Vækstmediets sammensætning

I et egnet vækstmedie omsætter mikroorganismerne substrater fra mediet til biomasse og produkter. Der skal overordnet være de følgende næringsstoffer i vækstmediet: en kulstofkilde, en energikilde, en nitrogenkilde og andre næringsstoffer – samt evt. ilt. Ilt er en forudsætning for vækst af aerobe mikroorganismer, der vokser med ilt; anaerobe organismer vokser uden ilt. Der er også mikroorganismer, som både kan vokse med og uden ilt – men deres stofskifte vil typisk være forskelligt under de to forhold.

Kulstof udgør den største del af mikroorganismers biomasse (~50%), hvilket indikerer vigtigheden af kulstofkilden. Kulstofkilden er typisk et kulhydrat, men det kan også være et fedtstof eller et protein. I mange fermenteringer er kulstofkilden som organisk stof også energikilde for mikroorganismen. Den mest almindelige kulstof- og energikilde er glukose. I enkelte fermenteringer er energikilden et andet stof end kulstofkilden, f.eks. for mikroorganismer som danner energi af lys eller uorganisk stof. Derudover er der nitrogen, som udgør den næststørste del af mikroorganismers biomasse (~10%). Nitrogenkilden kan være et organisk eller uorganisk stof. Af organiske nitrogenkilder er der aminosyrer, peptider og proteiner; af uorganiske nitrogenkilder er der gasser som dinitrogen og ammoniak og salte som ammoniumchlorid og ammoniumsulfat. Andre næringsstoffer er f.eks. mineraler som natrium, magnesium, kalium og calcium; det kan også være vitaminer og vækststoffer, som mikroorganismen ikke selv kan syntetisere, og som derfor skal tilsættes vækstmediet.

Mikroorganismers vækst og stofomsætning er afhængigt af en længere række vækstfaktorer – fra mikroorganismen genetik, metabolisme og overordnede biologi til fermenteringstankens vækstbetingelser, f.eks. vækstmediets sammensætning, temperatur, pH og iltkoncentration.

Modeller for vækst og produktion

Mikroorganismers vækst følger vækstmodellen (se figur 5). I vækstmodellen inddeles væksten i de følgende fire faser: nølefasen, den eksponentielle fase, den stationære fase og dødsfasen.

Figur 5. Model for mikroorganismers vækst, herunder deres produktion af biomasse (flere celler) og produkter. Der er fire faser: nølefasen, den eksponentielle fase, den stationære fase og dødsfasen. Vækstrelaterede produkter bliver produceret i den eksponentielle fase, mens ikke-vækstrelaterede produkter typisk bliver produceret i den stationære fase.

I nølefasen er cellerne lige blevet overført fra et brugt vækstmedie til et friskt, og de skal derfor vænne sig til de nye vækstbetingelser. Mikroorganismerne omstrukturer deres stofskifte, og de begynder at syntetisere cellekomponenter forbundet med vækst. Mikroorganismerne kan vokse i cellestørrelse, men de vil endnu ikke dele sig. Antallet af mikroorganismer vil dermed være konstant. Nølefasen kan vare kortere eller længere tid, afhængigt af cellernes tidligere vækstbetingelser. Det er derfor vigtigt at sikre, at vækstbetingelserne i fermenteringstanken og podetanken(e) ligner hinanden, for at cellerne bliver hurtigere klar til vækst og produktion. På denne måde optimerer man fermenteringsprocessen.

I den eksponentielle fase har cellerne vænnet sig til vækstbetingelserne, og de kan formere sig ved celledeling. Fordi én celle deler sig i to, er antallet af mikroorganismer eksponentielt stigende. Vækstraten ( ) betegner stigningen i celleantallet per tidsenhed ved startbetingelsen . Ud fra vækstraten kan man beregne generationstiden ( ), eller fordoblingstiden, der betegner den tid, det tager mikroorganismerne at fordoble sig i antal – dvs. tiden for at hver enkelt celle deler sig i to.

