CRISPR/Cas9 komplikationer

Denne underside udgør femte del af teorien for Biotech Academys materiale om CRISPR-Cas9.

Off-target effekter og mulige løsninger

Det første problem man møder ved genmodifikation med Cas9 er off-target effekter. Disse ses når Cas9-proteinet interagerer med en anden sekvens, end den man havde planlagt at modificere. Det er klart, at dette kan skabe store problemer, da eksempelvis vigtige gener kan blive ødelagt ubevidst. Problemet opstår hovedsageligt fordi sekvensen, som det givne sgRNA genkender, findes flere steder i genomet, eller at der findes sekvenser, der minder tilstrækkeligt om den. De alternative PAM-sekvenser 5’-NAG-’3 og 5’-NGA-3’ kan også blive genkendt i mindre grad, hvilket sænker specificiteten. Off-target effekter er vanskelige at forudse for de enkelte sekvenser i et genom, hvilket gør usikkerheden større ved brugen af Cas9. Man kan reducere mængden af off-target effekter ved at prøve at sikre sig, at sit sgRNA er mest muligt unikt i forhold til én sekvens i genomet. Med specificiteten fra PAM-sekvensen og de 20 genkendende nukleotider, er det let at opnå i organismer med små genomer, men kan være langt mere kompliceret i komplekse organismer med store genomer, såsom mennesker.

Cas9-nickasen (Cas9n) er en alternativ modificeret version af Cas9-proteinet, som kan reducere off-target effekter betydeligt. Her er enten RuvC- eller HNH-nukleasen deaktiveret, ved punktmutationer i den kodende DNA-sekvens for Cas9-genet. Dette betyder, at Cas9-nickasen ikke laver dobbeltstrengbrud, men i stedet såkaldte nicks, der kun er brud i den ene DNA-streng. Funktionsmekanismen er fuldkommen ens med den naturlige form af Cas9 bortset fra, at det kun er en enkelt DNA-streng, der klippes i. Pointen er, at man til dannelsen af et DNA-brud, så skal anvende to Cas9-nickaser, der hver især skal genkende hver af de to DNA-strenge med forskellige sgRNA. Der skal altså ske dobbelt så meget identifikation af DNA-sekvenser i forhold til brugen af naturlig Cas9, for at opnå samme resultat. Herved opnås en forøgelse af præcisionen. Hvis Cas9-nickasen fejlagtigt genkender et andet sted, vil der kun laves et nick i den ene DNA-streng, som repareres langt mere præcist end et dobbeltstrengsbrud. Dobbeltstrengsbrud dannet af to nicks kommer til at have løse ender, men kan stadigvæk udnyttes til genmodificering. Se figur 11. Med denne tilgang øger man nøjagtigheden af genkendelsen, da flere identifikationer kræves, mens man samtidigt sænker off-target effekters betydning, da off-target nicks ikke er lige så alvorlige som off-target dobbeltstrengsbrud. I et forsøg med anvendelsen af Cas9-nickase, blev specificiteten forøget 1500 gange i forhold til naturlig Cas9.

Figur 11. Cas9-nickasen (Cas9n) har kun ét fungerende endonukleasedomæne, HNH eller RuvC, og kan derfor bruges til at lave nicks i enkelte DNA-strenge. På denne måde kan man bruge to Cas9n til at lave ét dobbeltstrengsbrud, og dermed sikre en højere præcision, da der skal bruges to forskellige sgRNA, A og B, der binder omtrent det samme sted. Der skal altså ske mere korrekt sekvensidentifikation, før man opnår et dobbeltstrengsbrud.

SpCas9-HF1 (Streptococcus pyogenes Cas9 High Fidelity 1) er en variant af Cas9, som sænker off-target effekter, men bevarer effektiviteten af genmodificering i de valgte DNA-sekvenser, som man har designet sit sgRNA til at ramme. For SpCas9-HF1 betyder alle 20 nukleotider i genkendelsessekvensen mere og mismatches er ikke accepteret, fremfor at det primært er de første nukleotider efter PAM-sekvensen, som betyder mest i den normale type Cas9. Der kræves altså et bedre match, før SpCas9-HF1 binder sig, og dermed undgås off-target effekter, som er grundet manglende specificitet. SpCas9-HF1 er dannet ved at udskifte 4 specifikke aminosyrer i Cas9 ved mutationer.

Cas9n og SpCas9-HF1 er gode eksempler på hvorledes man kan manipulere med proteinstrukturen af Cas9, for at forbedre præcisionen af genmodifikationer.

En anden lovende tilgang til at undgå disse ufavorable off-target effekter er igennem bioinformatikken, hvor man ved hjælp af computeralgoritmer og databehandling kan forudse hvilke sgRNA-sekvenser, der giver bedste resultater. Denne computer-tilgang til genetikken tillader behandling af store mængder genetisk information, og spiller allerede nu en stor rolle i moderne genteknologi. Der findes op til flere online algoritmer, der prøver at forudse off-target effekter ud fra genetisk data.

NHEJ sænker effektiviteten af homology directed repair

I eukaryoter, som svampeceller og dyreceller, er NHEJ en dominerende reparationsmekanisme i behandlingen af et dobbeltstrengsbrud. Dette betyder, at effektiviteten af indsættelse af DNA-sekvenser begrænses ved genmodificering, da HDR undertrykkes. For at opnå en højere effektivitet af genmodificering med sekvensindsættelser, kan man hæmme NHEJ midlertidigt, således at HDR kan anvendes. Der findes forskellige metoder, hvorpå man kan hæmme NHEJ midlertidigt. Dette opnås, ved at hæmme aktiviteten af de enzymer, der udfører reparationen. Når NHEJ er hæmmet, bør genmodifikationen foregå, da HDR har sin største effektivitet her. Efterfølgende bør NHEJ reparationssystemet genaktiveres, da et permanent blokeret NHEJ-system svækker organismens naturlige forsvar overfor DNA-skader, hvilket ikke er favorabelt.
Det lykkedes et hold forskere at øge effektiviteten af HDR 8 gange i menneskeceller, ved at midlertidigt hæmme NHEJ, hvilket bekræfter at det er en vigtig faktor at tage højde for.