CRISPR/Cas9 – Den Genteknologiske Revolution

Resume: CRISPR-teknologien stammer fra prokaryoters immunforsvar, hvor det eksempelvis fungerer som beskyttelse imod virusangreb. CRISPR er en forkortelse af Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, hvilket beskriver den genomiske struktur af det prokaryote immunforsvar. CRISPR associerede (Cas) proteiner er immunsystemets funktionelle enheder. Den mest anvendte type Cas9 indenfor genteknologi stammer fra bakterien Streptococcus pyogenes.

 

Alt, der kan defineres som liv, har en enestående ting tilfælles. Alle de informationer, der danner de enkelte organismer, er kemisk lagret i et makromolekyle, som fungerer på den samme grundlæggende måde i mennesket og alle andre organismer. DNA er dét molekyle, der udgør vores genetiske informationer igennem sin genetiske kode. Det har en enorm betydning, at livet deler grundlagene for denne genetiske kode, da det betyder, at det er muligt at tage informationer fra én organisme og bruge dem i anden. Gensplejsning gør det muligt at flytte rundt på gener og styre deres aktivitet, hvormed vi faktisk kan kontrollere livets udformning. Genteknologi kan bruges til at skabe uanede mængder af genetiske kombinationer, der eksempelvis kan give os bedre fødevarer, ændre organsimers egenskaber, bruges til produktion af medicin eller ligefrem kurere sygdomme. Det er kun fantasien og teknologien, der sætter grænser for mulighederne – heldigvis er teknologien kommet langt!

En af de nyeste teknologier er CRISPR/Cas9, der har et stort potentiale, fordi det giver muligheden for at kunne klippe i DNA med enorm præcision og effektivitet, på en lettere og billigere måde. Denne teknologi er baseret på ét protein, kaldet Cas9. Proteinet er styret af et stykke RNA, kaldet guide RNA (gRNA), som giver proteinet dets egenskab til at nøjagtigt identificere DNA-sekvenser, binde sig til dem og klippe dem over, ved at danne præcise dobbeltstrengsbrud i DNA. Grunden til, at Cas9 har så stort potentiale er, at proteinet let kan omprogrammeres til at ramme nye DNA-sekvenser ved udskiftning af dét gRNA, der styrer proteinet. Cas9’s nøjagtige dannelse af dobbeltstrengsbrud tillader eksempelvis indsættelse af DNA-sekvenser i helt bestemte positioner, hvormed man kan opnå nye genfunktioner. Man kan også danne mutationer, der kan deaktivere specifikke gener og dermed fjerne specifikke egenskaber fra organismer.

CRISPR-teknologien stammer fra prokaryoters immunforsvar, hvor det eksempelvis fungerer som beskyttelse imod virusangreb. CRISPR er en forkortelse af Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, hvilket beskriver den genomiske struktur af det prokaryote immunforsvar. CRISPR associerede (Cas) proteiner er immunsystemets funktionelle enheder. Den mest anvendte type Cas9 indenfor genteknologi stammer fra bakterien Streptococcus pyogenes.

CRISPR/Cas9 er et pragteksemplar på et bioteknologisk værktøj, der er udviklet fra naturens egne funktionsmekanismer.

Grundteorien vil give en god grundlæggende forståelse for den molekylære funktion af CRISPR/Cas9 og hvordan vi kan udnytte den til genmodifikation. Herefter kan de forskellige cases læses uafhængigt af hinanden.

Teori:

Tilgå teorimaterialet ved at trykke på knapperne nedenunder.

Cases og opgaver:

 

  • Case 1 - Oprindelsen fra et Prokaryot Immunforsvar

    Introduktion

    Oprindelsen af CRISPR/Cas9 – et prokaryot adaptivt immunforsvar

    CRISPR/Cas-systemer er prokaryote immunsystemer, designet til at forsvare bakterier og arkæer imod invasivt genetisk materiale. Dette kunne for eksempel være plasmider, der er små ringformede DNA-sekvenser, som kan påvirke prokaryotens genom, eller virus, som overtager prokaryotens cellefunktioner, så virussen kan reproducere sig selv. Generelt kan det siges om invasivt genetiske materiale, at det prøver at ændre cellens DNA, hvormed det udgør en potentiel trussel imod genomet.

    CRISPR/Cas-systemer består overordnet af to komponenter, en DNA-sektion kaldet CRISPR-regionen, der findes i prokaryotens eget genom, og de funktionelle Cas-proteiner, der bevæger sig rundt i cytoplasmaet. Ved eksempelvis et virusangreb på en prokaryot, vil der injiceres viralt DNA i cellen, som må destrueres hurtigt, før det overtager cellens funktioner og dræber den. Her aktiveres CRISPR/Cas-systemet hurtigt, hvorved Cas-proteiner sendes ud i cellens cytoplasma, for at søge efter det invasive DNA. Så snart det fremmede DNA bliver lokaliseret, bliver det klippet i stykker ved dobbeltstrengsbrud og derefter nedbrudt, så det ikke udgør en trussel mere.

    Systemet siges at være adaptivt, da der ved en infektion opsamles en lille prøve af det invasive DNA, som gemmes i CRISPR-regionen og kan bruges til hurtigere at genkende fremtidige infektioner af samme type. Det er disse fragmenter, som bruges til at lave gRNA til Cas9, så proteinet kan genkende det invasive genetiske materiale. Det er disse fragmenter, der udgør immuniteten i systemet og de kan nedarves af bakteriens afkom, hvilket giver de nye bakterier den samme immunitet, som de forhenværende generationer har erhvervet.

    Der findes utroligt mange forskellige variationer af CRISPR/Cas-systemer, med forskellige proteiner og virkningsmekanismer, som varierer mellem prokaryoter. Bakterien Streptococcus pyogenes indeholder to typer af CRISPR/Cas-systemer, nemlig type I og type II. Der vides ikke meget om type I systemets funktionsmekanisme og om det overhovedet er aktivt. Type II systemet er derimod meget velstuderet og blev brugt til at udvikle det meget omtalte genteknologiske værktøj, CRISPR/Cas9. S. pyogenes er afbildet på figur 14. For at forstå, hvordan det genteknologiske værktøj blev opdaget, kan man kigge på, hvordan det originale immunsystem fungerer, da funktionsmekanismerne er meget ens. Dermed tages nu et nærmere blik på type II CRISPR/Cas-systemet i S. pyogenes.

    Figur 14. Streptococcus pyogenes er bakterien hvor det mest anvendte CRISPR/Cas9 stammer fra. De røde prikker er enkelte bakterier, som tilsammen danner kæder.

    Kilde: Centers for Disease Control and Prevention, United States Department of Health and Human Services.

    Immunsystemets opbygning og funktion

    Opbygningen af type II CRISPR/Cas-immunsystemet

    CRISPR-regionen

    CRISPR-regionen er immunsystemets informationscentral, hvor alle oplysningerne gemmes og hvor Cas-proteinerne udsendes fra eller rapporterer til. CRISPR er en forkortelse af Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. Navnet beskriver meget nøjagtigt den karakteristiske opbygning af CRISPR-regionen i det prokaryotiske genom; gentagelser af små DNA-sekvenser, kaldet repeats, der ligger sammen i samme afstand fra hinanden. Disse er 32 basepar lange. Repeats er palindrome, hvilket betyder at de læses identisk både fra venstre mod højre på den ene streng og i modsat retning på den komplementære streng.
    Imellem hvert repeat haves en DNA-sekvens af ekstragenomisk oprindelse, hvilket betyder at sekvenserne ikke stammer fra prokaryotens eget genom. Disse er kaldet spacers og er omtrent 35 basepar lange fragmenter af invasivt DNA fra tidligere infektioner. De stammer altså fra bakteriofager (virus), plasmider eller andet fremmed DNA. Disse tilegnede spacer-fragmenter bruges som et bibliotek over forhenværende infektioner, sådan at systemet nemt og hurtigt kan identificere DNA fra infektioner, som cellen har oplevet tidligere. Hver spacer svarer altså til en tidligere infektion af bakterien. Spacerne kan transskriberes til RNA og omdannes til gRNA, som er den form hvorpå de anvendes af Cas-proteiner.

    I CRISPR-regionen haves en leader, som er en større regulatorisk DNA-sekvens, der bestemmer transskriptionen af spacers til brugbar gRNA og kontrollerer integrationen af nye spacers. Yderligere haves cas-generne, som er meget vigtige for systemet, da de koder for Cas-proteinerne. De ligger nær CRISPR-regionen i genomet. Se figur 15 for opbygningen af CRISPR-regionen og cas-generne for Type II CRISPR/Cas-systemet i S. pyogenes.

    Figur 15 – Opbygningen af den genetiske region for type II CRISPR/Cas-systemet i S. pyogenes. CRISPR-regionen indeholder alle de vigtige informationer om tidligere infektioner, i form af forskellige spacers, der sidder mellem repeats. Regionen indeholder en leader, der er en DNA-sekvens, som regulerer integrationen og transskriptionen af spacers. De fire cas-gener koder for Cas-proteinerne, der udøver immunforsvarets funktioner. Det nærtliggende tracrRNA-gen bruges i dannelsen af gRNA til Cas9.

    Cas-proteinerne

    CRISPR associerede (Cas) proteiner er immunsystemets funktionelle enheder – det er dem, der udfører arbejdet. Deres funktion er at opretholde immunsystemets aktivitet og varetage strukturen i CRISPR-regionen, hvilket ordnes af forskellige proteiner med forskellige roller. Nogle Cas-proteiner indhenter informationer om nye infektioner, i form af spacerne, som de afleverer til CRISPR-regionen, mens andre Cas-proteiner udsendes fra CRISPR-regionen med denne information for at eliminere infektionstruslerne. Cas-proteiner kan være styret af gRNA, svarende til DNA-sekvensen, som systemet vil have dem til at arbejde på. Specifikt for Type II CRISPR/Cas-systemet i S. pyogenes, haves følgende Cas-proteiner:

    Cas1 – indsamler nye spacers til CRISPR-regionen sammen med Cas2.

    Cas2 – indsamler nye spacers til CRISPR-regionen sammen med Cas1.

    Cas9 – detekterer og eliminerer invasivt DNA ved dannelse af dobbeltstrengsbrud i DNA’et. Proteinet er styret af guide RNA (gRNA), som stammer fra CRISPR-regionens spacers.

    Csn2 – involveret i erhvervelse af nye spacers til CRISPR-regionen.

    Yderligere haves ét vigtigt protein, der er nødvendig for systemets funktion:

    RNase III – behandler RNA transskriberet fra CRISPR-regionen og danner det færdige gRNA, som anvendes til styringen af Cas9.

    Funktionen af type II CRISPR/Cas-immunsystemet

    Følgende afsnit vil beskrive type II CRISPR/Cas-immunsystemets funktionsmekanisme, eksemplificeret ved bakteriofagangreb på bakterien Streptococcus pyogenes. Processen beskrives trinvist, som angivet på figur 16.

    2.2_crop (3)

    Figur 16. Oversigt over type II CRISPR/Cas-immunsystemets reaktion på en bakteriofaginfektion i S. pyogenes. De enkelte trin er nummereret svarende til den detaljerede beskrivelse nedenfor.

    Anskaffelse af ny immunitet: Adaptation

    CRISPR/Cas-immunsystemet er adaptivt, da systemet kan tilegne sig immunitet imod nyt invasivt genetisk materiale. Det betyder, at systemet kan tilpasse sig til nye trusler, som ikke har inficeret cellen før. De følgende trin beskriver hvorledes DNA’et fra en bakteriofag bliver omdannet til en immunitet imod bakteriofagen selv, af CRISPR/Cas-systemet i Streptococcus pyogenes.

    1. En bakteriofag binder sig til et overfladeprotein på prokaryotens overflade, hvorved infektionen starter. Bakteriofagen skyder sit invasive DNA ind i prokaryotens cytoplasma, hvormed der nu er opstået en akut trussel mod cellen, da bakteriofag DNA’et prøver at overtage cellens virkningsmekanismer. På det invasive DNA findes der Protospacer Adjacent Motifs (PAM), der definerer det område på det invasive DNA, som CRISPR/Cas-systemet kan omdanne til en spacer. Dette område kaldes for en protospacer. PAM-sekvenser er tilsyneladende tilfældigt placeret, og derved er protospaceren en tilfældig valgt del af det invasive DNA. PAM-sekvensen for S. pyogenes er 5’-NGG-3’. Dette betyder, at alle steder, hvor der ses 5’-NGG-3’ i det invasive DNA, haves en potentiel protospacer. Den interessante del af det invasive DNA ses på figur 17.

    Figur 17. Et udsnit at det invasive DNA og placeringen herpå af protospaceren og den essentielle PAM-sekvens, 5′-NGG-3′, der kan genkendes af Cas-proteiner. 

    2. CRISPR/Cas-systemet reagerer på infektionen og Cas-proteiner undersøger det invasive DNA. Cas-proteinerne Cas1 og Cas2 danner et kompleks, som muligvis også interagerer med Cas9 og Csn2. Dette Cas1-Cas2-kompleks undersøger det invasive DNA og er ansvarlig for valget af protospacer ud fra genkendelse af PAM-sekvenser, men dette foregår ved en endnu ufastlagt mekanisme for S. pyogenes. Protospaceren skæres fri fra det invasive DNA af Cas1-Cas2-komplekset og transporteres til CRISPR-regionen.

    3. Cas1-Cas2-komplekset fungerer også som en integrase, idet det indsætter den nyerhvervede omtrent 35 basepar spacer i CRISPR-regionen. Integration af en spacer skal ske meget nøjagtigt, for ikke at ødelægge CRISPR-regionen. Cas1-Cas2-komplekset integrerer spaceren afhængigt af leader-sekvensen og ved genkendelse af repeats. Spaceren bliver indsat mellem to repeats for enden af leader-sekvensen. Når spaceren er blevet inkorporeret i CRISPR-regionen, giver den potentiel immunitet overfor bakteriofagen, der angreb cellen. Immuniteten er defineret ved den specifikke sekvens af spaceren, da denne vil kunne bruges til hurtigt at identificere et nyt angreb af samme type bakteriofag. For at udøve immuniteten som spaceren giver, skal spaceren først omformuleres til brugbar gRNA til Cas9. Dermed skal en anden mekanisme af systemet aktiveres.