$N(t) = N_{0} \cdot e^{\mu \cdot t$

$g = \frac{ln(2)}{\mu}$

For eksempel har mikroorganismer som bakterien Escherichia coli en generationstid på 20 minutter, mens gærsvampen Saccharomyces cerevisiae har en generationstid på 90 minutter; andre typer af organismer som dyre- og planteceller har derimod generationstider på adskillige timer eller sågar døgn.

I den stationære fase er cellerne ikke længere i vækst. Det kan enten skyldes, (1) at mikroorganismerne har opbrugt næringsstofferne; (2) at der har ophobet sig affaldsstoffer i vækstmediet, som dræber mikroorganismerne eller hæmmer deres vækst; eller (3) at der simpelthen ikke er plads tilbage for mikroorganismerne til at dele sig yderligere. Der sker igen en omstrukturering af stofskiftet i mikroorganismerne, men de begynder nu at syntetisere cellekomponenter forbundet med overlevelse og stress. Antallet af mikroorganismer vil dermed være konstant, fordi antallet af nydannede celler er nogenlunde lig antallet af døende celler. Nogle af de mikroorganismer, der dør, vil sprænges ved cellelysering, hvormed deres nedbrydningsstoffer kan udnyttes som næringsstoffer af andre mikroorganismer, der stadig vokser.

I dødsfasen har cellerne ikke længere gode nok vækstbetingelser til at kunne opretholde de nødvendige livsprocesser. Det kan være mangel på næringsstoffer eller ophobning af affaldsstoffer, som dræber mikroorganismerne. Fordi antallet af døende celler overstiger antallet af nydannede celler, er antallet af mikroorganismer aftagende. Typisk er dødsraten i dødsfasen væsentligt lavere end vækstraten i den eksponentielle fase.

Ud fra vækstmodellen kan man forklare mikroorganismernes produktion af produkter. Hvis produktet er vækstrelateret som f.eks. en primær metabolit, produceres det sideløbende med mikroorganismernes vækst. I tilfælde hvor produktet er ikke-vækstrelateret som f.eks. en sekundær metabolit, produceres det typisk, idet mikroorganismerne skifter fra eksponentiel til stationær fase. Mange proteiner syntetiseres i den eksponentielle fase, og de betragtes derfor som vækstrelaterede produkter; enkelte proteiner syntetiseres i den stationære fase, og de skal betragtes som ikke-vækstrelaterede produkter.

Mængdeberegning for fermenteringsprocesser

Ved fermenteringsprocesser er det af stor økonomisk vigtighed, at man har en matematisk beskrivelse af cellernes vækst og stofomsætning. Mængdeberegning er læren om mængdeforhold, som bruges til at beskrive sammenhængen mellem reaktanter og produkter i en kemisk reaktion. Med mængdeberegning kan man opstille modeller, der besvarer spørgsmål som hvor stor en mængde af substrat bruger cellen på at producere det ønskede produkt? og hvor stor en mængde af substrat ’spilder’ cellen på produktionen af affaldsprodukter? For at man kan optimere fermenteringsprocesser, er det vigtigt, at man kan modellere dem.

Biokemien bag cellernes metabolisme er imidlertid ekstremt kompliceret. I hver enkelt af de mange celler i en fermenteringstank er der et metabolisk netværk af mange biokemiske reaktioner, der tilsammen konverterer substrater til biomasse og produkter. Derfor er det nødvendigt at opstille en forsimplet model, hvor alle biokemiske reaktioner i cellen bliver samlet i én overordnet reaktion:

kulstofkilde + energikilde + nitrogenkilde (+ O₂) → biomasse + produkter + CO₂

Dette er grundlaget for ’black box’-modellen (se figur 6). I denne model anvendes loven om massebevarelse, dvs. at massen af reaktanter er lig massen af produkter i en kemisk reaktion. For fermenteringsprocesser betyder det, at massen af substraterne, der kommer ind i en fermenteringstank, ultimativt kommer ud af fermenteringstanken igen, enten som biomasse, produkter eller CO₂ – et affaldsprodukt af cellernes metabolisme. Hvis man derfor har viden om indholdet af fermenteringstanken før og efter produktionen, men ikke undervejs – dvs. at man blot ved, hvad man lægger ind i tanken, og hvad man trækker ud af den igen – kan man opstille modelværdier for fermenteringsprocessen. Disse modelværdier betegnes koefficienter.

indgangsstoffer og udgangstoffer i fermentering

Figur 6. ’Black box’-modellen for cellers omsætning af substrater (S) til biomasse (flere celler) og produkter (P), herunder det ønskede produkt samt andre affaldsprodukter.

