Cellefabrikker

Denne underside udgør tredje del af teorien for Biotech Academys materiale om Fermenteringsteknologi.

Mikroorganismer er producenterne bag et utal af produkter, som har en potentiel unik værdi i en industriel, sundhedsmæssig og/eller miljømæssig sammenhæng. Livet på Jorden har eksisteret i 4,5 milliarder år, og det har derfor millioner af års evolution bag sig. Mikroorganismerne er tilpasset de habitater, som de lever i, og de koloniserer mange og alsidige levesteder – fra iskolde Arktis til glohede Sahara. For at facilitere deres overlevelse i naturen producerer jordens store og små organismer tilsammen et sammensurium af proteiner og metabolitter, der er brugbare for mennesker – her er der nogle eksempler:

• Botulinumtoksin (bakterien Clostridium botulinum): et giftigt protein der bruges ved botox-behandlinger.
• Stevia (planten Stevia rebaudiana): et sødemiddel der bruges som nulkalorie-erstatning til sukker.
• Psilocybin (svampen Psilocybe azurescens): et psykedelisk stof der potentielt kan bruges som medicin mod depression.

En prøve fra jorden eller havet indeholder flere millioner forskellige mikroorganismer, og hver mikroorganisme producerer hundrede eller tusinde forskellige produkter. Mikroorganismer mestrer dermed evnerne til at syntetisere produkter. Ved fermentering bliver mikroorganismer – og deres produktionsevner – overført fra den naturlige niche (naturen) til en industriel niche (fermenteringstanken), hvor de anvendes til produktion af alt fra kemikalier og proteiner til lægemidler.

Celler som produktionsorganismer

En cellefabrik er en mikroorganisme, der er optimeret til at producere et ønsket produkt. Cellefabrikken er overordnet enten en naturlig producent eller en gensplejset (ikke-naturlig) producent.

En naturlig producent er en produktionsorganisme, der naturligt producerer det ønskede produkt. Gær er en naturlig cellefabrik, som bruges til at fremstille øl, brød og biobrændsel. Fordelen ved en naturlig producent er, at den allerede har evnerne til at producere det ønskede produkt – og at den ofte er rigtigt dygtig til at producere det! Ulempen er, at den naturlige producent typisk er tilpasset til at leve, vokse og producere det ønskede produkt i naturen – ikke i en fermenteringstank. Derfor kan det være udfordrende at sikre en tilstrækkelig produktivitet, hvis det er den naturlige producent, som anvendes til produktion af produktet.

En gensplejset producent er en produktionsorganisme, som har fået indsat et eller flere gener, der gør, at den producerer det ønskede produkt. Det sker ved gensplejsning, som er overførslen af DNA-materiale fra én organisme til en anden (se figur 8). På denne måde kan gær bruges som en naturlig cellefabrik ved ølbrygning, men den kan også bruges som en gensplejset cellefabrik ved insulinproduktion. Hvis man har en produktionsorganisme, der er tilpasset forholdene i en fermenteringstank, er det fordelagtigt, fordi den gang på gang kan gensplejses for at producere et ønsket produkt. Dermed kan den samme produktionsorganisme anvendes til produktion af flere forskellige produkter.

Figur 8. Princippet bag gensplejsning. Ved gensplejsning bruges en donor, en vært og en vektor: donoren er den organisme, som leverer det pågældende gen, værten er den organisme, som modtager det pågældende gen, og vektoren er den bærer, der bringer donor-DNA til værtscellen. Vektoren er typisk et plasmid, dvs. et lille, cirkulært DNA-molekyle. Donor-DNA og plasmid klippes med et restriktionsenzym, hvorefter de klistres sammen igen med DNA-ligaser. Ved transformation overføres vektoren, og dermed genet, til værtscellen.

Der er en længere række mikroorganismer, som man har god erfaring med at bruge til forskning, udvikling og industriel produktion – f.eks. bakterien Escherichia coli og gærsvampen Saccharomyces cerevisiae. Sådanne mikroorganismer kalder man modelorganismer. I tabel 1 er der en oversigt over de ønskede egenskaber for en mikroorganisme, der gør den egnet som cellefabrik.

Tabel 1. Oversigt over de ønskede egenskaber for en cellefabrik.

Optimering af cellefabrikker

Cellefabrikker er industrielt vigtige mikroorganismer. I en fermentering manipuleres der med cellefabrikken for at optimere cellernes vækst og omsætning af substrat til produkt. Manipulationen kan være enten indirekte, hvor man ændrer cellernes fysiske omgivelser (procesændring), eller direkte, hvor man ændrer cellernes DNA-materiale (biologisk ændring). En procesændring vil for eksempel være en ændring i mediesammensætningen eller vækstbetingelserne for cellerne (f.eks. temperatur, pH og iltkoncentration). En biologisk ændring vil omvendt være, at man foretager en eller flere genetiske (og dermed metaboliske) ændringer i cellen for at optimere cellefabrikkens egenskaber.