    Formulering af immunitet: CRISPR-ekspression og dannelse af gRNA

    Cas9 er det protein, der identificerer invasivt DNA og herefter destruerer det. For at Cas9 skal kunne genkende det truende invasive DNA, må den få formuleret den tilsvarende nyerhvervede spacer på en måde, hvorved den kan anvendes praktisk. Spaceren skal formuleres som en del af gRNA, som styrer Cas9 mod det invasive DNA. Husk, at gRNA er den udskiftelige del af Cas9, der giver mulighed for, at proteinet kan genkende forskellige specifikke sekvenser, binde sig til dem og destruere dem ved at klippe dem over. I bakterien består gRNA af to stykker RNA, nemlig crRNA (CRISPR-RNA) og tracrRNA (trans-activating CRISPR-RNA). De følgende trin beskriver dannelsen af gRNA, ud fra den nyerhvervede spacer fra CRISPR-regionen.

    4. Det første trin for dannelsen af gRNA, er transskription af CRISPR-regionen, der indeholder den givne spacer. Dette menes at blive promoveret af leader-sekvensen. Transskriptionen danner et længere stykke RNA, der består af en længere række af spacere og repeats. Dette RNA kaldes for pre-crRNA.

    5. Nær CRISPR-regionen transskriberes tracrRNA, for at kunne interagere med pre-crRNA. Dette tracrRNA binder sig til repeat-segmenterne af pre-crRNA, hvorved der dannes et pre-crRNA:tracrRNA-kompleks.

    6. Det dannede RNA-kompleks rekrutterer den RNA-specifikke nuklease RNase III, som kløver RNA-komplekset til flere crRNA:tracrRNA-komplekser, under tilstedeværelsen af Cas9. De resulterende RNA-komplekser består af ét stykke tracrRNA og ét specifikt stykke crRNA, som faktisk udgør færdigt gRNA.

    7. Det dannede gRNA med spaceren fra bakteriofagen optages nu af Cas9, således at proteinet bliver aktivt. Dermed kan Cas9 søge efter det invasive DNA og ødelægge det, før det er for sent. crRNA-delen indeholder en 20 nukleotider lang del af spaceren, der bruges af Cas9 til identifikationen af invasiv DNA. tracrRNA-delen spiller en strukturel rolle, som muliggør at Cas9 kan binde gRNA’et og derved anvende det.

    Udøvelse af immunitet: Cas9-aktivitet

    Det aktiverede Cas9 overvåger nu cellen for bakteriofagangreb af den samme type, ved gennemsøgning af cytoplasmaet for bakteriofagens DNA. PAM-sekvensens tilstedeværelse er en nødvendighed for, at Cas9 vil kunne genkende bakteriofagens DNA, og dermed søger den primært efter disse. Hver gang Cas9 finder en PAM-sekvens, afprøver proteinet om gRNA’ets 20 nukleotider spacer-del passer med resten af DNA-sekvensen. Da PAM-sekvenser mangler i CRISPR-regionen, sikres det, at Cas9 ikke kan genkende CRISPR-regionens spacer-sekvenser og dermed ikke kan klippe i dem. Kravet om PAM-sekvensen fungerer altså som en sikkerhed for bakteriens egen CRISPR-region, hvormed der undgås autoimmunitet i CRISPR/Cas-systemet.

    8. Når Cas9 møder bakteriofagens DNA, vil den binde sig til PAM-sekvensen og bakteriofagens DNA vil passe sammen med det nydannede gRNA, da de to sekvenser svarer til hinanden. Dette er fordi det bundne gRNA i Cas9 er baseret på netop denne sekvens, som udgjorde protospaceren i starten. Denne gRNA-DNA-binding medfører, at Cas9 binder sig fast om DNA-strengen. Da Cas9 nu har identificeret bakteriofagens DNA, laver Cas9 et dobbeltstrengsbrud, hvilket medfører, at det vil blive nedbrudt. Cas9 giver slip på det kløvede DNA og er derefter klar til at søge videre.

    På denne måde beskyttes S. pyogenes af CRISPR/Cas-systemet mod bakteriofagens angreb og den samme mekanisme ses ved plasmider eller andre genetiske elementer.

    Baggrundshistorien for udviklingen af CRISPR/Cas9

    Baggrundshistorien for udviklingen af CRISPR/Cas9

     

    Cas9’s forgængere – Zinc-fingers og TALENs

    Idéen om at modificere gener er ikke ny, og CRISPR/Cas9 har flere forgængere. De tidligere genteknologiske værktøjer, Zinc-fingers og TALENs (transcription activator-like effector nucleases), er opbygget af enkelte proteinenheder, der kan genkende nogle enkelte nukleotider. Disse proteinenheder kan sammensættes til større komplekser, således at de kan genkende længerere sekvenser. Disse proteinkomplekser kan knyttes til en nuklease, som så kan lave et dobbeltstrengsbrud i DNA. Zinc-fingers kan kun genkende 3 nukleotider og TALENs kun 1 nukleotid, hvormed det kræver et stort stykke arbejde at opbygge et proteinkompleks, der kan give samme effekt, som let opnås ved CRISPR/Cas9.
    En stor fordel ved Cas9 er altså, at det blot er ét enkelt protein, der ikke behøver nogle modifikationer hver gang en ny sekvens skal rammes, fordi det anvender RNA-baseret identifikation fremfor protein-baseret identifikation. Da man kun skal udskifte det styrende gRNA, for at variere hvilken sekvens man vil ramme, er det meget lettere end at opbygge nye proteinkomplekser. Derfor er CRISPR/Cas9 lettere og billigere end før.

     

    Udviklingen af CRISPR/Cas9

    Udviklingen af det genteknologiske værktøj CRISPR/Cas9, er et pragteksempel på bioteknologi. Ligesom ved Alexander Flemings opdagelse af penicillin i 1928, og så mange andre biologiske opdagelser, starter det hele ofte med en tilfældighed.
    Man har kendt til de mystiske repetitive CRISPR DNA-sekvenser siden Yoshizumi Ishino og hans forskergruppe tilfældigvis opdagede dem i 1987, i forbindelse med noget andet genetisk arbejde. Dog forblev deres funktion ukendt helt frem til efter årtusindskiftet, hvor forskellige forskergrupper begyndte at undersøge CRISPR-sekvenserne. Sekvenserne blev blot mere mystiske, da man i 2005 opdagede, at de ikke stammede fra organismerne selv, men havde oprindelse fra virus og plasmider. Det var dog denne opdagelse, der fik forskerne til at opstille hypotesen om, at CRISPR-sekvenserne spillede en rolle i et prokaryot immunsystem. Deres funktion blev eksperimentelt bekræftet i 2007 af et forskerhold fra fødevarevirksomheden Danisco, der prøvede at vaccinere deres bakteriestammer mod vira og dermed gøre dem til stærkere produktionsorganismer. Herefter begyndte man at afklare funktionsmekanismen af CRISPR/Cas-immunsystemet gennem forskellige studier, hvilket gav startskuddet til kapløbet om at bruge systemet til genteknologiske formål. I 2012 havde nogle forskergrupper samtidigt bevist, at systemer fra Streptococcus thermophilus og Streptococcus pyogenes kunne modificeres og udgøre genteknologiske værktøjer. Disse opdagelser blev startskuddene til den store patentkrig mellem University of California, Berkeley, og Broad Institute. Dette er en utroligt indviklet og heftig konflikt om hvem, der kan kalde sig retmæssig ejer af CRISPR/Cas9-teknologien.

    Generelt kan man sige, at forskernes nysgerrighed ledte til studierne af CRISPR-sekvensernes funktion, hvilket gav anledning til opdagelsen af Cas9. Undersøgelser af funktionen og strukturen af Cas9 i dets naturlige miljø afslørede dets store potentiale, da man opdagede, at proteinet både kunne genkende og klippe DNA-sekvenser. Udforskningen af dannelsen og funktionen af gRNA er fuldkommen central, da man herved fandt ud af, at det var dette element, der var nøglen til kontrollen over Cas9. Det er ud fra denne viden, at man har gjort Cas9 programmerbart med syntetisk fremstillet sgRNA.

    Udviklingen af CRISPR/Cas9 fortæller historien om, at bioteknologi ofte handler om at opdage og udforske de grundlæggende værktøjer, som naturen selv har skabt og derefter finde ud af, hvordan vi kan udnytte dem til gavnlige formål.

    Hvem ved, hvad der ellers findes ude i naturens enorme uudforskede landskab?

  • Case 2 - Genregulering med CRISPR-teknologi

    CRISPRi - Gene silencing med dCas9

    Genekspressionsregulering med CRISPR-teknologier – CRISPRi og dCas9

    Gener koder for mange forskellige egenskaber, afhængigt af funktionen af de proteiner, som generne koder for. For at egenskaberne skal komme til udtryk i en organisme, skal generne først transskriberes. Dermed kan man styre egenskabers udtrykning, ved at styre transskriptionen af generne.
    Der er blevet udviklet andre CRISPR/Cas9-baserede værktøjer end bare det naturlige Cas9. Disse udnytter også den præcise binding som Cas9 kan udføre i kombination med sgRNA, men giver andre muligheder end at lave dobbeltstrengsbrud til genmodificering. De alle er afarter af Cas9-proteinet, som er blevet modificeret. Det er muligt at anvende Cas9-proteinet til kontrol af genreguleringen. Ved at omdanne Cas9-proteinet til en inaktiv form, dannes et protein, der blot binder specifikt til DNA-sekvenser afhængigt af det givne sgRNA. Denne type Cas9 kaldes for dead Cas9 (dCas9), da den ikke kan lave dobbeltstrengsbrud i DNA. dCas9 dannes ved at inaktivere Cas9-endonukleaserne, RuvC og HNH, med punktmutationer i Cas9-genet, således at disse ikke kan klippe i DNA-strenge. dCas9 tillader at man kan styre geners aktivitet, ved at få den til at binde til specifikke sekvenser. Denne genkontrollerende metode kaldes for CRISPR interference (CRISPRi). Med denne metode er det muligt at kontrollere om gener skal udtrykkes eller hæmmes, uden at man redigerer i selve DNA-sekvenserne. CRISPRi ændrer altså ikke den genetiske information, men kontrollerer transskriptionen af den. Dette har sine fordele, da genfunktionerne kan reguleres uden at lave permanente mutationelle ændringer i DNA-sekvensen, som kan have alvorlige konsekvenser for organismen. Vigtige fordele er altså, at manipuleringen er reversibel og ikke-mutationel. Mekanismen er lig den normale funktion af Cas9, da dCas9 identificerer DNA-sekvenser med det givne gRNA og ud fra en PAM-sekvens, som medfører en bindingsdannelse til DNA-sekvensen.

     

    Gene silencing med dCas9: repression

    Det er muligt at effektivt reducere ekspression af et helt specifikt gen, hvis man kan blokere for RNA-polymerasen, som transskriberer DNA til mRNA. Ved at anvende dCas9 og et stykke sgRNA, som er designet til at genkende det samme sted som RNA-polymerasen binder, kan man opnå en fysisk blokering af RNA-polymerasen. Dette kaldes for gene silencing, idet man undertrykker genets ekspression. Der er flere tilgange til gene silencing med dCas9, og deres effektivitet afhænger af hvor på genet man rammer.

    3.1_crop

    Figur 18. CRISPRi gene silencing med dCas9. Øverst ses strukturen af genet, med promoteren og det RNA-kodende DNA. RNA-polymerasen ses igang med transskriptionen. Blokeringen af transskriptionsinitieringen viser hvorledes dCas9 sætter sig i promoteren og blokerer for binding af RNA-polymerasen, hvormed genets transskription forhindres. Blokeringen af transskriptionselongeringen viser hvordan dCas9 sætter sig midt i genet og blokerer for RNA-polymerasens bevægelse ned langs DNA-strengen, hvormed der også ses en hæmning af transskriptionen. Således kan genets ekspression hæmmes.

    Blokering af transskriptionsinitiering – forhindring af opstarten af transskriptionen. Den mest optimale effektivitet fås, når dCas9 sidder på transskriptionens startsted, promoteren. Dette vil blokere for selve bindingen af RNA-polymerasen og dermed forhindrer opstarten af transskriptionen. Blokeringen er uafhængig af hvilken DNA-streng dCas9 binder til, da binding til den kodende streng og skabelonstrengen begge forhindre binding af RNA-polymerasen og dermed giver lige stor repression af genet. Se figur 18 for illustration af blokering af transskriptionsinitiering.

    Blokering af transskriptionselongering – forhindring af udførsel af transskriptionen. dCas9 kan også binde midt på genets RNA-kodende sekvens, hvor den blokerer RNA-polymerasens bevægelse langs strengen, når den transskriberer genet. Effektiviteten af dette afhænger af hvilken streng dCas9 sidder på. For at opnå høj effektivitet af repressionen, skal sgRNA designes således at dCas9 binder sig til den kodende DNA-streng og ikke til skabelonstrengen. Se figur 18 for illustration af blokering af transskriptionselongering.

    Ligesom ved traditionel genmodificering med Cas9, kan man anvende multiplexing, hvor flere stykker sgRNA kan bruges sammen med dCas9 til at blokere flere gener på en gang. Det er også muligt at blokere ekspressionen af ét gen ekstremt effektivt, ved at have flere sgRNA, der rammer det samme gen, men forskellige steder.

    E. coli CRISPRi-genregulering

    CRISPRi gene silencing til modificering af Escherichia coli

    Bakterier kan have fantastisk mange forskellige strukturer, former og størrelser, hvilket man betegner som deres morfologi. Når man beskriver morfologien, handler det om organismens fænotype. Variationerne går fra bittesmå spiraler til store runde bakterier, der er synlige med det blotte øje (eks. Thiomargarita namibiensis). Ligesom alle deres andre egenskaber, afhænger deres morfologi af den genetiske information, som er lagret i deres DNA. Dette betyder, at man ved hjælp fra CRISPR-teknologi kan ændre bakteriernes morfologi, hvilket eksempelvis kan være gavnligt, når man bruger bakterierne til produktion.

    Der vil nu tages et nærmere blik på, hvordan et forskerhold afprøvede CRISPRi til at regulere ekspressionen af gener, der bestemmer morfologien af Escherichia coli og dermed kunne styre deres udseende. Forskerne ville gerne opnå større E. coli bakterier, da disse kan forøge produktionen af bioplast, grundet et større cellevolumen til ophobning af bioplasten. Den normale morfologi af E. coli er en lettere aflang stavform, som kan ses på figur 19. Billedet viser den negative kontrol fra CRISPRi-forsøget, hvilket betyder at bakterierne bevidst indeholder dysfunktionelt sgRNA, hvormed der ikke er udført nogle genetiske ændringer i disse bakterier. De har vildtype fænotypen.