De tre koefficienter for fermenteringsprocesser

De tre vigtigste koefficienter for en fermenteringsproces er udbytte, produktivitet og produktkoncentration.

Udbytte er mængden af fremstillet produkt (P) relativt til mængden af forbrugt substrat (S):

$\textrm{udbytte} = \frac{\textrm{masse af produkt} }{ \textrm{masse af substrat} } = \frac{m_P}{m_S}$

En typisk enhed for udbytte er gram produkt pr. gram substrat ([g/g]). Udbytte er en vigtig koefficient for materialeomkostningerne. Udbyttet opgør effektiviteten af cellernes omsætning af substrat til produkt – dvs. reaktionsudbyttet. Derfor er udbytte en indikation for den økonomiske profit af fermenteringsprocessen. Udbyttet skal være tilstrækkeligt højt i forhold til værdiforskellen mellem produktet og substratet.

Eksempel på udregning af udbytte:

Hvis udbyttet for en fermenteringsproces er 0,5 g ethanol pr. g glukose, betyder det, at hvis man vil producere 10 g ethanol, da skal man bruge 20 g glukose i vækstmediet.

Produktivitet er en rate, der angiver koncentrationen af fremstillet produkt relativt til tiden:

$\textrm{produktivitet} = \frac{\textrm{masse af produkt} }{\textrm{volumen} \cdot \textrm{tid} } = \frac{m_P}{V \cdot t}$

Enheden for produktivitet vil typisk være gram produkt pr. liter pr. time ([g/L/h]). Produktivitet er vigtig, fordi det sikrer en effektiv produktion. Hvis man for eksempel vil producere en given mængde af produkt indenfor et givent tidsinterval, er produktiviteten en indikation for, hvor krævende produktionen er i forhold til mængden af fermenteringstank – dvs. en større produktivitet sikrer færre og/eller mindre fermenteringstanke.

Eksempel på udregning af produktivitet:

En producent ønsker at producere 20.000 ton ethanol pr. år. Producenten har ti fermenteringstanke af 100.000 L, der kan køre 24 timer i døgnet, 300 dage om året. De resterende dage er ’downtime’ mellem fermenteringerne, hvor fermenteringstankene rengøres og klargøres til endnu en kørsel.

$\frac{20.000 \cdot 10^6 g}{(10 \cdot 100.000 L) \cdot (24 t \cdot 300)} = 2.78 \frac{g}{L \cdot t}$

Den påkrævede produktivitet af ethanol for fermenteringsprocessen er derfor 2,78 g/(L∙t) – gram per liter per time.

Produktivitet er forbundet med produktkoncentrationen (se figur 7). Produktkoncentration er mængden af fremstillet produkt relativt til volumenet af fermenteringsvæske:

$\textrm{produktkoncentration} = \frac{\textrm{masse af produkt} }{\textrm{volumen} } = \frac{m_P}{V}$

En typisk enhed for produktkoncentrationen er gram produkt pr. liter ([g/L]). Produktkoncentration er en vigtig koefficient for oprensningsomkostningerne. Hvis produktkoncentrationen er høj, er det billigere at udtrække og oprense produktet fra fermenteringsvæsken i en tilstrækkelig mængde, end hvis produktkoncentration er lav. Derfor er produktkoncentration en indikation for den økonomiske udgift af fermenteringsprocessen.

Eksempel på udregning af produktkoncentration:

Hvis produktkoncentrationen for en fermenteringsproces er 10 g/L ethanol, betyder det, at hvis man vil producere 1 ton = 1.000.000 g ethanol, da skal man bruge 100.000 liter produktionskapacitet – f.eks. ved brug af én 100.000-liters fermenteringstank eller fem 20.000-liters fermenteringstanke.