I fermenteringsindustrien er det afgørende, at man løbende optimerer de anvendte mikroorganismer. Procesændringer er billigere, simplere og hurtigere end biologiske ændringer – men biologiske ændringer er ofte meget mere effektive end procesændringer. For at optimere produktionen af et ønsket produkt i en cellefabrik er det dermed nødvendigt at redigere, indsætte og/eller fjerne DNA for at frembringe biologiske ændringer i cellen, som forbedrer cellefabrikkens omsætning fra substrat til produkt.

Strategier til optimering af cellefabrikker

Cellens DNA-materiale indeholder ’instruktionerne’ til, hvilke proteiner cellen skal producere, og det er samspillet mellem disse proteiner, som afgør cellens metabolisme. Hvis man har en grundig forståelse for cellens metabolisme, er det muligt at forudsige hvilke instrukser, der kan ændres, for at cellens metabolisme dirigeres i retning af dannelsen af det ønskede produkt. På denne måde kan man regulere cellens gener og derved de tilsvarende proteinmængder, eller man kan overføre nye gener for at skabe helt nye ’instruktioner’ i cellen. Denne fremgangsmåde til at optimere cellefabrikker betegnes som genetic and metabolic engineering.

Strategierne til optimering af cellefabrikker afhænger af det produkt, som man ønsker, at cellerne producerer i store mængder. Det ønskede produkt er overordnet enten et protein (f.eks. et industrielt enzym eller et farmaceutisk peptid) eller en metabolit (f.eks. en organisk syre eller et antibiotisk stof).

Optimering af cellers produktion af proteiner

Proteiner er genprodukter, som syntetiseres under DNA-ekspression i cellen – eller som det er formuleret i det centrale dogme: DNA koder for RNA, der koder for protein (se figur 9 og vores videoer om det centrale dogme). For at producere et protein i en cellefabrik, skal man derfor indføre et eller flere gener, som koder for det ønskede protein.

Figur 9. Det centrale dogme. DNA oversættes til mRNA ved transskription, hvorefter mRNA oversættes til protein ved translation. Derudover kan DNA kopieres til mere DNA ved replikation.

I figur 10 ses syntesen for dannelsen af et protein. For at optimere cellefabrikkens produktivitet kan man op- og nedregulere de genetiske og metaboliske moduler, som har betydning for ekspressionen af proteinet. Der er flere forskellige strategier for optimering af proteinsyntesen:

1. Overekspression af proteinet. Jo flere kopier af det proteinkodende gen, der er i cellens genom, desto flere proteiner syntetiserer cellen typisk ud fra det. Ved at indføre kopier af genet, som koder for det ønskede protein, kan man derfor optimere produktionen af proteinet.
2. Optimering af transskription. En promoter er den basesekvens, som RNA-polymerasen binder sig til for at igangsætte transskription. Hastigheden for omsætningen fra DNA til mRNA kan forbedres ved at optimere genets promotor, som regulerer RNA-polymerasens transskription af genet.
3. Ekspression vha. transskriptionsfaktorer. Transskriptionsfaktorer er proteiner, der binder sig til DNA-sekvenser for dermed at kontrollere hastigheden for transskription. Induktion giver en øget produktion af mRNA, repression en nedsat produktion af mRNA. På denne måde kan transskriptionsfaktorer bruges til at kontrollere og optimere produktionen af proteinet.
4. Optimering af translation. Et ribosombindingssted (RBS) er den basesekvens, som ribosomerne binder sig til for at igangsætte translation. Hastigheden for omsætningen fra mRNA til protein kan forbedres ved at optimere mRNA-sekvensens RBS, som regulerer ribosomernes translation af genet.
5. Codon-optimering. Et codon er en serie af tre nukleotider, der koder for én aminosyre. Forskellige organismer foretrækker forskellige codons, selvom de koder for den samme aminosyre. Ved at udskifte mindre foretrukne codons med mere foretrukne codons, kan man forbedre hastigheden for proteinsyntesen.
6. Opregulering af chaperoner. Chaperoner er enzymer, som hjælper cellen med at folde proteiner præcist og med en hensigtsmæssig hastighed. Som regel bidrager chaperoner positivt til ekspressionen af protein.
7. Nedregulering af proteaser. Proteaser er enzymer, som nedbryder proteiner ved at spalte proteinernes peptidbindinger. Som regel bidrager proteaser derfor negativt til ekspressionen af et protein.