    Figur 19. Den naturlige morfologi af E.coli. Dette er den negative kontrol af CRISPRi-forsøget, hvor der ses en E. coli stamme kaldet JM109, med dysfunktionelt sgRNA, der ikke rammer nogle gener. Størrelsesforholdet kan ses nederst i højre hjørne.

    Kilde: “CRISPRi engineering E. coli for morphology diversification”, D. Elhadi, L. Lv, X.R. Jiang, H. Wu, G.Q. Chen, Metabolic Engineering, 38:358-369 (2016).

    I forsøget var der to gener, som forskerne målrettet gik efter at manipulere genreguleringen af. Disse to gener var ftsZ-genet, der er relateret til bestemmelsen af længden af bakterien, og mreB-genet, der er relateret til bestemmelsen af bredden af bakterien. Ved at regulere disse gener med CRISPRi, kan man lave betydelige ændringer i morfologien. I denne situation vil det ikke være muligt at bruge det naturlige Cas9 til at lave et gen knock-out, da bakteriecellerne ikke kan gro hvis ftsZ– eller mreB-genet er fuldkommen dysfunktionelt. CRISPRi gene silencing med dCas9 er derfor en oplagt mulighed, da generne ikke deaktiveres fuldkomment permanent. Generne bliver udsat for en delvis repression og dermed tillader at bakterierne kan vokse med deres nye morfologi.

    ftsZ-genet koder for et protein, der spiller en central rolle i celledelingen, hvor nye celler dannes. Proteinet hedder FtsZ og danner sammen med andre proteiner en Z-ring, som trækker sig sammen og deler en bakterie i to nye. Mængden af proteinet afgør hvor lange bakterierne kan blive, før de bliver delt. Ved at hæmme genets ekspression og dermed sænke mængden af FtsZ-protein, hæmmes celledelingen, hvormed cellerne vokser sig længere før de deler sig. ftsZ-genets funktion kan ses på figur 20.

    mreB-genet koder for MreB-proteinet, som har til funktion at regulere størrelsen på bakteriens cytoskelet, som bestemmer cellens rummelige struktur. Ved at hæmme ekspressionen af mreB-genet, sænkes produktionen af MreB-proteinet, hvormed størrelsen ikke kan reguleres på normalvis. Dette betyder at cellen kan vokse sig større, dog med et mere svækket cytoskelet. mreB-genets funktion kan ses på figur 20.

    Figur 20. Her ses funktionen af de undersøgte gener, ftsZ og mreB. Ved at hæmme ftsZ-genet, kan Z-ringen ikke dannes i samme grad og cellerne vil blive længere. Ved at hæmme mreB-genet kan det tilhørende protein ikke regulere cellestørrelsen i samme grad og dermed kan cellerne blive mere fyldige.

    For at kunne udføre denne gene silencing med dCas9, skulle der designes sgRNA, der kunne identificere de to gener, således at dCas9 kunne binde sig til dem. Her valgte forskerne 20 nukleotider, der var komplementære til DNA-sekvenserne af generne, ligesom det blev gennemgået i afsnittet Design af sgRNA, under Grundteorien. Da bindingen af dCas9 generelt giver den bedste effektivitet på den kodende streng, blev sgRNA designet til at være komplementært til denne. Multiplexing blev anvendt til at få dCas9 til at ramme flere steder på generne. Årsagen var at undersøge, hvilke kombinationer af bindingssteder for dCas9, der gav den mest effektive reduktion af genekspressionen. For hvert gen blev der designet 5 forskellige sgRNA, der kunne ramme forskellige områder af generne. En masse forskellige kombinationer af disse forskellige sgRNA blev afprøvet for hvert gen, for at finde den mest effektive kombination for hvert gen. Denne multiplexing foregår ved at indføre et eller flere stykker sgRNA sammen med genet for dCas9 i en vektor, tilsvarende som det blev gennemgået i afsnittet Leveringsmetoder, under Grundteorien.

    For ftsZ-genet blev sgRNA designet til at udføre blokering af transskriptionselongeringen, hvor dCas9 binder sig midt på genet og forhindrer RNA-polymerasens bevægelse langs DNA-strengen. Dette fremgår af de 5 dCas9-bindingssteder, der ses på figur 21.

    Figur 21. Placeringen dCas9-bindingssteder på ftsZ-genet for de 5 forskellige sgRNA.

    For mreB-genet blev sgRNA også designet til blokering af transskriptionselongeringen, samt blokeringen af transskriptionsinitieringen, hvor dCas9 binder sig i promoteren og forhindrer RNA-polymerasens binding. Dette fremgår af figur 22, der viser de 5 dCas9-bindingssteder på mreB-genet.

    Figur 22. Placeringen dCas9-bindingssteder på mreB-genet for de 5 forskellige sgRNA.

    Udvalgte CRISPRi-modificerede E.coli bakterier ses på figur 23, for ftsZ-genet, og figur 24, for mreB-genet, hvor det tydeligt kan ses at deres morfologi er ændret grundet repressionen af genekspression. Der bliver simpelthen ikke transskriberet nok mRNA til at opretholde vildtype fænotypen.

    For ftsZ-genet ses der multiplexet repression, hvor 4 sgRNA er blevet brugt til at medføre binding af dCas9 på position nr. 1, 2, 3 og 5, som angivet på figur 21. Det kan ses, at dette har medført betydeligt længere bakterier.

    For mreB-genet blev der brugt ét enkelt stykke sgRNA til at ramme position nr. 4, som angivet på figur 22, hvilket har forårsaget opsvulmede bakterier.

    I alle disse bakterier sidder dCas9 bundet fast på de valgte positioner i DNA’et for de to gener, som det kan ses på figur 18. Dette medfører altså variationer af morfologien, fordi generne har en reduceret ekspression grundet CRISPRi gene silencing.

    Figur 23. CRISPRi gene silencing af ftsZ-gen på dCas9-bindingssteder nr. 1,2,3 og 5, som angivet på figur 21, giver ændret morfologi af E. coli. Længere bakterier er opnået ved multiplexet reduktion af ekspressionen af ftsZ-genet.

    Kilde: “CRISPRi engineering E. coli for morphology diversification”, D. Elhadi, L. Lv, X.R. Jiang, H. Wu, G.Q. Chen, Metabolic Engineering, 38:358-369 (2016).

    Figur 24. CRISPRi gene silencing af mreB-gen på dCas9-bindingssted nr. 4, som angivet på figur 22, giver ændret morfologi af E. coli. Mere fyldige bakterier er opnået ved reduktion af ekspressionen af mreB-genet.

    Kilde: “CRISPRi engineering E. coli for morphology diversification”, D. Elhadi, L. Lv, X.R. Jiang, H. Wu, G.Q. Chen, Metabolic Engineering, 38:358-369 (2016).

    Forskerne afprøvede også at kombinere repressionen af begge gener, hvilket er et eksempel på multiplexing af flere forskellige gener. Her brugte de 5 sgRNA på samme tid, hvoraf 4 forårsagede dCas9-binding på ftsZ-genet og det sidste stykke sgRNA var målrettet mreB-genet. Resultatet af denne dobbelte gene silencing, kan ses på figur 25, hvor det er meget tydeligt, at E.coli bakterierne slet ikke har deres normale morfologi.

    Det her var et eksempel på, hvordan man kan bruge CRISPRi til at udføre gene silencing og dermed reducere ekspressionen af gener. Som billederne bevidner, kan bindingen af dCas9 til specifikke sekvenser give drastiske ændringer i fænotypen af en organisme. Disse ændringer opnås helt uden at ødelægge DNA-sekvensen, men blot ved at regulere hvorledes generne udtrykkes.

    Figur 25. CRISPRi gene silencing af ftsZ-genet på dCas9-bindingssteder nr. 1,2,3 og 5, samt mreB-genet på dCas9-bindingssted nr. 4. Her ses en stor ændring i morfologien af E. coli, da der sker en reduktion af ekspressionen for begge gener, ftsZ og mreB, hvormed bakterierne både bliver længere og mere fyldige.

    Kilde: “CRISPRi engineering E. coli for morphology diversification”, D. Elhadi, L. Lv, X.R. Jiang, H. Wu, G.Q. Chen, Metabolic Engineering, 38:358-369 (2016).

    dCas9 med effektor-domæner (CRISPRi og CRISPRa)

    dCas9 med effektor-domæner – repression (CRISPRi) og aktivering (CRISPRa)

    Indtil nu er brugen af dCas9, som en fysisk blokade til at reducere ekspressionen af gener, blevet gennemgået. Faktisk kan dCas9 bruges til mere end blot at være en blokade, der sætter sig på DNA-strengene. Det er muligt at bruge dCas9 til at manipulere den naturlige regulering af genekspressionen. Ved hjælp af denne tilgang, er det faktisk også muligt at opregulere ekspressionen af gener, hvormed man forøger mængden af de proteiner som generne koder for. Denne type opregulering kaldes for CRISPR activation (CRISPRa).

    Eukaryote gener indeholder små regulatoriske sekvenser, der sidder nær promoteren. Disse regulatoriske sekvenser kan enten medføre opregulering af genekspressionen, hvormed genet udtrykkes mere, eller medføre nedregulering af genekspressionen, hvormed genet udtrykkes mindre. Der findes sekvenser, som kaldes for enhancers, der kan opregulere genekspressionen, og silencers, der kan nedregulere genekspressionen. For at regulatoriske sekvenser har en effekt på genekspressionen, skal der binde sig bestemte proteiner til dem, kaldet transskriptionsfaktorer, der enten skruer op eller ned for transskriptionen. Hvis den binder til en enhancer og skruer op for genekspressionen, kaldes den en aktivator. Hvis den derimod binder til en silencer og skruer ned for genekspressionen, kaldes den en repressor. Hvis man forestiller sig genekspression som en kørende bil, kan man sige at aktivatorer fungerer som speederen og repressorer som bremsen. Det er disse aktivatorer og repressorer, der er interessante at udnytte sammen med dCas9.
    Man kan bruge dCas9 som en leverandør af transskriptionsfaktorer, ved at sætte deres aktive proteindomæner fast på overfladen af proteinet. Disse proteindomæner benævnes generelt som effektor-domæner. Dernæst giver man dCas9 et stykke sgRNA, der genkender et sted nær en regulatorisk sekvens, hvor dCas9 så kan binde sig. Herfra kan det aktive effektor-domæne spille sin rolle som regulator af genekspressionen, som kan have en effektiv virkning på kontrollen af genet. dCas9 bliver altså en sgRNA-styret leverandør af proteiner, der regulerer genekspression. CRISPRi udføres ved repressor effektor-domæne, mens CRISPRa udføres med et aktivator effektor-domæne. Opbygningen af dCas9 med effektor-domæner kan ses på figur 26.

    Figur 26. dCas9 med fusioneret effektor-domæne til regulering af genekspressionen. Den regulatoriske sekvens påvirkes af det aktive domæne og regulerer transskriptionen. Hvis domænet er en aktivator vil transskriptionen opreguleres (CRISPRa), mens en repressor vil medføre nedregulering (CRISPRi).

    Herunder gives to eksempler på dCas9, hvorpå der er fusioneret effektor-domæner, der regulerer transskriptionen af gener.


    Cas9-KRAB – nedregulering af genekspression (CRISPRi) 
    En Krüppel associeret box (KRAB) er et proteindomæne, der findes på mange transskriptionsfaktorer, der kontrollerer menneskets gener. Dens formål er at reducere genekspression og dermed fungerer den som en repressor. Ved at sætte et KRAB-proteindomæne på dCas9 og styre denne mod geners regulatoriske sekvenser med sgRNA, kan man vælge hvilke gener, der skal have reduceret genekspression. På denne måde kan man styre repressionen af specifikke valgte gener, hvilket er blevet gjort i menneskeceller.


    dCas9-VP64 – opregulering af genekspression (CRISPRa)
    Et VP64-proteindomæne er en kunstigt fremstillet aktivator, der kan opregulere geners ekspression. Når denne fusioneres på dCas9, kan denne også styres mod specifikke geners regulatoriske sekvenser med sgRNA. Hermed kan man altså opregulere genekspression af valgte gener. Dette er også blevet gjort i menneskeceller.

    Anvendelser

    Eksempler på praktiske anvendelser af CRISPRi og CRISPRa

     

    Genom-screening og undersøgelse af genfunktioner

    Da dCas9 nemt kan bruges og programmeres med sgRNA, er det et kraftfuldt værktøj til at søge efter gener i hele genomer. sgRNA er nemt at fremstille kunstigt, og dermed kan man lave sgRNA-biblioteker. Disse indeholder mange forskellige sgRNA, som kan eftersøge de gener man vil undersøge. Funktionen af de eftersøgte gener kan undersøges ved at udnytte CRISPRi, til at reducere transskriptionen, eller CRISPRa, til at opregulere transskriptionen og se hvordan det påvirker fænotypen. Ved disse metoder bevares DNA-sekvensen, i modsætning til genundersøgelser med Cas9 knock-outs eller knock-ins.

     

    Kontrol over transskriptionen af specifikke gener

    Man kan danne typer af dCas9 med effektor-domæner, som kan tændes og slukkes for, hvormed man kan bestemme hvornår genet skal represseres eller aktiveres. Der er eksempelvis lavet en type dCas9-VP64-system, som kan aktivere transskription, når cellerne bliver belyst med blåt lys. Hver gang cellerne bliver udsat for blåt lys vil dCas9-VP64 blive aktivt og opregulere transskriptionen af genet. Der haves altså en stærkere kontrol over transskriptionen.

     

    Kunstig differentiering af celler

    Genekspression styrer differentieringen af celler til mere specialiserede celler, såsom når en stamcelle udvikler sig til en undertype af celle. CRISPRi og CRISPRa kan bruges til kontrollere genekspressionen, hvormed man kan påvirke cellens identitet og differentiering. Denne kontrollerede omprogrammering af celletypen er blevet brugt til at omdanne bindevævsceller fra musefostre til skeletmuskelceller. Et af hovedmålene for denne CRISPR-teknologi er at kunne danne stamceller, som kan bruges til sygdomsmodeller eller endda til terapi af sygdomme.

