CRISPR/Cas9 Leveringsmetoder

Denne underside udgør fjerde del af teorien for Biotech Academys materiale om CRISPR-Cas9.

For at kunne udføre en genmodificering, må Cas9 og sgRNA indføres i cellerne gennem cellemembranen og trænge ind i cellekernen til det genomiske DNA. Denne levering kan foregå ved forskellige tilgange. Cas9 kan indføres som kodende DNA, mRNA eller færdigt protein. sgRNA kan indføres direkte i cellerne på RNA-form, eller kan kodes som DNA. Skal der udføres en insertion eller erstatning af en gensekvens, skal DNA-skabelonen også indføres. De forskellige metoder som genmodificeringssystemet kan leveres på, har forskellige fordele og ulemper, og man må derfor vælge den leveringsmetode, der passer bedst på den givne situation. Leveringen af genmodificeringssystemet kan gøres ved at designe en vektor, der indeholder alle komponenter af systemet. En sådan vektor er baseret på genetisk materiale, som har til funktion at kode for komponenterne og kunne levere dem samlet til cellerne, hvori modificeringen skal foregå.

DNA-baseret levering: Plasmider

Det er muligt at kombinere Cas9-kodende DNA (cas9-genet) og sgRNA-kodende DNA i et plasmid, som er et cirkulært stykke DNA. Dermed bliver hele systemet samlet i ét enkelt stykke DNA. Heri kan også en DNA-skabelon indkodes. Disse plasmider fungerer som vektorer for genmodificeringssystemet og kan fremstilles ved rekombinant DNA-teknologi. Overføres plasmidet til en organisme, bliver det udtrykt og dermed vil genmodificeringssystemet dannes og blive aktivt. Man får komponenterne udtrykt ved at indsætte promotere foran de kodende sekvenserne i plasmidet, som er regulatoriske sekvenser, der medfører transskriptionen af DNA’et. Disse plasmider designes specifikt efter den organisme, som man vil genmodificere, da forskellige organismer har forskellige måder at udtrykke DNA på. Promotorerne skal dermed også fungere i den givne organisme, for at de kan udtrykke genmodificeringssystemet fra plasmidet. Plasmidet bør ikke være replikativt, da den ellers kan kopiere sig selv til mange eksemplarer, hvilket ville være unødvendigt for genmodifikationen og kan være ufavorabelt for cellen.
DNA-baseret levering ved et plasmid er illustreret på figur 10. Plasmidet skal generelt leveres til cellekernen, hvor komponenterne konstant transskriberes til RNA, altså Cas9-kodende mRNA og sgRNA. Her kan plasmidet ligge stabilt i en længere periode. mRNA’et translateres til Cas9-protein i cytoplasmaet, hvorefter det danner kompleks med det valgte sgRNA. Til sidst trænger Cas9 ind i cellekernen, hvor genmodificeringen af det genomiske DNA vil foregå.

RNA-baseret levering

Dette er en levering af Cas9-kodende mRNA og sgRNA. Her skal mRNA’et blot translateres til det færdige Cas9 protein i cytoplasmaet, hvorefter det kan danne kompleks med sgRNA. Det kan være fordelagtigt at mRNA er mere ustabilt end DNA, da translationen af Cas9 dermed kun er kortvarig. Dosen af Cas9 kan dermed reguleres mere end ved DNA-baseret levering, da et plasmid vil blive ved med at danne nyt mRNA, som vil danne mere Cas9.
RNA-baseret levering er illustreret på figur 10. RNA’et leveres til cytoplasmaet, hvor det Cas9-kodende mRNA translateres. Efterfølgende kan Cas9-proteinet danne kompleks med sgRNA og trænge ind i cellekernen og foretage genmodificeringen, som ved DNA-baseret levering.

Protein-baseret levering

En direkte levering af det færdigproduceret Cas9 i kompleks med sgRNA, betyder at genmodificeringen kan foregå øjeblikkeligt efter leveringen, da der hverken skal foregå transskription eller translation. Denne metode har vist sig at give en mere effektiv og præcis genmodifikation, men det kan være svært at levere et stort protein, i forhold til at levere RNA eller DNA. Protein-baseret levering giver den mest kortvarige tilstedeværelse af Cas9, da proteinet ikke kontinuerligt bliver dannet ud fra indført RNA eller DNA, hvilket menes at sænke risikoen for fejl og muligvis mindske uønskede immunologiske responser.
Protein-baseret levering er illustreret på figur 10. Det leverede Cas9 med sgRNA skal blot trænge ind i cellekernen, hvorinde genmodificeringen foretages, som ved de andre leveringsmetoder.

Figur 10. Forskellige leveringsmetoder for genmodificeringssystemet. Både Cas9 og sgRNA skal leveres til cellen der skal genmodificeres, hvilket kan gøres ved flere forskellige formater; DNA, RNA eller protein. Afhængigt af metoden, kan cellens egen transskription og translation udnyttes til at danne det aktive Cas9 med gRNA.

Fysiske leveringsmetoder

DNA-, mRNA- og protein-baseret levering kan foregå ved metoder som mikroinjektion, elektroporation, og ved pakning i nanopartikler. Mikroinjektion foregår ved en manuel injektion af genmodificeringssystemet i en enkelt celle, med en mikroskopisk nål, der kan gennemtrænge cellemembranen. Elektroporation er en proces hvor cellemembraner gøres mere permeable, ved at udsætte cellerne for et elektrisk felt. Genmodificeringssystemet kan passere membranen fordi den bliver ustabil under elektroporationen. Nanopartikler, der kan passere cellemembranen, kan bruges til at indpakke genmodificeringssystemet. Eksempelvis kan lipide nanopartikler der indeholder genmodificeringssystemet optages af cellen ved endocytose.

Viral leveringsmetode

Der findes virale vektorer, som er uskadeliggjorte viruspartikler, der kan levere genetisk materiale til celler. Virus er specialiseret i at inficere celler, hvilket de gør ved at binde sig til specifikke overfladeproteiner af celler og indføre genetisk materiale, som overtager cellefunktioner og sørger for reproduktionen af nye viruspartikler.
Virale vektorer modificeres, så de ikke er skadelige og ikke kan reproducere sig selv. De tilføres i stedet selvvalgt genetisk materiale, der koder for sgRNA og Cas9. De virale vektorer kan stadigvæk binde sig til cellerne, og overfører nu det selvvalgte genetiske materiale, og helst uden at der forekommer bivirkninger og immunologisk respons. En udfordring ved virale vektorer, kan være manglen på plads i viruspartiklen til alt det DNA man vil levere, hvormed man må planlægge hvordan man pakker sin virus. Den mest anvendte virale vektor brugt til levering af Cas9 er adeno-associeret virus (AAV).