Cases: Genteknologi i planter og dyr

Siden halvfemserne har verden således set forskellige nye genmodificerede (GM) organismer, som fx tomaten Flavr Savr, der ikke sådan lige rådnede, “gyldne ris” fyldt med provitamin A og geder, der udskiller komplekse lægemidler i mælken. Konsekvenserne for miljøet og bønderne ved dyrkning af GM-afgrøder kan være både dårlige og gode, men i hvert fald svært gennemskuelige, og derfor føres der meget streng godkendelseskontrol med nye transgene planter, der skal sættes fri i naturen. Alligevel er der forskel i landenes godkendelseskrav, hvorfor især GM-bomuld, -majs og -soya i dag er meget udbredte uden for EU, mens EU har godkendt færre planter til dyrkning (læs mere i ‘Etik og lovgivning i genteknologi’).

Trods den især europæiske forbrugerskepsis overfor GM-fødevarer, udvikles der stadig nye arter, heriblandt Golden Rice-projektet, der har til mål at få risplanter til at danne provitamin A (β-caroten) i riskornene. A-vitaminmangel findes nemlig blandt omkring 140 mio. mennesker i tredjeverdenslande, og ris er en billig, udbredt fødevare mange af de steder.

Genteknologi bruges også i pharming, der i stedet for at indsætte forbedrende egenskaber, er brugen af planter og dyrs avancerede cellulære maskineri til at producere komplekse medicinske proteiner – i princippet en slags højavanceret cellefabrik (som introduceret i ‘Cellefabrikker’). Efter disse levende ”medicinalfabrikkers” dyrkning kan stofferne høstes fra fx tidslers blomster, tobaksblade eller i en geds mælk.

Bt-bomulden er blevet så udbredt, at forskellige varianter med Bt toxin dækker 45 procent af verdens bomuldsareal i 2009, og da markerne giver 30-40 procent mere udbytte end de normale, er det i dag godt over halvdelen af verdens bomuldsproduktion, der stammer fra denne genmodificerede (GM) bomuldstype. Flere udviklingslande har taget planten til sig, og der har for nylig været rapporter om en betydelig levevilkårsforbedring for bl.a. kvinder i bomuldslandbruget i Indien pga. Bt-bomulds højere udbytte. Tøj købt i Danmark kan altså sagtens indeholde Bt-bomulden, men Bt-toxinet generer ikke mennesker.

Det insektdræbende Bt-toxin

Bt-toxin er et lille krystalprotein skadeligt for cellerne i fordøjelseskanalen hos mange insekter inklusiv nogle af dem, der angriber bomuldsmarkerne. Når tarmen således ødelægges, dør insektet. Med Bt-bomuld kan sprøjtningen med belastende pesticider derfor mindskes. Bt-toxinet er ikke nyt som giftmiddel, og bruges faktisk også som sprøjtemiddel af konventionelle afgrøder, og Bt-bakterien må også udsættes til skadedyrsbekæmpelse på økologiske afgrøder. Ved sprøjtning er ulempen, at der kun rammes de insekter, der er til stede ude på planten under sprøjtningen. Larver der angriber bomuld, opholder sig ofte inde i planten, og sprøjtning helt op til 15 gange kan være nødvendig per dyrkning.

Kritik: Skaber de tolerante planter resistente insekter?

GM-planter med Bt toxin kritiseres fra flere sider. Som med andre giftstoffer kan de ramte insekter udvikle resistens, så de ikke længere dræbes af giften, hvilket har været frygtet af nogle lige fra starten; ingen kender langtidsvirkningerne på miljøet fra en forandret plante.

I 2010 vakte det derfor opmærksomhed, at et af firmaerne bag planterne, Monsanto, selv rapporterede, at den røde bomuldslarve (pink bollworm) i flere indiske provinser havde udviklet resistens overfor Bt toxin (fra genet cry1Ac) og derfor kan angribe planterne igen.

Fordi GM-markerne næsten ikke sprøjtes, er det også frygtet, at det forandrede miljø i markerne betyder, at nye skadedyr vinder indpas i disse marker. Disse skadedyr blev tidligere holdt nede af insekterne.

En af metoderne, som resistensudviklingen forsøges holdt nede med, er ved at dyrke markerne med forskellige varianter og kombinationer af Bt-toxinet indsat i generne. Fordelen er, at selvom et insekt udvikler resistens over for den ene af toxin-varianterne, vil det sandsynligvis stadig dræbes af det andet Bt-toxin. Risikoen for resistens er derfor væsentligt mindre. I det konkrete indiske tilfælde var markerne med resistens dyrket med kun én variant. En anden medvirkende årsag, kan også have været mangel på plantning af de såkaldte Bt-fri refugier.

Bt-fri refugium i markerne

Udvikling af resistens er et naturligt fænomen, som også kendes fra sygehusene, hvor superbakterier bliver resistente over for antibiotika. Som værn mod resistensen i marker, forpligter brugere af Bt-planterne sig til, at plante et såkaldt refugium af samme afgrøde, men uden Bt-toxin på 20-50 procent af markarealet. Her må almindelige pesticider anvendes, og de overlevende insekter vil ikke være resistente over for Bt-toxin.

Manglen på Bt-resistens i refugiet mindsker resistensudviklingen i de nært voksende Bt-sorter, fordi insekterne fra refugiet vil bevæge sig ind og parre sig med eventuelt Bt-resistente insekter, som er opstået. Her vil de få et afkom, der både har et allel af genet, der fører til Bt-resistens og et allel, som ikke gør; insektet er altså heterozygot (se figur 2). De heterozygote insekter er ikke resistente overfor Bt, fordi resistens-genet er recessivt(vigende), og de vil derfor efterfølgende sandsynligvis dø af Bt-toxin.