  • Case 3 - Genterapi med CRISPR/Cas9

    Genetiske sygdomme og genterapi

    Genterapi – terapeutisk genredigering med CRISPR/Cas9

    I dette afsnit vil det gennemgås, hvorledes man potentielt kan anvende CRISPR som genterapi mod genetiske sygdomme i fremtiden. Nogle konkrete eksempler på genetiske sygdomme og deres potentielle behandling vil gennemgås.

     

    Genetiske sygdomme

    Genetiske sygdomme opstår på grund af fejl i genomet. Disse fejl er mutationer i DNA’et, som kan være nedarvet eller være opstået i løbet af ens liv. Årsagerne til genetiske sygdomme kan findes på meget forskellige størrelsesniveauer. Det kan være ændringer i alt fra hele kromosomer til enkelte basepar, men være lige alvorlige. Man kan kategorisere genetiske sygdomme efter deres årsags omfang.

    Monogene sygdomme er forårsaget af mutationer i enkelte gener.

    Polygene sygdomme er grundet interaktioner mellem flere gener.

    Kromosomale sygdomme opstår af strukturelle fejl i kromosomerne eller af abnorme antal af kromosomerne.

    Genetiske sygdommes fænotyper skyldes mutationernes påvirkning af generne. Påvirkningen kan enten være en ændring af genproduktets struktur (RNA eller protein), hvormed dette fungerer forkert, eller være ændringer i mængden af produceret genprodukt, hvormed dosen afviger fra normalen.

    Man kunne eksempelvis forestille sig en monogen sygdom i et hypotetisk gen x, der producerer proteinet X, som normalt transporterer store nødvendige molekyler ind i vores celler. En mutation i gen x, der forårsager en ændring af strukturen af protein X, kunne betyde at protein X ikke kunne binde sig til de nødvendige molekyler, hvormed intet ville blive transporteret ind i cellerne. En anden mutation i gen x, der medførte en overproduktion af velfungerende protein X, kunne betyde at alt for mange af de nødvendige molekyler ville blive transporteret ind i cellerne og medføre en giftig effekt. I begge tilfælde kunne man forestille sig, at mutationerne ville udløse en sygdomsfænotype.

     

    Genterapi

    Genterapi er modificeringen af en patients sygdomsforårsagende DNA eller RNA, med det formål at forebygge, kurere eller behandle en genetisk sygdom. Idéen med genterapien er at rettelsen af muterede gener vil genoprette den originale funktion og fjerne den genetiske sygdom. Genmodifikation kan eksempelvis foregå ved en destruktion, insertion, excision eller erstatning af sygdomsgenet, afhængigt af den skyldige mutation, som det blev beskrevet i grundteoriafsnittet Molekylære strategier. Pointen er, at man vil korrigere i genotypen for at eliminere den pågældende sygdomsfænotype.
    Monogene sygdomme er oftest mere håndgribelige med henblik på genterapi, da de kun er forårsaget af mutationer i enkelte gener. Genterapien har derfor haft et stærkt fokus på de monogene sygdomme og genkorrektion af disse med CRISPR/Cas9 er derfor mest veludforsket. Selvom CRISPR-teknologi har potentialet til at revolutionere genterapi og at udviklingen af teknologien sker med en hastig fart, er der et stykke vej endnu. Der nogle udfordringer, som skal overkommes og der kræves mere forskning før CRISPR/Cas9 bliver praktisk anvendeligt til genterapi.

    Der findes to hovedtilgange til at udføre en genterapeutisk korrektion af sygdomsgener med Cas9. In vivo betyder ”indeni det levende”, og hentyder til at korrektionen foregår inde i selve den levende organisme. Ex vivo betyder ”udenfor det levende”, hvilket hentyder til at korrektionen foregår ude af organismen, altså i celler der er blevet fjernet fra selve organismen.

     

    In vivo genkorrektion

    Genterapien foregår i patienten ved direkte levering af genkorrektionssystemet: Cas9, sgRNA og eventuelt en DNA-skabelon. Overførslen af systemet til patienten kan foregå ved forskellige metoder. Dette kan ske ved lokal injektion, ensbetydende med at terapien foregår i et bestemt organ eller afgrænset væv. En systemisk injektion medfører at komponenterne går i blodbanen og vil blive spredt til hele kroppen. Så snart komponenterne er overført til cellerne, vil genredigeringen foregå. Denne overførsel af komponenterne ind i selve cellerne kan foregå på forskellige måder, eksempelvis med en viral vektor eller lipide nanopartikler. Se figur 27 for in vivo genkorrektion. En sikker, effektiv og kontrolleret levering af systemet er vigtig, for at sikre sig at genkorrektionen foregår korrekt og i det korrekte væv. Dette er meget vigtigt aspekt og en af de store udfordringer for genterapi med CRISPR/Cas9. De forskellige former for levering (DNA-, RNA- og protein-baseret) er beskrevet i grundteoriafsnittet Leveringsmetoder.

    4.1

    Figur 27. In vivo genkorrektion. CRISPR/Cas9 leveres direkte i patientens væv, hvormed genkorrektionen foregår inde i patienten. Overførslen kan foregå på forskellige måder, eksempelvis igennem viral levering eller lipide nanopartikler, og med forskellige komponenter, såsom en DNA-skabelon eller flere stykker sgRNA.

    Genkorrektionen kan foretages på forskellige celleniveauer, hvilket giver forskellige resultater og konsekvenser. Korrektionen kan ske i zygoten (den befrugtede ægcelle) og i de tidlige fosterstadier, hvormed alle datterceller dannet af efterfølgende celledeling, vil nedarve korrektionen af genet. Dette kan i sidste ende betyde, at alle celler i organismen vil indeholde genkorrektionen, også kønscellerne, hvilket betyder at genkorrektionen er nedarvelig. Korrektionen af genet kan også foregå i den udviklede organismes somatiske celler, hvormed kun de ramte celler og deres datterceller vil have korrektionen. Disse genkorrektioner vil altså kun findes i det berørte væv og vil ikke være nedarvelige. Genmodifikation bidrager med meget potente metoder til at fjerne genetisk nedarvede sygdomme, men etiske problematikker gør det til et ømtåleligt forskningsområde.

     

    Ex vivo genkorrektion

    Genterapien foregår i celler, der er blevet ekstraheret fra patienten. De genmodificerede celler med den ønskede genkorrektion kan udvælges og opdyrkes udenfor kroppen, hvorefter de så transplanteres tilbage til patienten i det berørte område. Cellerne med genkorrektionen vil derefter varetage de normale funktioner, som celler med sygdomsgenet før ikke kunne. Der er to hovedmåder at foretage en ex vivo genkorrektion på, som afhænger af hvilke typer af patientens celler man anvender som udgangspunkt.

    Stamceller
    Stamceller ekstraheres først fra patienten selv. Herefter foretages genkorrektionen med CRISPR/Cas9. De genmodificerede stamceller kan derefter transplanteres tilbage i det berørte område af patientens krop, hvor de danner nye differentierede celler. De nydannede specialiserede celler vil indeholde genkorrektionen, da de stammer fra de korrigerede stamceller og vil derfor kunne genoprette de normale funktioner og behandle den genetiske sygdom. Stamcellerne kan også selv differentieres til specialiserede celler, og derefter blive transplanteret tilbage som differentierede celler i det berørte område af patienten. Se figur 28.

    Somatiske celler
    De anvendte celler er fuldt udviklede somatiske celler, såsom hudceller eller blodceller. Cellerne kan ekstraheres og derefter genmodificeres med CRISPR/Cas9, hvorefter de bliver transplanteret tilbage til sygdomsområdet. Dog behøver disse celler ikke være fra området hvori man er interesseret i at foretage genkorrektionen, da de kan blive omprogrammeret til andre celletyper. Somatiske celler kan nemt anskaffes fra patienten ved en blodprøve eller biopsi af huden. Efterfølgende omprogrammeres cellerne til induceret pluripotente stamceller (iPSC), som er kunstigt frembragte stamceller. Disse iPSC genmodificeres udenfor kroppen med CRISPR/Cas9, således at sygdomsgenet bliver korrigeret. De korrigerede iPSC isoleres, og differentieres til den type celler, som der findes i det ramte område. Herefter transplanteres de modificerede celler tilbage i patienten. Se figur 28.

    4.2

    Figur 28. Ex vivo genkorrektion. Til venstre ses stamceller, der ekstraheres fra patientens væv. Disse modificeres med CRISPR/Cas9, hvorefter de ønskede celler udvælges og opdyrkes. Til sidst transplanteres cellerne tilbage i patientens væv. Til højre ses en biopsi af hud eller blodceller, der differentieres til induceret pluripotente stamceller (iPSC). Disse modificeres, hvorefter celler der er modificeret korrekt udvælges og opdyrkes. Derefter differentieres iPSC til den givne vævstypes celler og disse transplanteres tilbage.

    En stor fordel ved ex vivo genterapi er muligheden for at undersøge genkorrektionen i cellerne udenfor kroppen, før de bliver transplanteret tilbage. Ved at selektere, kan man udvælge celler med korrekte modifikationer til transplantationen og rendyrke disse, samt bortkaste de celler, der er fejlagtigt muteret. Dette kvalitetstjek sænker risikoen for bivirkninger grundet utilsigtede mutationer, såsom Cas9 off-target effekter, som ikke kan detekteres nemt ved in vivo genkorrektion. En ulempe ved ex vivo genkorrektion er kravet om at kunne gro de ekstraherede celler udenfor kroppen, hvilket kan gøre processen mere kompliceret.

    Retinitis Pigmentosa

    Retinitis Pigmentosa

    Retinitis pigmentosa er en monogen sygdom, der forårsager fremadskridende forvrængning og tab af synet. Symptomerne skyldes degenerering af øjets fotoreceptorer (tapceller og stavceller).  Et typisk sygdomsforløb starter med natteblindhed, som udvikler sig til tab af det midt-perifere syn i den tidlige voksenalder og ender med et meget begrænset tunnelsyn, der kan gøre den sygdomsramte juridisk blind. Andre symptomer kan eksempelvis også være fejlagtigt farvesyn og tab af synets skarphed. Symptomerne og deres alvorlighed kan variere meget blandt berørte.
    Mindst 45 gener kan indeholde mutationer, der forårsager sygdommen. Der kan være forskellige nedarvningsmønstre afhængigt af det muterede gen. Retinitis pigmentosa GTPase regulator (RPGR) genet koder for et protein, der er relateret til fotoreceptorernes fimrehår og er nødvendigt for normalt syn. Mutationer i RPGR kan forårsage en kraftig version af Retinitis pigmentosa, som har en X-bunden arvegang og derfor rammer mænd hårdest. En version af RPGR, der hovedsageligt udtrykkes i nethindens fotoreceptorer, indeholder et exon kaldet ORF15. Da exon ORF15 indeholder et mutationelt hotspot, er mutationer heri typiske. I et genetisk studie blev 58 familier undersøgt, som alle var ramt af retinitis pigmentosa. Man fandt ud af, at exon ORF15-hotspottet er ca. 500 bp langt og at mutationer heri både var deletioner (max. 36 bp) og insertioner (max. 75 bp). Mutationerne resulterer i et dysfunktionelt protein, som medfører degenerering af fotoreceptorerne.

     

    Potentiel ex vivo genterapi

    Man kan foretage en korrektion af disse mutationer med CRISPR-genterapi, ved at modificere den muterede sekvens tilbage til vildtype-sekvensen. Et forskerhold udtog hudbindevævsceller fra en retinitis pigmentosa patient og omdannede dem til induceret pluripotente stamceller (iPSC), som blev korrigeret med CRISPR-genterapi. Disse iPSC kunne teoretisk set blive til celler, som ville kunne blive transplanteret tilbage i patienten og afhjælpe sygdommen, hvormed dette indgreb er en potentiel ex vivo genterapi.

    I patientens ORF15-exon var der en punktmutation, TAG, der koder for et stop-codon og dermed forårsager et for tidligt uhensigtsmæssigt stop af translationen. Proteinet kunne derfor ikke blive færdigproduceret. Genkorrektionen bestod i at omdanne punktmutationen til vildtype-sekvensen, GAG, der koder for aminosyren glutamat.
    DNA-baseret levering blev udnyttet til at få genkorrektionssystemet ind i cellerne. Cas9 og sgRNA blev leveret i et plasmid, mens en DNA-skabelon blevet leveret i form af en enkelt DNA-streng. Ved udnyttelsen af homology directed repair, blev den muterede sekvens erstattet med DNA-skabelonen. Denne strategi fungerede i 13% af sekvenserne i de behandlede celler. Ved ex vivo genkorrektion kunne man forestille sig, at man derefter ville have isoleret en korrekt modificeret celle, sikkerhedstjekket den for potentielt farlige off-target effekter og opdyrket den til en større mængde differentierede celler, der til sidst ville kunne blive transplanteret ind i patientens øje.

    Duchennes muskeldystrofi

    Duchennes muskeldystrofi

    Duchennes muskeldystrofi er en monogen sygdom forårsaget af mutationer i genet DMD, der normalt producerer proteinet dystrofin. Sygdommen har en X-bunden recessiv arvegang, hvilket betyder, at mænd bliver hårdt ramt af sygdommen og at kvinder generelt vil være bærere af sygdommen, eller have mildere symptomer. Omtrent 1 ud af 5000 mænd får denne sygdom. Denne sygdom medfører en alvorlig fremadskridende svækkelse og nedbrydelse af kroppens muskler (skeletmuskulatur, hjertemuskulatur og glatmuskulatur). Sygdomsforløbet starter med mildt motorisk besvær, som udvikler sig til store bevægelsesproblemer og som oftest ender med, at enten hjertemuskulaturen eller de respiratoriske muskler holder op med at fungere. Den gennemsnitlige forventede levetid er 26 år.

    Dystrofin er et aflangt strukturelt protein i muskelvævet, der i samarbejde med andre proteiner har til funktion at forbinde muskelfibrene og beskytte dem mod skader, når de kontraheres og udtrækkes. Proteinet består af et langt stabiliserende domæne, der i begge ender har domæner, der kan forankre sig til andre proteiner. Forsimplet kan man sige, at dystrofin fungerer som et stødabsorberende strukturelement. Komplet mangel på funktionelt dystrofin forårsager Duchennes muskeldystrofi, mens mindre strukturfejl af dystrofin giver den relativt mildere version af sygdommen, kaldet Beckers muskeldystrofi.

