Fermenteringstank og – udstyr

Denne underside udgør femte del af teorien for Biotech Academys materiale om Fermenteringsteknologi.

Fermentering udføres i en fermenteringstank, også betegnet en bioreaktor eller en fermentor. Fermenteringstanken er en særlig beholder, som er konstrueret til at understøtte væksten af høje koncentrationer af mikroorganismer. På denne måde er fermenteringstanken omdrejningspunktet for alle kemiske processer, hvor man bruger levende celler til at omsætte substrat til produkt. Fermenteringstanken skal være forsynet med udstyr, der gør den i stand til at understøtte de optimale forhold for mikroorganismernes vækst og produktion af det ønskede produkt. I laboratoriet anvender man fermenteringstanke i størrelsesordener fra 1 til 10 L, hvorimod man i industrien har tanke, som kan holde volumener af 10.000-1.000.000 L (se figur 17).

Figur 17. Opskalering af en fermenteringsproces.

Fermenteringstanken har flere forskellige formål. Vigtigst er det, at fermenteringstanken sørger for, at produktionsorganismen kan vokse og producere det ønskede produkt i et sterilt miljø, hvor der ikke er kontaminering – dvs. vækst af fremmede mikroorganismer, der kan ødelægge fermenteringen. Arbejdsgangen med fermenteringen skal være hygiejnisk og steril, hvis der er noget, der skal ind eller ud af fermenteringstanken.

Derudover er det vigtigt, at fermenteringstanken sørger for, at produktionsorganismen er sammenblandet med vækstmediet, og at vækstbetingelserne for produktionsorganismen som temperatur og pH er under kontrol. Derfor skal der være konstant luftning og omrøring i fermenteringstanken. Luften kan være f.eks. dioxygen (O₂), carbondioxid (CO₂) eller dinitrogen (N₂). Fermenteringstankens temperatur kontrollerer man ved at opvarme eller nedkøle vækstmediet. Fermenteringstankens pH kontrollerer man ved at tilføre syre eller base til vækstmediet: Hvis pH er for lav, kan der tilføres base, f.eks. natriumhydroxid (NaOH), og hvis pH omvendt er for høj, kan der tilføres syre, f.eks. saltsyre (HCl).

Fermenteringstankens udstyr

Fermenteringstanken har som konstruktion været under udvikling i mere end en menneskealder. Der er imidlertid kun meget lidt standardisering – fermenteringstanken og dens udstyr findes i flere forskellige udformninger. Den mest almindelige type af fermenteringstank er en STR (stirred tank reactor). Her er selve fermenteringstanken en cylindrisk beholder med et 3:1 højde/breddeforhold. Luftning sker i bunden af fermenteringstanken, mens omrøring sker gennem en rotor tilsluttet en motor i toppen af fermenteringstanken.

Der kan opstilles de følgende krav til fermenteringstanken og dens udstyr (se figur 18):

• Tanken skal være i stand til at blive steriliseret, og den skal kunne vedligeholde et sterilt miljø over tid.
• Den skal være udstyret med en luftfordeler – dette sikrer luftning i fermenteringstanken.
• Den skal være udstyret med en omrører – dette sikrer omrøring i fermenteringstanken.
• Den skal være udstyret en strømbryder – dette sikrer en turbulent strømning i fermenteringstanken, så vækstmediet bliver blandet sammen fremfor at blive rørt rundt og rundt i tanken uden sammenblanding.
• Den skal være udstyret med en varmekappe – dette sikrer, at fermenteringstanken holdes ved en konstant temperatur under fermenteringen.
• Den skal være udstyret med en prøvetagningssprøjte, hvor der kan tages prøver af indholdet i fermenteringstanken.
• Den skal være udstyret med en eller flere prober for måling og kontrol af fermenteringsprocessen – f.eks. en temperaturprobe, en pH-probe og en DO-probe som overvåger hhv. vækstmediets temperatur, pH og iltkoncentration. Proberne skal være forbundet med reguleringssystemer, der vedligeholder de rette vækstbetingelser for produktionsorganismens vækst og produktivitet.