Figur 10. Strategier til optimering af cellefabrikkers produktion af proteiner: (1) overekspression af proteinet, (2) optimering af transskription, (3) ekspression vha. transskriptionsfaktorer, (4) optimering af translation, (5) codon-optimering, (6) opregulering af chaperoner og (7) nedregulering af proteaser.

Optimering af cellers produktion af metabolitter

Metabolitter er produkter af cellens metabolisme, som fremstilles og forbruges ved reaktionerne i cellen. For at producere en metabolit i en cellefabrik, skal man derfor kode for en eller flere enzymer, som katalyserer reaktionerne i syntesevejen for den ønskede metabolit.

I figur 11 ses en syntesevej for omdannelsen af substrat (S) til et produkt (P), som her er en metabolit. Omdannelsen sker ved hjælp af en række mellemprodukter (X), hvor hver af de enzymatiske reaktioner er katalyseret af hvert sit enzym (E). For at optimere cellefabrikkens stofomsætning skal man optimere metabolittens egen syntesevej. Der er (igen) flere forskellige strategier for optimering af metabolittens syntesevej:

1. Berigelse med substrater. Hastigheden for omsætningen fra substrat til produkt kan optimeres ved at berige vækstmediet, dvs. forøge mængden af substrater. Dette sikrer, at mellemprodukterne i metabolittens syntesevej ikke er begrænsende for produktionen af metabolitten.
2. Overekspression af enzymerne i metabolittens syntesevej. Hastigheden for omsætningen fra substrat til produkt kan optimeres ved at forøge ekspression af en eller flere enzymer i metabolittens syntesevej. Tilsvarende kan man forsøge at optimere cellens stofomsætning ved at forøge enzymaktiviteterne.
3. Overekspression af transportører. Transportører er membranproteiner, der transporterer stoffer ind og ud af cellen. Ophobning af metabolit i cellen kan forhindre dannelsen af produkt. Ved at indføre transportører i cellens membran, kan man forbedre hastigheden for metabolittens syntesevej.

Efter man har optimeret metabolittens egen syntesevej, skal man sikre, at der ikke er andre synteseveje, som forringer cellefabrikkens stofomsætning. Cellens biprodukter konkurrerer nemlig med produktet om tilgængeligheden af substrat. Man kan optimere metabolittens syntesevej ved at fjerne aktiviteter, der konkurrerer med metabolittens syntesevej. På denne måde forhindrer man cellen i at bruge ressourcer på biprodukter, som ikke har en værdi for fermenteringsprocessen. Der er de følgende strategier:

4. Fjernelse af forgreninger af metabolittens syntesevej. Hvis der er unødvendige forgreninger af metabolittens syntesevej, kan man fjerne forgreningerne for at optimere produktionen af metabolitten.
5. Fjernelse af biprodukter. Hvis der tilsvarende er unødvendige synteseveje, hvor substrat bliver omsat til biprodukter fremfor det ønskede produkt, kan man fjerne syntesevejene for at optimere produktionen af metabolitten.

Figur 11. Strategier til optimering af cellefabrikkers produktion af metabolitter: (1) berigelse med substrater, (2) overekspression af enzymerne i metabolittens syntesevej, (3) overekspression af transportører, (4) fjernelse af forgreninger i metabolittens syntesevej, og (5) fjernelse af biprodukter.

Den cykliske proces for optimering af cellefabrikker

Optimering af cellefabrikker kan opfattes som en cyklisk proces med flere forskellige faser (se figur 12).

Figur 12. Faserne for udtænkning og udvikling af en cellefabrik: design, konstruktion, testning og læring.

I designfasen planlægges de nødvendige modifikationer, som skal indføres i cellefabrikken for at udvikle cellerne mod en forbedret proces eller et forbedret produkt. I konstruktionsfasen indføres de nødvendige modifikationer i cellefabrikken ved at redigere, indsætte og/eller fjerne DNA for at skabe de genetiske og metaboliske ændringer i cellerne, som f.eks. forbedrer cellens omsætning fra substrat til produkt. I testfasen afprøves cellefabrikkens evne til at producere det ønskede produkt sammen med dens overordnede opførsel som følge af de indførte modifikationer i cellefabrikken. I evalueringsfasen vurderes cellefabrikkens evne til at producere det ønskede produkt – dvs. har de indførte modifikationer haft den hensigtsmæssige effekt, eller er der uhensigtsmæssige sideeffekter, som skal korrigeres ved yderligere celleoptimering? Eftersom optimering af en cellefabrik er en cyklisk proces, kan den starte og slutte ved alle faserne, og den kan gentages igen og igen over tid for at optimere cellerne mod en mere og mere effektiv fermenteringsproces.