    DMD-genet er det største kendte gen i mennesker (2,6 mio. basepar) og er opbygget af 79 exons. Exons er sekvenser, der indeholder kode til det færdige mRNA, mens introns ikke koder for noget. Efter transskription af genet, udskæres alle introns fra pre-mRNA, hvorefter alle exons sammensættes ved en proces kaldet RNA-splicing. De samlede exons udgør det kodende mRNA, som ved translation danner dystrofin. Den normale transskription, RNA-splicing og translation af DMD-genet (exon 47-52) til funktionelt dystrofin, kan ses på figur 29.

    4.3

    Figur 29. Den normale funktion af DMD-genet. Her ses et udsnit af genet, fra exon 47 til exon 52. Transskription danner pre-mRNA, og dannelsen af mRNA fra pre-mRNA sker ved RNA-splicing, hvor introns fjernes og exons samles. mRNA translateres til sidst det funktionelle protein dystrofin, som er essentielt for den normale funktion af muskler.

    Alvorlige mutationer i DMD-genet forårsager Duchennes muskeldystrofi. Mutationerne i DMD er i ca. 60% af tilfældene større deletioner, der medfører frame-shift. Dette giver fuldstændigt dysfunktionelt protein, som forårsager den voldsomme fænotype. I resten af tilfældene, er det andre mutationer, der også medfører frame-shift eller sidder i proteinets vigtige domæner og gør det fuldstændigt dysfunktionelt på den måde. Mere end 3000 forskellige sygdomsforårsagende mutationer er blevet identificeret for sygdommen og mange af disse sidder i hotspots, altså bestemte exons, der er specielt udsatte.

    Beckers muskeldystrofi er knyttet til in-frame deletioner i det lange dystrofin domæne. Her ødelægges læserammen ikke, da der fjernes basepar i et multiplum af 3 nukleotider. Dystrofin bliver derfor kun forkortet og bevarer en lettere reduceret funktionalitet, hvilket betyder, at sygdomsfænotypen bliver forholdsvist mild.

    Den genetiske baggrund for Duchennes muskeldystrofi er kompleks og der er ikke et enkelt genetisk indgreb, der kan kurere sygdommen. Derfor er forskellige CRISPR-baserede strategier blevet afprøvet på de forskellige typer af mutationer. Der vil nu tages et indblik i to strategier, der begge er baseret på at fjerne et segment af genet, der medfører sygdommen. Det vides fra Beckers muskeldystrofi, at in-frame deletioner giver mildere symptomer end frame-shift deletioner, der giver Duchennes muskeldystrofi. Idéen er, at fjerne de exons, der indeholder frame-shift mutationerne med Cas9, hvilket kunstigt vil skabe en in-frame deletion af det givne exon. Man omdanner altså den slemme Duchennes muskeldystrofi til den relativt mildere Beckers muskeldystrofi.

     

    Ex vivo genkorrektion: fjernelse af frame-shift mutationer

    De større deletioner, der medfører frame-shift mutationer, sidder ofte i bestemte hotspot-exons af DMD-genet. Det vigtige for korrektionen af et sådant exon, er at forhindre frame-shift mutationen i at ødelægge proteinet fuldstændigt og i stedet opnå produktion af et funktionelt alternativt dystrofin. En patient ramt af Duchennes muskeldystrofi har en deletion af hotspot exons 48 til 50, der medfører en frame-shift mutation i exon 51, hvormed der dannes et malplaceret stop-codon. Transskription, RNA-splicing og translation af det muterede DMD-gen (exon 47-52) til dysfunktionelt dystrofin, kan ses på figur 30. Bemærk, at dannelsen af et stop-codon, er forårsaget af en forskudt læseramme, grundet frame-shift mutationen, som er en konsekvens af deletionen. Dette betyder, at translationen af dystrofin ikke kan foregå korrekt.

    4.4

    Figur 30. Det muterede DMD-gen hos en patient med Duchennes muskeldystrofi. Her ses et udsnit af genet, fra exon 47 til exon 52. Frame-shift mutationen, som er opstået i exon 51, grundet en deletion af exon 48 til exon 50, forårsager et stop-codon. Transskription danner pre-mRNA, som indeholder et stop-codon, og dannelsen af mRNA fra pre-mRNA sker ved RNA-splicing, hvor introns fjernes og exons samles. Det færdige mRNA indeholder stadigvæk et stop-codon, og translationen stoppes derfor utidigt, hvilket medfører dysfunktionelt dystrofin, som forårsager Duchennes muskeldystrofi. 

    Ved at mutere RNA-splice-sitet mellem det muterede exon og førliggende intron, kan man overspringe brugen af det muterede exon i det færdige mRNA, da RNA-splicing ikke kan foregå normalt. Dermed vil mutationens konsekvens, altså stop-codonet, ikke blive medtaget i det færdige mRNA. Det producerede mRNA vil da kode for en kortere, men fungerende, version af dystrofin, hvormed sygdomsfænotypen bliver mildere. Denne strategi kaldes for exon-skipping, da vi aktivt fravælger brugen af specifikke exons. Dette gøres ved en destruktion af sekvensen, ved udnyttelsen af Cas9 og NHEJ.
    sgRNA blev designet til at ramme grænsen mellem exon 51 og det førliggende intron, hvormed Cas9 introducerede en indel-mutation i RNA-splice-sitet. Dette medførte, at den muterede exon 51 blev ignoreret ved RNA-splicing og at det nye mRNA havde en in-frame deletion af exons 48-51. Herved kunne funktionelt dystrofin produceres, dog ved en reduceret version, der mangler de dele, som er kodet af exon 48-51. Genkorrektion, samt transskription, RNA-splicing og translation af det korrigerede DMD-gen (exon 47-52) til funktionelt dystrofin, kan ses på figur 31.

    4.5

    Figur 31. DMD-genet hos en patient med Duchennes muskeldystrofi, og genkorrektion (exon-skipping) med CRISPR/Cas9. Her ses et udsnit af genet, fra exon 47 til exon 52. Frame-shift mutationen, som er opstået i exon 51, grundet en deletion af exon 48 til exon 50, forårsager et stop-codon. Cas9 anvendes til at destruere dét RNA-splice-site, som håndterer exon 51. Transskription danner pre-mRNA, som indeholder et stop-codon. Dannelsen af mRNA fra pre-mRNA sker ved RNA-splicing, men den muterede exon 51 medtages ikke i samlingen af exons, da den Cas9-inducerede mutation betyder, at RNA-splicing ignorerer den. Det færdige mRNA indeholder ikke et stop-codon, da exon 51 er fjernet ved exon-skipping, og translationen fungerer derfor normalt, hvilket medfører produktionen af en afkortet, men funktionel, version af dystrofin.

    Med denne strategi, er det lykkedes at gendanne produktionen af dystrofin i iPSCs fra menneskelige hjertemuskelceller, hvormed kontraheringsfunktionen af hjertemuskulaturen blev genoprettet. Denne genmodifikation har stort potentiale til tilfælde af Duchennes muskeldystrofi, som er grundet frame-shift deletioner, ved at rette muskelcellerne til at give mildere symptomer. Dette kunne ligge baggrund for en potentiel ex vivo genterapi.

     

    In vivo genterapi i musemodeller: excision

    Sygdomme kan genskabes som modeller i andre organismer, såsom mus. mdx-mussemodellen af Duchennes muskeldystrofi indeholder en mutation i exon 23 af dystrofin genet, som frembringer et uhensigtsmæssigt stop-codon. Dystrofin-proteinet kan derfor ikke translateres færdigt.

    Fjernelse af det muterede exon 23 betyder, at proteinet kan translateres til en forkortet og funktionel version af dystrofin, ligesom det sås i forrige eksempel. Cas9 er blevet anvendt til at udføre en sådan excision af hele exon 23, ved multiplexing med to sgRNA, hvorefter NHEJ kan sammensætte genet. De to stykker sgRNA var designet til at ramme i intron-sekvenserne på hver side af exon 23.
    Genkorrektionssystemet blev leveret ved DNA-baseret levering igennem virale vektorer, som blev indført ved både lokal og systemisk injektion i mussemodellerne. Genkorrektionen er derfor in vivo. Den anvendte virus var adeno-associeret virus, der kun kan indeholde en begrænset mængde DNA, hvormed systemet måtte blive delt op. En mængde virus blev pakket med Cas9, mens en anden mængde virus blev pakket med de to stykker sgRNA.
    Ved brug af denne strategi, kunne dystrofin-produktionen genoprettes i mussemodellerne, hvormed strukturen og funktionen af musklerne blev forbedret. Der blev fundet få uventede bivirkninger, men ved videre optimering af systemets effektivitet og sikkerhed, har Cas9 et stort potentiale som genterapi i denne type genetiske sygdomme.

    Cancer

    CRISPR-teknologi i kræftforskning

    Kræftsygdomme er kritiske og kan medføre mange ubehagelige symptomer, samt have alvorlige konsekvenser, hvis ikke de bliver bekæmpet. Kræftsygdomme kaldes for multifaktorielle, da de kan skyldes sammenspil mellem mange forskellige faktorer, både genetiske og miljømæssige. Disse årsager kan variere meget mellem de enkelte tilfælde og derfor er kræft en meget kompleks sygdom at bekæmpe.
    Anvendelsen af CRISPR-teknologi er interessant indenfor kræftforskning, grundet kræftsygdommenes mange forskellige genetiske forhold, som kan undersøges og forhåbentligt behandles med denne nye lovende teknologi i fremtiden.

    Nogle hovedaspekter i kræftgenetik er onkogener og tumorsuppressorgener, som er enkelte gener, der har en direkte effekt på en kræftsygdoms udvikling.

    Onkogener fremskynder udviklingen af en kræftsygdom. Genet kan være blevet et onkogen, fordi det bliver overekspressioneret, og dermed laver for meget protein, eller, fordi der er opstået en gain-of-function mutation, der giver det resulterende protein en ny kræftfremkaldende egenskab. I begge tilfælde udvikles kræft.

    Tumorsuppressorgener undertrykker normalt kræft, hvormed manglen på generne forårsager kræft. Tumorsuppressorgener kan miste deres effektivitet, fordi de underekspressioneres, og dermed laver for lidt protein, eller, fordi der er opstået en loss-of-function mutation, der fjerner den kræftundertrykkende egenskab fra proteinet.

    Metaforisk, kan man sige, at onkogener er speedere for kræft, som der trykkes hårdere på og tumorsuppressorgener er bremser for kræft, som slippes.

     

    Æggestokkræft

    Æggestokkræft kan opstå i kvinders æggestokke, hvor både ægceller og kvindelige kønshormoner produceres. I Danmark rammer æggestokkræft 553 nye kvinder hvert år. Æggestokkræft kan opstå på baggrund af mange forskellige faktorer, men der vil her tages et blik på DNMT1-genet. DNA methyltransferase 1 (DNMT1) er et vigtigt enzym for den epigenetiske vedligeholdelse af DNA. Enzymets normale funktion er at sætte methyl-grupper på DNA (methylering). Det har vist sig at overekspression af DNMT1, medfører hæmning af tumorsuppressorgener, hvormed disse ikke kan kontrollere cellevæksten. Ukontrolleret vækst af celler er et kendetegn for kræft.

    En destruktion af DNMT1-genet i kræftcellerne kan stoppe hæmningen af tumorsuppressorgenerne, så disse aktivt kan tilbageholde kræften. In vivo genterapi af denne type æggestokkræft er afprøvet i mussemodeller, der er specielt designet til sygdomsmodellering af kræft. Forsøgsmusene har en type mutation, der medfører, at de ikke kan udvikle brisselen, som er et vigtigt organ for immunsystemet. Dette muliggør, at musene let kan transplanteres med fremmet væv, såsom menneskelige kræftceller, hvormed de er meget betydningsfulde forsøgsdyr for kræftforskningen. Forsøgsmusene blev her transplanteret med menneskelige æggestokkræftceller.
    DNMT1-genet er vigtigt for den normale funktion af celler, og derfor ønskes det ikke, at genet bliver destrueret i raske celler. In vivo genterapien skal derfor være målrettet kræftcellerne.  Dette opnås ved sikre sig, at genkorrektionssystemet kun leveres til netop kræftcellerne. DNA-baseret levering blev anvendt, hvor et plasmid kodende for Cas9 og sgRNA blev pakket i nanopartikler, kaldet liposomer. Disse liposomer blev designet til at eftersøge kræftcellerne specifikt. Cas9 blev brugt til at destruere DNMT1-genet i kræftcellerne, ved at designe et stykke sgRNA, der specifikt genkendte DNMT1-genet. Indel-mutationer, dannet ved destruktionen, sørgede for at inaktivere genet.
    Denne strategi kunne succesfuldt hæmme kræftens spredning og dræbe nogle af kræftcellerne. Tilgangen har potentiale som en in vivo genterapi, der kan hæmme udviklingen af æggestokkræft, men der kræves et fortsat stort arbejde i at effektivisere korrektionen, så farlige bivirkninger undgås.

    Komplikationer

    Komplikationer og udfordringer ved genterapi med CRISPR-teknologier

    Komplikationer der findes ved selve CRISPR/Cas9-teknologien er åbenlyse problemer, eksempelvis ineffektivitet af homology directed repair grundet NHEJ. En af de største problemer er off-target effekter, da uventede mutationer kan opstå og give slemme bivirkninger, på grund af den manglende specificitet. Der haves yderligere komplikationer ved brug af CRISPR-teknologi til genterapi, som kort vil belyses her.

     

    In vivo versus ex vivo

    Ex vivo tilgangen er mere kompliceret og krævende end In vivo, grundet vedligeholdelse, dyrkning og tilbagetransplantation af de ekstraherede celler, men In vivo er knyttet til flere etiske problemer, grundet muligheder for nedarvning af genkorrektionerne. Yderligere, er effektiviteten af in vivo genmodificering betydeligt lavere end ved ex vivo genmodificering, hvilket også afhænger af effektiviteten af leveringen. Ex vivo genterapi giver mere mulighed for verifikation af genmodificeringen og der er flere muligheder for kombination med andre teknologier, da In vivo tilgangen er begrænset ved at foregå inde i kroppen. Der kræves mere forskning indenfor geneterapi, før disse tilgange bliver praktisk anvendelige.

     

    Individuel behandling kræver individuelt genterapidesign

    De samme genetiske sygdomme kan være grundet mange forskellige mutationer, hvormed de altså også skal behandles med forskellige genmodifikationer. Dette betyder, at den enkelte patient skal have specifikt designet sin egen genterapi. Dette kan være en stor udfordring for produktionen af de genterapeutiske komponenter, da mange overvejelser skal medtages. Eksempelvis skal hvert eneste sgRNA designes efter hver mutation, der skal rettes og med forbehold for minimale off-target effekter, samt maximal specificitet og effektivitet.

