Gen knock-in og knock-out
Denne underside udgør anden del af teorien for Biotech Academys materiale om CRISPR-Cas9.
De molekylære ændringer af genernes DNA-sekvenser har direkte indflydelse på funktionen af generne. Man kan både fjerne genfunktionalitet, ved gen knock-outs, og tilføje nye funktioner til et gen, ved gen knock-ins. Når man arbejder med genmodifikation, er man interesseret i, hvordan ændringer i genotypen udtrykker sig i fænotypen af organismen. Disse ændringer af organismen kan være meget voldsomme, eller næsten usynlige, afhængigt af genets funktion.
Gen knock-out
Gener koder for proteiner, som har en bestemt funktion. Hvis man ødelægger genet, forhindrer man produktionen af proteinet, hvormed man ikke vil observere den bestemte funktion. Mutationelle indgreb kan forårsage loss-of-function mutationer. En loss-of-function mutation medfører et knock-out af et gen, som er karakteriseret ved, at genet producerer dysfunktionelt protein eller ikke producerer nok protein. Dermed reduceres eller fjernes funktionen af proteinet. Med gen knock-outs er det dermed muligt at forhindre specifikke funktioner og fænotypiske træk, ved at påvirke funktionen af de udøvende proteiner. Man kan eventuelt lave et knock-out med Cas9 ved destruktion eller excision. Knock-outs kan også udføres med en insertion midt i en gensekvens eller ved erstatning af noget af sekvensen.
Ved at lave knock-out mutanter og sammenligne dem med vildtyper (ikke-modificerede organismer), hvor genet stadigvæk er funktionelt, kan man undersøge et gen og dets tilhørende proteins funktioner i en given organisme.
Et eksempel på anvendelsen af gen knock-outs, er ændringen af en organismes metabolisme. Ofte bliver cellens molekyler produceret af en lang række processer, kaldet metaboliske pathways. Hvert trin af processen er tilknyttet bestemte enzymer, der katalyserer modifikationen ved det enkelte trin. Enzymer er proteiner og derfor kodet af gener, hvormed det er muligt at lave knock-outs af dem. Et knock-out i et gen, der koder for et enzym i den metaboliske pathway, vil betyde at processen vil stoppe ved det trin som enzymet katalyserer, grundet manglen på funktionelt enzym. Det kunne være, at man var interesseret i at få fat i et stof, som ikke var produktet af den metaboliske pathway, men blot et mellemtrin. Herved kunne man lave et knock-out i genet for enzymet, der videreomsætter det ønskede stof, hvormed stoffet vil ophobe sig ved det bestemte trin, da det ikke kan blive videreomsat i den metaboliske pathway.
Gen knock-in
Et gen knock-in er indsættelsen af en ny DNA-sekvens på en helt specifik position i DNA’et. Denne DNA-sekvens kan indsættes i forlængelse med det DNA, der allerede haves eller erstatte en DNA-sekvens. Et knock-in kan medføre en gain-of-function mutation, hvor man ved indsættelsen af en DNA-sekvens ændrer funktioner eller tilfører funktioner til proteinet, som genet koder for. Man kan også forstærke funktioner, ved at forøge genets ekspression, hvormed der kommer mere protein. Ved knock-in af hele kodende sekvenser, kan man indføre nye proteiner og dermed nye funktioner til organismen. Knock-ins kan udføres med Cas9, ved at lave en insertion eller en erstatning af en DNA-sekvens.
Knock-ins har været brugt meget til at lave sygdomsmodeller, hvor man undersøger geners effekt på en sygdom. Knock-ins kan også indsætte reporter gener i forlængelse med andre gener, som man vil undersøge. Reporter gener producerer et protein, som nemt kan ses er blevet produceret. Da reporter genet er knyttet til et andet gens transskription, kan man se hvor meget protein, der bliver produceret fra det undersøgte gen. Et klassisk eksempel på en reporter er green fluorescent protein (GFP), der er et grøntlysende protein. Ved at knytte genet for GFP til et andet gen ved et knock-in, kan man se hvor meget det undersøgte gen bliver udtrykt og hvorhenne i organismen proteinet er, ud fra observation af det lysende protein.