Tanken skal derudover sikre, at produktionen og de tilhørende processer er driftssikre, i overensstemmelse med lov- og miljøkrav.

Figur 18. En fermenteringstank og dens udstyr.

Fermenteringstankens opsætning

Man inddeler fermenteringsprocesser i batch-, kontinuerlig og fed-batchfermentering, afhængigt af opsætningen for tilsætning af substrater og udtrækning af produkter til og fra fermenteringstanken (se figur 18).

Batchfermentering er den mest simple form for opsætning. En batch-bioreaktor er et lukket system, hvor vækstmediet podes med mikroorganismen ved fermenteringens start. Der er intet tilløb eller afløb til/fra fermenteringstanken, og derfor er volumenet af fermenteringstanken konstant. Fermenteringen er slut efter et passende tidsinterval, hvis næringsstofferne er opbrugt, eller hvis affaldsstoffer har ophobet sig. Fordi den mikrobielle vækst i en batchfermentering følger vækstfaserne med eksponentiel og stationær vækst, er denne opsætning egnet til produktion af alt fra vækstrelaterede produkter som primære metabolitter til ikke-vækstrelaterede produkter som sekundære metabolitter.

Kontinuerlig fermentering anvender en lidt mere indviklet form for opsætning. Her pumpes der friskt vækstmedie til bioreaktoren samtidig med, at der pumpes brugt fermenteringsvæske fra bioreaktoren. En kontinuerlig bioreaktor er dermed et åbent system: Der er et konstant input og output i fermenteringstanken. Eftersom raten for input er lig raten for output, forbliver volumenet i fermenteringstanken konstant. Samtidig har cellerne en konstant vækstrate, hvilket opretholder den eksponentielle vækst i fermenteringstanken. I teorien kan en kontinuerlige fermentering forløbe i uendelighed – i praksis er den typisk begrænset af kontaminering og/eller mutationer i cellekulturen.

Fed-batchfermentering er en mellemting af opsætningerne for batchfermentering og kontinuerlig fermentering. En fed-batch-bioreaktor er et åbent system, hvor der tilsættes ekstra vækstmedie under fermenteringen. Der er et tilløb til men intet afløb fra fermenteringstanken, og derfor er volumenet af fermenteringstanken voksende. Ligesom ved batchfermentering podes vækstmediet med mikroorganismen ved fermenteringens start – nu er det blot en halvfyldt bioreaktor. Fermenteringen er slut, når bioreaktoren er fyldt af vækstmedie. Ved at anvende forskellige strategier for tilsætningen af vækstmedie kan den mikrobielle vækst i en fed-batchfermentering tvinges til at følge forskellige vækstfaser. Det sikrer en kontrolleret produktion – hvad enten produkterne er vækstrelaterede eller ikke-vækstrelaterede.

Der er fordele og ulemper ved alle opsætningerne, og valget afhænger typisk af produktet sammen med de muligheder og begrænsninger, der er ved produktionen og de tilhørende processer. Batch og fed-batchfermentering er de mest anvendte former for opsætning til industriel produktion, mens kontinuerlig fermentering hovedsageligt anvendes til forskning og udvikling.

Figur 18. De tre opsætninger af en fermenteringstank: Batchfermentering (intet input og intet output); kontinuerlig fermentering (input og output); og fed-batchfermentering (input men intet ouput).

Måling og kontrol af fermenteringstanken

Eftersom forskellige mikroorganismer har forskellige behov for optimal vækst og produktivitet, skal parametrene for fermenteringen måles og kontrolleres for at sikre en optimal fermenteringsproces. Der er tre typer af variable, som kan overvåges i fermenteringstanken:

• Fysiske variable som temperatur, tryk, viskositet, luftnings- og omrøringshastighed samt strømningshastighed for tilløb af friskt næringsmedie og/eller afløb af brugt næringsmedie.
• Kemiske variable som pH og koncentrationen af O₂, CO₂ og N₂.
• Biologiske variable som koncentrationen af celler, substrater, metabolitter og produkter.