     

    Præcision og effektivitet af levering

    Pakningen af alle komponenterne af et genkorrektionssystem, der skal bruges til genterapi, er et problem for både DNA-, RNA- og protein-baseret levering. I DNA-baseret levering under brug af virale vektorer, kan man blive nød til splitte systemet op i flere viruspartikler. En udfordring ved protein-baseret levering er pakningen af det store Cas9-protein sammen med både sgRNA og en eventuel DNA-skabelon. Ved in vivo genterapi kræves der større kontrol over hvor genkorrektionssystemet havner, både ved systemisk og lokal injektion. Et andet aspekt er størrelsen af den dosis af Cas9 og sgRNA, der er nødvendig for at sygdommen kan kureres.

     

    Immunologisk respons på CRISPR/Cas9

    En vigtig pointe for brugen af CRISPR-teknologi i mennesker er, at Cas9 stammer fra en bakterie, hvormed man må forvente at immunsystemet reagerer. Fremmede proteiner skal overvåges af immunsystemet, da de kan være potentielt farlige. Cas9-proteinet kan blive elimineret af immunsystemet, men ydermere kan selve menneskeceller, der udtrykker Cas9-proteinet, blive dræbt. Ved brugen af DNA- og RNA-baseret levering forventes et større immunologisk respons end ved protein-baseret levering. Dette er grundet den aktive ekspression af det fremmedartede Cas9 i cellerne, fra det indførte DNA eller RNA, som kan være længerevarende. Tilstedeværelse af Cas9 er mere kortvarig ved brug af protein-baseret levering, da der ikke produceres mere Cas9 end der er blevet indført. Den kortvarige tilstedeværelse giver mindre mulighed for et immunologisk respons. Ydermere, kan indført Cas9-kodende DNA integrere sig permanent i cellernes DNA. Ved brugen af virale vektorer kan der især forventes et immunologisk respons, grundet viruspartiklernes patogene natur.

  • Case 4 - Gene drives til genmodifikation af populationer

    Genetik og gene drives

    Gene drives og automatisk genmodificering af hele populationer

    CRISPR-teknologi tillader dannelsen af et utroligt magtfuldt genetisk værktøj, der kan genmodificere hele populationer ved en kædereaktion af mutationer. Dette genetiske værktøj kaldes for et gene drive og udnytter CRISPR/Cas9-genmodificering, til at manipulere genetikken bag nedarvning af gener.

    Genetik

    I den eukaryote genetik ses oftest diploide organismer, hvilket betyder, at de har to kopier af hver kromosomtype. Disse sammenhørende kopier kaldes homologe kromosomer. Hver kopi stammer fra hver af forældrene, hvormed de sandsynligvis er forskellige. Idet der haves to kopier af hvert kromosom, haves der også to kopier af hvert gen. Disse to kopier kaldes allelerne, og kan være forskellige, hvormed de koder for forskellige egenskaber af det samme gen. Haves to ens alleler er organismen homozygot, men hvis der haves to forskellige alleler, er organismen heterozygot. Allelernes ekspression kan beskrives som recessiv eller dominant. Er organismen heterozygot vil dominante alleler komme til udtryk i fænotypen, mens recessive ikke vil. Hvis organismen er homozygot, er allelerne ens og den delte egenskab kommer til udtryk. Placeringen af genet på kromosomet, og dermed allelerne, kaldes for locus.

    Et eksempel på denne type genetik kunne være blodtyper. Der haves ét gen, der koder for blodtypen. På hvert homologe kromosom sidder en allel af dette gen. Der findes 3 forskellige alleler: A (dominant), B (dominant) og 0 (recessiv). Man kan have én allel på hver af de 2 homologe kromosomer. De forskellige alleler er placeret i kromosomernes ABO-locus. Lad os anskue 3 eksempler på kombinationer:

    Den ene allel koder for A-blodtype (dominant), mens den anden koder for 0-blodtype (recessiv), hvormed personen udtrykker blodtype A. Disse koder for hver sin blodtype, hvormed der er tale om en heterozygot, men blodtype A er dominant og kommer til udtryk.

    Begge alleler koder for 0-blodtypen (recessiv), hvormed personen udtrykker blodtype 0. Dette kan kun lade sig gøre, fordi der er tale om en homozygot med recessive alleler. Der er ingen dominant allel tilstede, der kan dominere over det recessive udtryk.

    Haves en allel for A-blodtype (dominant) og en allel for B-blodtype (dominant), haves en speciel situation, der kaldes codominans. Her udtrykker personen blodtype AB, altså både A og B.

    Nedarvning

    Gener er dynamiske og udveksles mellem organismer på flere måder. Normalt ses, at gener nedarves efter de Mendelske arvelove, som beskriver videredistribution af gener mellem generationer. Fordelingslovene siger, at generne nedarves tilfældigt med lige stor sandsynlighed til hvert afkom og uafhængigt af hinanden.

    Mendels 1. lov – udspaltningsloven: Ved dannelsen af afkom adskilles allelerne fra hinanden, og afkommet arver én allel fra faderen og én allel fra moderen. Hver af de to nedarvede alleler kan være hver af forældrenes to alleler, med lige stor sandsynlighed. Dermed fordeles hver af to sammenhørende alleler med 50% sandsynlighed til afkom.

    Mendels 2. lov – uafhængig udvælgelse: Alleler af forskellige gener på forskellige kromosomer fordeler sig uafhængigt.

    Som med de fleste andre regler, findes der selvfølgelig undtagelser, herunder gene drives.

    Gene drives

    Gene drives er et opgør mod den Mendelske nedarvning af gener, da disse har til formål at fremme nedarvningen af specifikke alleler. Man kan sige, at der er tale om tvunget nedarvning af specifikke alleler til alt afkom, hvilket kaldes super-Mendelsk nedarvning.
    Gene drives er selviske alleler, der eftersøger bestemte sekvenser, som de kan kopiere sig selv ind i, hvormed de ødelægger den oprindelige sekvens. De spreder sig selv ved udnyttelse af organismens funktioner. Yderligere, kan gene drives bære på selvvalgte alleler, der koder for en given ny egenskab eller en anden genetisk ændring. Disse alleler behøver nødvendigvis ikke at være til gavn for organismen. Gene drives kan på denne måde implementere genetiske ændringer i hele populationer, ved tvunget spredning igennem den naturlige nedarvning af gener igennem generationer.

    Ansku den normale Mendelske nedarvning af gener som et møntkast, hvor der er 50% sandsynlighed for enten plat eller krone. På samme måde som et møntkast, nedarves én af hver af forældrenes to alleler tilfældigt. Gene drives svarer til en mønt, der altid giver dig den side af mønten du ønsker. Gene drives fjerner tilfældigheden for, om det bliver den ene eller anden allel og bestemmer, at det altid bliver den designede gene drive allel, der tvinges igennem. Dermed er der teoretisk set 100% sandsynlighed for nedarvning, fremfor 50%.

    Dette foregår ved, at gene drive alleler i et heterozygot individ kopierer sig selv over på den anden allel, og dermed skaber et individ, som er homozygot for gene drive allelen. Dette sker for alle individer, der nedarver allelen. På figur 32 ses hvordan et gene drive overrumpler den naturlige Mendelske nedarvning, ved at overskrive de naturlige alleler og skabe homozygoter, som altid videregiver gene drive allen, og hvordan dette manipulerer nedarvningsmønsteret til at sikre gene drive allelens nedarvning.

    Figur 32. Normal Mendelsk nedarvning sammenlignet med super-Mendelsk nedarvning, som ses ved anvendelsen af gene drives. 

    Gene drives kan bruges til at lave gen knock-outs og knock-ins af selvvalgte gener på hele populationer. Denne mutageniske proces er før blevet kaldt Mutagenic Chain Reaction (MCR), grundet sin automatiske og selvopretholdende dannelse af mutationer, som spreder sig som en kædereaktion igennem populationen. Baseret på konsekvenserne af genmodificeringerne på populationen, kan man inddele gene drives i to typer:

    Modification drives: designes med formålet om at modificere en population, eksempelvis ved at sprede specifikke gener blandt populationen. Disse gener kan give organismerne nye egenskaber, både fordelagtige og ugunstige.

    Suppression drives: designes med det simple formål at reducere eller fuldkommen eliminere en population, eksempelvis ved ødelæggelse af essentielle gener eller frembringelse af infertilitet.

    Anvendelser

    Anvendelser

    Gene drives er især brugbare inden for sundhed, miljø og landbrug. Mange forskellige arter kan have negative indvirkninger på miljøet og mennesker, såsom ved at forårsage sygdomme, ødelægge afgrøder eller true andre oprindelige arter. Derfor er det en attraktiv idé, at kunne kontrollere hele populationers skæbne ved selvopretholdende genetisk manipulering. Gene drives designes til den specifikke situation med forskellige genetiske komponenter, således at de fungerer optimalt i forhold til det givne formål. Genteknologien er utroligt effektiv og magtfuld, hvormed et stort ansvar hører med. En vigtig overvejelse er, at når først et gene drive er blevet sluppet løs i en population, så kan man ikke vende tilbage til den fuldkommen naturlige genotype igen, hvis gene drivet er effektivt og bliver implementeret i hele populationen. Man kan dog sprede nye gene drives, der har til formål at genoprette den forhenværende fænotype.

    Forhindre vektorbårne sygdomme

    Disse sygdomme spredes ved overførsel fra en organisme til en anden. Man kan stoppe disse sygdomme ved eksempelvis at eliminere organismen, der medfører smitten til mennesker, med suppression drives, eller forhindre, at organismen kan indeholde sygdommen med modification drives. Eksempler på vektorer for nogle kendte menneskelige sygdomme er:

    Flåter (f.eks. borreliose og flåtbåren-hjernebetændelse).

    Lus (f.eks. skyttegravsfeber og tyfus).

    Lopper (f.eks. pest og tyfus).

    Myg (f.eks. malaria, denguefeber, gul feber, Vestnil-virusinfektion og zika-virusinfektion).

     

    Udrydde invasive arter eller skadedyr

    Fremmede arter kan påvirke økosystemer betydeligt, ved at sætte det ud af balance, eksempelvis ved at udkonkurrere andre oprindelige arter. Suppression drives er her smarte til at eliminere den skadelige population.
    Der løbes flere risici ved brugen af suppression drives til bekæmpelsen af disse arter. Invasive arter har også naturlige levesteder og er selv lokale arter, der hvor de stammer fra. Inden man dumdristigt udslipper et suppression drive, der langsomt udrydder den invasive population, må man sikre sig, at populationen ikke kan sprede sig tilbage til sit oprindelsessted. Ellers kunne man hurtigt komme til at udrydde en hel dyreart, hvilket kunne gå hen og blive en større økosystemisk katastrofe. Yderligere, må man sikre sig, at der ikke kan ske parring mellem invasive arter og lignende naturlige arter, så gene drives ikke ender i forkerte populationer. Eksempler på invasive arter i Danmark:

    Kæmpebjørneklo – stammer fra Kaukasus og importeret til botaniske haver i 1830’erne.

    Iberisk skovsnegl (dræbersnegl) – stammer fra Sydvesteuropa og introduceret igennem import af jord og planter i 1990’erne.

    Mink – stammer fra Nordamerika og importeret til pelsproduktion i 1920-30’erne.

    Mårhund – stammer fra Østasien og udsat i Sovjetunionen som pelsdyr i 1928-1958.

     

    Fjerne resistens overfor pesticider

    Indenfor landbrug, kan det være et problem, at ukrudt og skadedyr bliver resistente overfor de pesticider, der anvendes til at bekæmpe dem med. Modification gene drives kan bruges til at fjerne resistens-alleler, hvormed sårbarheden overfor pesticiderne kan genoprettes. En anden mulighed er at gøre organismerne sensitive overfor nye stoffer, som normalt ikke påvirker dem. På denne måde kan man ramme specifikke arter mere målrettet og potentielt anvende stoffer, der ellers er ugiftige. Eksempler på skadelige arter i det danske landbrug:

    Meldug (svampesygdom)

    Bladlus

     

    Forbedre overlevelsesraten for truede dyrearter

    Epidemier kan også opstå blandt dyr og hvis disse populationer allerede er sårbare, kan det resultere i artens udryddelse. Gene drives kan potentielt set anvendes til at redde disse truede arter, ved at sprede beskyttende gener.
    Chytridiomycosis er en infektionssygdom, der rammer padder og skyldes en svamp (Batrachochytrium dendrobatidis). Paddepopulationer er blevet pludseligt hårdt ramt og man mener, at nogle artsudryddelser er forbundet med sygdommen. Det er blevet foreslået, at man kunne sprede et gene drive, som kunne forhindre chytridiomycosis, hvormed truede paddearter kunne have en større chance for at overleve.

    Figur 33. Skovflåten (Ixodes ricinus) kan overføre bakterien Borrelia burgdorferi til mennesker igennem sit bid. Dette kan forårsage borreliose, som er en farlige infektionssygdom.

    Figur 34. Den gyldne tudse (Incilius periglenes) blev erklæret uddød i 1989. Man mener at infektionssygdommen Chytridiomycosis, kan have været en af årsagerne. Sygdommen rammer padder og skyldes svampen Batrachochytrium dendrobatidis.

    Funktionsmekanismer

    Funktionen af Cas9-baseret gene drives

    Gene drives fungerer ved at udføre konstante automatiske genmodifikationer, som sikrer, at gene drivet nedarves. Det er en gennemgående strategi for gene drives at designe en modificeret allel, der indeholder et system, som forårsager tvunget nedarvning af sig selv.  Hvis gene drive allelen nedarves som en af allelerne, kopierer den sig selv over på den anden allel. De fungerer ved at indeholde et gen for en endonuklease, der kan redigere i allelerne. Et optimalt valg af endonukleasen er Cas9 fra CRISPR-systemet. Sådanne gene drives består af forskellige komponenter:

    Cas9, som bruges til at klippe i de målsøgte alleler, så gene drivet kan indsættes deri.

    gRNA, som bruges af Cas9 til at udvælge de målsøgte alleler og som definerer hvor indsættelsen af et gene drive foregår.

    Homologe sekvenser i hver ende, til indsættelse af gene drivet ved homology directed repair (HDR). Disse sekvenser er homologe til sekvenserne på hver side af indsættelsesstedet.

    Payload gen, som er selve genet man tvinger til at blive nedarvet. Dette selvvalgte gen kan kode for alverdens nye egenskaber, fordelagtige og ugunstige, eller ligefrem forårsage at populationen uddør. Bruger man et payload gen, foretages altså et knock-in. Denne er ikke et nødvendigt element, hvis man blot vil lave et gene drive, der skal kopiere sig ind og udføre et knock-out af et bestemt gen.

    Designet af denne type gene drive er baseret på funktionen af Cas9-proteinet. Funktionsmekanismen afhænger af identifikationen og spaltningen, som Cas9 kan udføre. Dette tillader, at gene drivet målrettet kan søge efter positionen, hvor det skal integreres og samtidigt danne et dobbeltstrengsbrud i DNA-strengene i netop den præcise position. Funktionen afhænger også af cellens egen mulighed for at lave homology directed repair (HDR), da den tvinges til at lave en insertion af gene drive allelen i dobbeltstrengsbruddet ved brug af de homologe sekvenser. Mekanismen kan ses på figur 35 og beskrives med de følgende trin.

     

    Funktionsmekanisme: spredning af et gene drive

    1. Nedarvning af gene drive allel: Heterozygot
      Gene drive allelen nedarves ved normal Mendelsk nedarvning. Der dannes altså først heterozygot afkom, der har én normal allel af et givent gen, samt gene drive allelen.
     
    1. Aktivering af gene drive
      Genmodificeringskomponenterne udtrykkes fra gene drivet. Cas9 dannes og binder det selvvalgte gRNA, så det er parat til at identificere den modsvarende eftersøgte allel.
     
    1. Cas9 klipper den modsvarende allel
      Cas9 identificerer den modsvarende allel ud fra det givne gRNA og danner et dobbeltstrengsbrud.
     
    1. Gene drive overkopieres ved homology directed repair (HDR): Homozygot dannes
      Gene drive allelen kopieres til den modsatte allel, hvormed den originale allel bliver ødelagt. De homologe ender anvendes til indsættelsen af en kopi af gene drive allelen ved HDR i dobbeltstrengsbruddet, som blev dannet af Cas9. Herved er der dannet en homozygot organisme. Hvis der haves et payload gen, sidder dette inde i gene drive allelen, hvorfra det nu bliver udtrykt fra begge alleler og varetager den ønskede fænotypiske påvirkning af organismen. Da organismen nu er homozygot, vil afkommet teoretisk set nedarve gene drive allelen uanset hvad, da begge mulige nedarvelige alleler er gene drive allelen. Således vil afkommet modtage en gene drive allel og blive en heterozygot til at starte med, hvorefter gene drive allelen igen vil kopiere sig over og overtage genet ved dannelsen af en homozygot. Mekanismen betyder, at så snart gene drive allelen er nedarvet og den har kopieret sig selv over, vil de næste generationer teoretisk set kun kunne nedarve gene drive allelen. På denne måde gentager processen sig selv.
    5.2

    Figur 35. Funktionsmekanismen af et Cas9-baseret gene drive. Organismen har nedarvet gene drive allelen fra en forældre og er derfor først heterozygot for gene drive allelen. Gene drivet aktiveres, hvormed Cas9 og sgRNA bliver udtrykt fra deres gener. Cas9 danner et dobbelstrengsbrud i den modsvarende naturlige allel mellem to sekvenser (H1 og H2), der er homologe til sekvenser i gene drive allelen, hvilket tillader at homology directed repair (HDR) kan overføre gene drivet. I sidste ende bliver organismen homozygot for gene drive allelen. Et selvvalgt payload gen udtrykkes fra gene drive allelen, og medfører en bestemt egenskab hos organismen (for eksempel sterilitet).

    Funktionsmekanisme: implementering af et gene drive

    For at et gene drive skal kunne spredes i en population, må man først introducere det til ét eller flere individer i populationen til at begynde med. Man kan Indføre en gene drive allel i en population i form af et plasmid. Dette plasmid skal indeholde gene drive allelen, med alle sine komponenter, så den kan kopieres direkte videre. Denne levering fra et plasmid sker kun én gang, da gene drivet derefter spreder sig selv ved den normale mekanisme, som blev beskrevet ovenfor, og dermed bliver videregivet til de kommende generationer. Cas9 og HDR anvendes til at modificere gene drive allelen fra plasmidet ind i den målsøgte allel, ved den samme grundlæggende mekanisme som beskrevet ovenfor. Implementeringen kan ses på figur 36, og beskrives trinvist herunder.

    1. Aktivering af gene drive
      Komponenterne bliver udtrykt fra gene drive allelen i plasmidet.
     
    1. Cas9 klipper i en eftersøgt allel
      Cas9 identificerer den modsvarende allel ud fra det givne gRNA og danner et dobbeltstrengsbrud.
     
    1. Gene drive indføres ved homology directed repair (HDR)
      Homologe ender anvendes til at indsætte gene drivet i organismens kromosom. Herfra kan gene drivet selv arbejde sig videre til modsatte allel, hvorefter det er klart til at blive nedarvet og sprede sig blandt populationen.
    5.3

    Figur 36. Implementering af et Cas9-baseret gene drive ved et plasmid. Organismen kunne eksempelvis være homozygot for en given naturlig allel. Plasmidet overføres til organsimen og gene drivet aktiveres, hvormed Cas9 og sgRNA bliver udtrykt fra deres gener. Cas9 danner et dobbelstrengsbrud i den naturlige allel mellem to sekvenser (H1 og H2), der er homologe til sekvenser i gene drive allelen, hvilket tillader at homology directed repair (HDR) kan overføre gene drivet fra plasmidet. Efter overførslen bliver organismen heterozygot for gene drive allelen. Herefter vil gene drive allelen kopiere sig over på den modsvarende allel, som beskrevet i figur 35. Et selvvalgt payload gen udtrykkes fra gene drive allelen, og medfører en bestemt egenskab hos organismen (for eksempel sterilitet).

    Populationskontrol

    Strategier for populationskontrol

    For at designe et optimalt gene drive, skal flere aspekter gennemtænkes. I forhold til anvendelsen af gRNA, vil man gerne ramme en sekvens, der ikke varierer mellem populationen og er unik i genomet. Dette sikrer, at man kun rammer sekvensen man ønsker og at dette bliver gjort i flest muligt individer.

     

    Modification drive

    Ved anvendelsen af modification gene drives, ønskes det sandsynligvis ikke at populationens størrelse skal ændres. Man må derfor analysere, hvordan modificeringen påvirker individerne, i forhold til resten af populationen. Man vil gerne sikre sig, at gene drivet ikke giver en stor ulempe, så det ikke spredes, men samtidigt ikke giver populationen store fordele, således at den vokser ud af normale proportioner. Gene drives skal på balanceret vis både have en ønsket virkning på populationen og kunne spredes effektivt.

     

    Suppression drive strategier

    Man kan anvende Cas9 til at lave et suppression drive, der ødelægger alle alleler af et specifikt gen og dermed forårsager en loss-of-function mutation i organismen. Hvis eksempelvis et suppression drive blot slår værtsorganismen ihjel med det samme, vil det ikke kunne nå at sprede sig og derfor vil det være en meget ineffektiv påvirkning af hele populationens størrelse. Der skal anvendes mere snedige og delikate metoder til at neddæmpe en population. En effektiv metode er at gå efter hunnerne i en population, da populationer ofte afhænger af hunnernes produktivitet. Dette kan gøres ved at påvirke kønsratioen, hvor man enten dræber hunnerne eller sørger for, at afkom oftere bliver hanner. Det er også muligt at gøre hunnerne sterile.

    Udryddelse af malariamyg

    Gene drives til udryddelse af malaria

    Malaria forårsages af parasitter tilhørende familien Plasmodium, som kan spredes til mennesker ved hjælp af malariamyg, såsom Anopheles gambiae. Malariaparasitternes livscyklus består af forskellige stadier og værtsorganismer. Menneskekroppen fungerer primært som leve- og reproduktionssted, mens myggen anvendes til udklækning og udvikling af parasitten, samt fungerer som vektor for sygdommen. I mennesker invaderer parasitten leverceller og blodceller, og dens tilstedeværelse giver en masse komplikationer for den ramte. De typiske symptomer er feber, hovedpine, muskelsmerter, diarre, opkast og respirationsproblemer, men hvis malaria forbliver ubehandlet, kan det resultere i alvorlig hjernemalaria, blodforgiftning og blodmangel. Alle typer af malaria kan behandles med medikamenter, men uden behandling er sygdommen ofte dødelig. Malaria forårsagede i år 2016 omkring 445.000 dødsfald og 216 millioner var smittet. Spredningen af malaria kan formodentlig forhindres med gene drives, ved at stoppe udviklingen af parasitten, eller ved at reducere myggepopulationen, der spreder parasitten.

     

    Suppression drive: Infertile hunmyg

    Man har udviklet et suppression drive for malariamyggen A. gambiae, der medfører at hunnerne bliver infertile, hvormed populationen vil bryde sammen. Hvis hunmyggene er infertile så snart de har gene drivet, så kan de ikke reproducere. Dette ville være ineffektivt, da gene drivet så ikke ville kunne spredes i populationen, fordi hunmyggene ikke kan få afkom. Derfor blev gene drivet snedigt designet til at medføre recessiv infertilitet hos de berørte hunmyg. Her udnyttes en recessiv allel samt, at kønsceller og somatiske celler er forskellige. Man kan sige, at kønscellerne indeholder den genetik der nedarves, mens de somatiske celler indeholder den genetik der definerer den enkelte organisme – det er kropscellerne. Gene drivet medfører, at de somatiske celler forbliver heterozygote med det recessive gene drive, således at myggene ikke er infertile og kan producere afkom. Samtidigt bliver kønsceller homozygote for gene drivet i alle myggene, således at det altid videregives til afkom. Først når to myg, der begge bærer gene drivet, får afkom, vil der dannes homozygote somatiske celler, sådan at hunmyggene i afkommet bliver infertile. Der kræves altså teoretisk set mindst 2 generationer, før de første gene drive fænotyper kan træde i kraft. På denne måde sikres at gene drivet har en mulighed for at spredes i populationen, før selve suppressionen indtræder. Denne strategi ses på figur 37.

    Figur 37 – Gene drive strategi til suppression af malariamyggen Anopheles gambiae. Gene drives leveres til myggene ved genmodifikation, eksempelvis via et plasmid. Herefter spreder det sig i populationen igennem den normale parring. Dette gene drive medfører recessiv infertilitet hos hunmyg, hvilket tillader at gene drivet kan sprede sig igennem flere generationer, før fænotypen træder i kraft og forårsager infertilitet.

    Komplikationer

    Komplikationer og begrænsninger

    Der skal ikke herske tvivl om, at gene drives er en utroligt kraftfuld og effektiv genteknologi, der med sin funktionsmekanisme kan sprede sig selv autonomt, når de først er blevet sluppet fri. Teoretisk set virker gene drive systemet perfekt, men der er altid begrænsninger og fejl, der kan forekomme. Cas9 har i sig selv begrænsninger, såsom off-target effekter, der begrænser mulighederne og præcisionen af gene drives. Et gene drives specificitet afhænger fuldkommen af specificiteten af gRNA-styret Cas9, og designet af gRNA er derfor vigtigt.

     

    Resistens mod gene drive alleler

    Når Cas9 danner et dobbeltstrengsbrud, skal man huske, at flere mekanismer kan gribe ind. Hvis gene drives skulle fungere fuldkommen effektivt, skulle HDR være den eneste aktive reparationsmekanisme og den skulle indkopiere gene drive allelen hver eneste gang. NHEJ er stadigvæk en betydelig reparationsmekanisme, der kan gribe ind, hvormed mutationer kan opstå (indels). I så fald, vil allelen blive immun overfor gene drivet, da Cas9 ikke kan genkende sekvensen længere. Da gene drive allelen ikke kan indsættes, vil organismen ikke blive homozygot og derfor er der ikke sikret videre nedarvning af gene drive allelen. Spredningen bliver hæmmet.

     

    Gene drives er designet til at udnytte seksuel reproduktion

    Gene drives kan kun bruges i organismer, der er seksuelt reproducerende, som mange dyr er. Organismer der udelukkende reproducere aseksuelt, eksempelvis ved at danne kloner af sig selv, bliver ikke berørt. Her menes virus, bakterier og mange andre encellede organismer. Da de ikke udveksler genetisk materiale på samme systematiske måde, der ses ved seksuel reproduktion, ville gene drivet ikke kun sprede sig gennem populationen på samme måde.

     

    Gene drives kræver spredning gennem mange generationer

    For at en gene drive allel kan sprede sig til en hel population, skal den først videregives igennem en masse generationer. Derfor spreder gene drives sig langsomt i organismer, der formerer sig langsomt, der får lidt afkom og der lever længe, eksempelvis mennesker. Derimod spreder gene drives sig meget hurtigt i organismer, der formerer sig meget, der får meget afkom og der lever kort tid, såsom myg. Yderligere, kan populationsinddelinger, hvor der ikke formeres på tværs af grupperinger, forhindre at gene drives kan sprede sig til hele populationen.

     

    Kontrol og sikkerhed

    Da gene drives spreder sig selv efter at de er blevet udsat, er det klart, at det er favorabelt at kunne stoppe spredningen, hvis gene drivet er løbet løbsk og forårsager noget uventet i populationen eller økosystemet. Gene drives kan eksempelvis sprede uønskede egenskaber ved opstandelsen af nye mutationer, der kunne ændre gene drive allelen. Ukontrollerede gene drives kan have alvorlige konsekvenser, såsom udryddelse af hele arter. Hvis blot én enkelt organisme med gene drive allelen slipper fri eller undgår inddæmning, kan gene drivet sprede sig på ny. En mulig metode er dannelsen af et reverse gene drive, der eftersøger det gamle gene drive og neutraliserer det. Dette betyder dog ikke, at skader på økosystemet fjernes, og at genetablering af den gamle orden er mulig. En anden metode er dannelsen af et immuniserende gene drive, der omkoder den eftersøgte allel for det gamle gene drive, og forhindrer, at det kan kopiere sig ind. Regulering og restriktioner kræves indenfor gene drive teknologien, da de ellers kan anvendes til skadelige og selviske formål, i værste tilfælde bioterrorisme. Der er også altid en risiko for, at modificerede organismer undslipper et laboratorium. Gene drives bør anvendes med stor omtanke og respekt, samt med grundig foreløbig risikovurdering.