Alle tre typer af variable er afhængige af hinanden, og i nogle tilfælde er biologiske variable afledt af kemiske variable. Generelt er de vigtigste variable at overvåge temperatur, pH og cellekoncentration, der tilsammen giver en indikation for cellernes vækst, og hvor effektivt cellerne omsætter substrat til produkt.

Der er overordnet tre former for målinger, som man kan foretage i fermenteringstanken, nemlig off-line, at-line og on-line. Off-line målinger involverer prøvetagning, prøveoverførsel til laboratoriet efterfulgt af prøvemålinger ved hjælp af laboratorieanalyser. At-line målinger involverer også prøvetagning, men i dette tilfælde bliver prøven analyseret tæt på processen for at minimere tidsforsinkelsen. Analysemetoden er typisk mindre sofistikeret og mere fejlsikker, hvormed prøvemålingerne kan udføres af operatører og ikke kun af laboranter. On-line målinger er teknikker, som er direkte forbundet til processen. Der er typisk ingen prøvetagning involveret; målingerne bliver foretaget real-time; her og nu. Det sikrer, at der er en minimal tidsforsinkelse, fra at processen bliver målt, og der bliver registret en fejl (f.eks. for høj temperatur, eller for lav pH-værdi) til at processen bliver kontrolleret, og der bliver korrigeret for fejlen (f.eks. ved at tilføre ekstra nedkøling, eller ved at tilføje ekstra base).

Et eksempel på forskellen mellem de forskellige typer målinger er ved måling af biomasse. Man kan tage en prøve for analysere celleantallet ved at dyrke cellerne på agarplader i laboratoriet (off-line måling); man kan tage en prøve for at analysere celletætheden ved at måle absorption i et spektrofotometer (at-line måling); og sidst kan man f.eks. måle CO₂-udviklingen direkte i fermenteringstanken (on-line måling).

Udfordringerne i fermenteringstanken

I fermenteringstanken er det muligt at måle og overvåge cellernes vækst og produktivitet under fermenteringsprocessen for at sikre en nøje kontrolleret produktion af det ønskede produkt. Den ideelle og optimale fermenteringstank opretholder et homogent miljø, hvor cellerne er helt sammenblandet med de øvrige fermenteringskomponenter. I virkeligheden er miljøet i fermenteringstanken dog heterogent – der er forskel på forholdene for fermenteringen alt efter, hvor man måler i tanken, og hvornår man måler i tanken.

For eksempel er trykket større i bunden af fermenteringstanken end i toppen grundet den enorme masse af vand; og der er flere substrater og færre produkter i fermenteringstanken ved starten af fermenteringen end ved slutningen. I en fermentering sker der samtidig store forandringer indeni fermenteringstanken. Under cellernes vækst og omsætning af substrat til produkt bliver der frigivet varme ved stofskifteprocesserne, og samtidig sker der typisk en ophobning af affaldsstoffer som organiske syrer og alkoholer. Det resulterer i fermenteringszoner, hvor der er f.eks. ekstremt høje temperaturer eller lave pH-værdier – eller ekstremt forhøjede eller formindskede koncentrationer af nærings- og affaldsstoffer. Disse zoner er uundgåelige i fermenteringstanke i størrelsesordner af ti- eller hundredetusinde liter. Imidlertid leder det til problemer, fordi der er risiko for, at cellerne har begrænset eller hæmmet vækst og stofomsætning.

Den måske vigtigste pointe i dette undervisningsmateriale er, at fermenteringsteknologi indeholder lige dele bioteknologi og procesteknologi. Cellefabrikken er det biologiske system, som vi kan optimere ved hjælp af bioteknologisk viden ved at (re-)programmere cellens genetik og metabolisme til en optimeret omsætning af substrat til produkt. Fermenteringstanken er derimod det mekaniske system, som kan optimeres ved hjælp af procesteknologisk viden for at sikre, at cellerne har de mest optimale forudsætninger for at vokse og producere det ønskede produkt. Det er derfor vigtigt at have cellefabrikken og fermenteringstanken med i overvejelserne, idet man opstiller en fermenteringsproces.