  • Opgaver - Teoretiske spørgsmål (Grundteori)

    Opgave 1: Generelle spørgsmål

    Nedenfor er nogle spørgsmål, der berører nogle af de mest centrale ting. Du kan besvare alle spørgsmål ud fra afsnittet Grundteori – CRISPR/Cas9.

    a. Proteinet, der kan genkende og klippe i DNA: _________________

    b. Komponenten, som proteinet bruger til genkendelse af DNA: _________________

    c. Angiv den normale PAM-sekvens: _________________

    d. Hvor mange nukleotider bruges til at genkende en specifik DNA-sekvens: _________________

    e. Reparationsmekanismen, som sammensætter enderne af et DNA-dobbeltstrengsbrud og kan danne ødelæggende mutationer: _________________

    f. Proteinet danner dobbeltstrengsbruddet mellem disse to basepar efter PAM-sekvensen: _________________

    g. Skriv den komplementære DNA-sekvens til: 5’-AGCGTATG-3’: _________________

    h. Oversæt den nye komplementære sekvens til dens komplementære RNA-sekvens: _________________

    i. Reparationsmekanismen, der udnyttes til indsættelse af større DNA-sekvenser: _________________

    Opgave 2: Teoretiske spørgsmål

    Nedenfor er nogle mere dybdegående forklaringsspørgsmål, som kan hjælpe med at opklare nogle af de centrale teoretiske elementer. Du kan besvare alle spørgsmål ud fra afsnittet Grundteori – CRISPR/Cas9.

    a. Dobbeltstrengsbrud og reparationsmekanismer
    1) Hvad er et dobbeltstrengsbrud?

    2) Beskriv hovedforskellene på NHEJ og HDR.

    3) Hvorfor sikrer NHEJ mutationsdannelse, hvis der laves dobbeltstrengsbrud med Cas9 på ét enkelt sted?

     

    b. Cas9 og identifikation
    1) Hvad er gRNA?

    2) Hvad er en PAM-sekvens?

    3) Beskriv kort identifikationsprocessen med Cas9, gRNA, PAM-sekvensen og den eftersøgte DNA-sekvens.

     

    c. Molekylære strategier og genfunktioner
    1) Hvad er multiplexing?

    2) Beskriv kort forskellen på en insertion og erstatning af DNA-sekvens.

    3) Forklar en loss-of-function mutation.

    4) Forklar en gain-of-function mutation.

     

    d. Leveringsmetoder
    1) Hvilken leveringsmetode er uafhængig af cellens translationsmekanisme?

    2) Hvilken leveringsmetode er afhængig af aktiv transskription?

     

    e. Komplikationer
    1) Hvorfor er off-target effekter farlige?

    2) Hypotetisk set, beskriv og forklar om du forventer større eller mindre risiko for off-target effekter ved hver af følgende:

    En længere PAM-sekvens

    En kortere genkendelsessekvens (<20 nukleotider) på gRNA

    Genmodificering i et ekstremt stort genom

    Ved brug af mange gRNA til at ramme forskellige sekvenser i samme celle (multiplexing)

    Opgave 3: Trinvis sgRNA-design og Cas9 dobbeltstrengsbrud

    Nedenfor er en teknisk opgave – du skal selv designe sgRNA og lave et dobbeltstrengsbrud med Cas9. Du kan besvare alle spørgsmål ud fra afsnittet Grundteori – CRISPR/Cas9.

    5’-AACAAGTACATCACTAGATGATCTAAGAGGTCAATAACACACTCTAAGATGATACTAACTAATTATC-3’
3’-TTGTTCATGTAGTGATCTACTAGATTCTCCAGTTATTGTGTGAGATTCTACTATGATTGATTAATAG-5’

    a. PAM-sekvens
    Find og markér PAM-sekvensen for Cas9, så positionen for dobbeltstrengsbruddet kan bestemmes.

     

    b. Identifikation
    Find og markér de 20 nukleotider, som Cas9 bør kunne genkende ud fra denne PAM-sekvens.

     

    c. sgRNA-design
    Angiv den tilsvarende RNA-sekvens, som bruges i sgRNA, for at Cas9 kan genkende DNA-sekvensen: ________________________________________

     

    d. Dobbeltstrengsbrud
    Nu da du har designet sgRNA, kan Cas9 binde sig til dét og bruge det til at genkende DNA-sekvensen. Angiv placeringen af dobbeltstrengsbruddet.

    De korrekte svar til opgaverne kræver læreradgang og findes under fanen ‘Undervisning’ > ‘Lærervejledninger’. Adgang til disse tilsendes til lærere efter henvendelse over mail til: biotech@bio.dtu.dk

    Alle opgaver kan downloades som pdf her: CRISPR-Cas9 – Opgaver

  • Opgaver - Mammut DNA (Grundteori)

    Mammut DNA

    Et stykke over den nordlige polarcirkel ligger Wrangeløen isoleret i det sibiriske ishav. Øen blev opdaget i den sidste del af 1800-tallet, efter man havde hørt om dens eksistens fra et urfolk, kaldet tjukterne. Efter flere ekspeditioner, har man fundet ud af, at øen har vrimlet med mammutter frem til 1700 f.Kr. Der betyder, at mammutterne er uddøde godt og vel 1000 år, efter at Pyramiderne i Giza blev bygget, for at sætte det i perspektiv. Man regner med, at denne mammutpopulation var den sidste til at overleve og dermed kan man være heldig at finde velbevarede eksemplarer. Disse indeholder DNA, som kan isoleres, oprenses og sekventeres. Dermed kan man også anvende CRISPR/Cas9 til at behandle det med. Alt dette ligger til grundlag for ”Woolly Mammoth Revival” projektet, der har til mål at genskabe levedygtige mammutter ud fra disse DNA-prøver. Et udsnit på 47 bp af DNA fra en omtrent 4060 år gammel mammut fra Wrangeløen er vist herunder, og nu er det din opgave at bruge CRISPR/Cas9 til at klippe i det. Du kan besvare alle spørgsmål ud fra afsnittet Grundteori – CRISPR/Cas9.

         1                                             47
5’ - AAAGGCAGCTACTAATCTAAGATGTGCCTTGATGAGCACCTCAAGGC - 3’ 
3’ - TTTCCGTCGATGATTAGATTCTACACGGAACTACTCGTGGAGTTCCG - 5’

    a. Find alle PAM-sekvenserne som kan genkendes af Cas9 fra pyogenes.

     

    b. Brug nu PAM-sekvensen længst mod 3’-enden på den øverste DNA-streng. Find de 20 nukleotider, der skal indsættes i sgRNA, der kan anvendes til genkende mammut DNA-sekvensen. (Hint: ’Design af sgRNA’)

     

    c. Nu skal du bruge dit designede sgRNA til at klippe DNA’et over ved brugen af Cas9.
    Angiv hvor på DNA-strengene, at Cas9 vil binde og vis det forventede sted, hvor dobbeltstrengsbruddet vil blive lavet. (Hint: ’Beskrivelse af Cas9-proteinet og identifikation af en specifik DNA-sekvens’)

     

    d. En ny prøve af mammut DNA er blevet oprenset, men denne har en lidt anderledes sammensætning af DNA-sekvensen, grundet en punktmutation. Mutationen i DNA-sekvensen er vist med rød. Forklar om du tror, at du ville kunne genbruge dit sgRNA til at lave et dobbeltstrengsbrud med Cas9.

    5’ - AAAGGCAACTACTAATCTAAGATGTGCCTTGATGAGCACCTCAAGTC - 3’ 
3’ - TTTCCGTTGATGATTAGATTCTACACGGAACTACTCGTGGAGTTCAG - 5’

    e. Endnu et eksemplar blev fundet, men her sås en anden mutation. Forklar om du tror, at du kan bruge dit sgRNA her.

    5’ - AAAGGCAACTACTAATCTAAGATGTGCCTTGATGAGCACCTCAAGGC - 3’ 
3’ - TTTCCGTTGATGATTAGATTCTACACGGAACTACTCGTGGAGTTCCG - 5’

    De korrekte svar til opgaverne kræver læreradgang og findes under fanen ‘Undervisning’ > ‘Lærervejledninger’. Adgang til disse tilsendes til lærere efter henvendelse over mail til: biotech@bio.dtu.dk

    Alle opgaver kan downloades som pdf her: CRISPR-Cas9 – Opgaver

  • Lærervejledning

    Lærerinformation

    Undervisningsmaterialet henvender sig til 3.g klasser med bioteknologi A, da det forudsætter at eleverne har en vis viden omkring forskellige bioteknologiske grundområder. Undervisningsmaterialet kan dog også fungere i en nysgerrig og faglig kompetent 2.g klasse. Det er anbefalet, at eleverne har en forståelse for:

    Genetik (genstruktur, mutationer, nedarvningsprincipper, genregulering, genekspression)

    DNA og mRNA (struktur og funktion)

    Det centrale dogme (transskription og translation)

    Proteiner og enzymer (struktur og funktion)

    Cellebiologi (eukaryot og prokaryot)

    Bioteknologiske metoder (celledyrkning, transformation, sekventering)

    Materialet tager fat på mange forskellige emner indenfor bioteknologi, som er pensum på bioteknologi A, så projektet fungerer rigtig godt som et suppleringsforløb i 3.g, før eleverne skal til eksamen eller som et inspirationsforløb op til SRP/AT-projekt eller lignende. Den viden omkring bioteknologi, som de har opbygget efter næsten 3 års undervisning kan belyses i et nyt lys med dette projekt og der trækkes mange tråde mellem de forskellige elementer.

     

    Oversigt

    Undervisningsmaterialet består af grundteorien, som ligger den grundlæggende forståelse og molekylære baggrund for CRISPR/Cas9, og efterfølgende fire cases, der kan læses uafhængigt af hinanden, alt efter interesse. De forskellige cases beskriver de mange muligheder og mere kulørte aspekter ved CRISPR-teknologi.

    Grundteori – CRISPR/Cas9: Dette afsnit er forklarer, hvordan genmodificering med CRISPR/Cas9 foregår på det molekylære plan, samt hvordan disse ændringer af DNA påvirker gener og de tilsvarende proteiner, samt organismen som en helhed. Afsnittet er skrevet med bioteknologien, og især genteknologi, som fokus, og gennemgår gennemførslen af praktisk arbejde med CRISPR/Cas9, herunder eksperimentielt design, forskellige strategier og komplikationer ved teknologien. Yderligere gives konkrete eksempler på eksperimentel anvendelse af CRISPR/Cas9.

    Case 1 – Oprindelsen fra et prokaryot immunforsvar: Dette afsnit beskriver det naturlige biologiske system, hvorfra CRISPR/Cas9 stammer fra. Den naturlige molekylære mekanisme gennemgås ved et eksemplificeret angreb af en bakteriofag på bakterien Streptococcus pyogenes. Pointen er, at bioteknologiske værktøjer ofte har deres grundlag i naturlige processer, og at mekanismerne er opstået med et specifikt biologisk formål.

    Case 2 – Genregulering med CRISPR-teknologi: Dette afsnit tager fat i anvendelsen af CRISPR til kontrol af ekspressionen af specifikke gener. Afsnittet gennemgår et helt konkret eksperiment, hvor E. coli gener styres til at give meget atypiske fænotyper – et klart eksempel på, hvordan genekpressionsregulering har stor betydning!

    Case 3 – Genterapi med CRISPR/Cas9: Afsnittet gennemgår den potentielle anvendelse af CRISPR/Cas9 til at helbrede genetiske sygdomme. Grundprincipperne bag genterapi gennemgås, og der dykkes ned i bestemte genetiske sygdomme, som er blevet undersøgt i forhold til terapi med CRISPR/Cas9: Retinitis pigmentosa, Duchennes muskeldystrofi og Kræft. Herudover lægges vægt på de mange komplikationer og forhindringer, som CRISPR/Cas9-genterapi står overfor.

    Case 4 – Gene drives til genmodifikation af populationer: Dette afsnit gennemgår brugen af CRISPR/Cas9-baseret gene drives, der automatisk kan modificere hele populationer. Teknologien kan bruges til redigere hele arter, eller ligefrem udrydde dem. Gene drives har en utrolig virkningsmekanisme, og denne gennemgås i afsnittet. Yderligere gives eksempler på anvendelser, og mere specifikt tages et blik på, hvordan gene drives kan bruges til udryddelsen af malariamyg.

    Det er anbefalet at kigge på alle fire cases, da de beskriver meget forskellige elementer af den alsidige CRISPR-teknologi – men de enkelte cases kan sagtens fungere enkeltvis, efter grundteorien er læst. Man kan også udelukkende bruge grundteorien, da denne sagtens kan stå alene – hvis kun den grundlæggende forståelse for CRISPR/Cas9 er hovedmålet. Der er udviklet teoretiske opgaver af varierende sværhedsgrad til grundteorien, som tager fat i de mest centrale komponenter af CRISPR/Cas9, samt de vigtigste molekylære mekanismer.

    Udover de spændende bioteknologiske principper, ligger materialet op til mange etiske diskussioner, som man med fordel kunne tage op i klassen, eller på anden vis kunne få eleverne til at overveje. De forskellige cases tager især fat i emner, som kunne prikke til de forskellige etiske principper.

     

    Opgaver

    Der er opstillet teoretiske opgaver til grundteorien (Opgaver – Teoretiske spørgsmål og Opgaver – Mammut DNA), som kræver, at eleverne har læst og forstået de vigtigste budskaber af grundteorien (Grundteori – CRISPR/Cas9). De korrekte svar til opgaverne kræver læreradgang og findes under fanen ‘Undervisning’ > ‘Lærervejledninger’. Adgang til disse tilsendes lærere efter henvendelse over mail til: biotech@bio.dtu.dk

Kildehenvisning:

Dette projekt blev udgivet i december 2018. Det er udarbejdet af Biotech Academy og er blevet opdateret løbende.

null

Projektet er udarbejdet af Marcus Deichmann

 

 

 

Marcus Deichmann

null

Rasmus Otkjær Bak har været sparingspartner på dette projekt.
(Adjunkt, ph.d., Institut for biomedicin og Aarhus Institute of Advanced Studies (AIAS), Aarhus Universitet.)

 

Rasmus Otkjær Bak

null

Uffe Hasbro Mortensen har været sparingspartner på dette projekt.
(Professor, Institut for Bioteknologi og Biomedicin, Danmarks Tekniske Universitet.)

 

Uffe Hasbro Mortensen