To heterozygote insekter vil dog sammen kunne et få homozygot afkom, som er Bt-resistent, og brug af refugier er bestemt heller ingen total beskyttelse mod resistensudvikling.

Den gyldne ris er tilført to fremmede gener, der får den hvide del af riskornene (frøhviden) til at producere det orangerøde β-caroten, der især kendes fra gulerødder. β-caroten er et provitamin, som kroppen selv kan omdanne til vitamin A. Det var også risenes karakteristiske gyldne farve, der gav dem navnet gylden ris.

Udvikling af planten

Risplanter producerer faktisk β-caroten helt naturligt, men desværre ikke i den del af risene, der spises. Så den genteknologiske opgave forskerne satte sig, var at skabe den kemiske produktionsvej i risens frøhvide.

Risen danner naturligt stoffet geranylgeranyl-PP, som i en række af fire trin kan ende som β-caroten (figur 2), hvis de rette enzymer er til stede. For at danne enzymerne indsatte forskerne derfor først genet psy, som de fandt i påskeliljer. Det koder for det nødvendige enzym phytoen synthase, der styrer første trin i reaktionsvejen. Men forskerne koblede også endnu en lille sekvens til genet, som klogt nok dirigerer enzymet hen til netop plastiderne.

Gederne malkes, og fra mælken oprenses proteinet, der som tørt pulver kan opløses og gives til trængende patienter på hospitaler, hvilket bl.a. mindsker risikoen for blodpropper. Da donorblod principielt kan bære sygdomme som HIV og Creutzfeld-Jacobs fra en uopdaget syg donor, må man benytte store screeningsprogrammer for at sikre, at der ikke videregives sådanne sygdomme med lægemidler udvundet fra blod – dette behov medfører rekombinant produktion ikke.

Antithrombin i blodet: Modvirker størkning

AT virker i blodet ved at hæmme enzymet thrombin, der får blod til at størkne. Thrombin omdanner nemlig blodproteinet fibrinogen til det uopløselige fibrin, så størkningen foregår (se figur 2). Thrombin aktiveres derfor ved sår for at undgå blodtab, men antithrombin er også vigtigt for at indstille den balance, som sikrer, at blodet kun størkner det rigtige sted og ikke bliver for tykt.

Patienter, der mangler antithrombin, er mere udsatte for at danne blodpropper, og ved operationer og fødsler kan man derfor give patienterne AT for at genoprette deres balance. AT er et større protein (58 kDa), som er glykosyleret (påhæftet sukkermolekyler). Glykosyleringen styrer bl.a. stoffets halveringstid i blodet, og derfor skal glykosyleringen gerne minde mest muligt om den humane, for at rekombinant AT vil være effektivt.

Design af ekspression

Forskerne, der udviklede den transgene ged, var naturligvis ikke interesserede i bare at få en ged, der producerede meget humant antithrombin (rhAT) i alle dens celler. Så for at lokalisere produktionen til mælkekirtlerne, indsatte de genet for rhAT efter en særlig promoter for mælkeproteinet β-kasein. Promoteren aktiverer netop transkriptionen af dens gen i cellerne i mælkekirtlerne, hvor β-kasein også produceres. På den måde kunne det dannede rhAT blive udskilt i gedemælken ligesom β-kasein (læs evt. mere om promotere i Genetisk tuning)

Den rekombinante antithrombin fra geder viste sig også at være lidt anderledes glykosyleret end humant antithrombin, men undersøgelser viste, at det stadig var effektivt.

Brug af rekombinant antithrombing

AT er et protein, og en eventuel forestilling om at kunne udstyre AT-mangel-patienter med frisktappet rhAT-gedemælk, vil ikke virke, hvor praktisk tiltalende den end lyder. Proteinet vil som de øvrige proteiner simpelthen blive nedbrudt i maven og ikke få sin effekt. AT skal gives intravenøst (i blodbanen) og skal derfor først oprenses fra mælken. Lægemiddelproduktion stiller desuden altid meget høje krav til kvalitet, renhed og selve produktionen. Disse krav må firmaet bag rhAT også opfylde.

rhAT sælges nu under navnet ATryn og er det første godkendte lægemiddel, som er produceret i transgene dyr. ATryn vil kun blive brugt på hospitaler, hvor operationer især udgør en fare for patienter, der mangler AT.

Forbruget af antithrombin i USA og EU tilsammen ligger forholdsvist lavt for lægemidler på omkring 250 mio. kr/år. Udvikling af lægemidler er samtidig en ekstremt omkostningstung affære, men myndighedernes godkendelse af ATryn er blevet set som et grønt lys til sikkerheden ved disse lægemidler produceret i transgene dyr, og udviklingen kan fortsætte mod medicin til mere udbredte sygdomme.

Ud over mælk, arbejder forskere nu med at udtrykke humane proteiner til medicin i hønseæg og tidselblomster. Måske er fremtidens avancerede medicinfabrikker biologiske på en facon, man ikke havde troet for tyve år siden!

Case: Udvikling af fedtnedbrydende vaskeenzym

Novozymes er verdens førende udvikler og producent af enzymer til bl.a. vaskemidler og har hovedkontor i Bagsværd nord for København. Novozymes’ vaskeenzymer hjælper med nedbrydning af snavs som proteiner, stivelse og fedt, men udviklingen af dem kan være lang.
Enzymer, der udvikles af et firma som Novozymes, bliver først fundet i naturen. Det kunne være i mikroorganismer, der lever i barske miljøer, som minder om de ret basiske forhold i en vaskemaskine. Men udover den første udfordring med at opdage et attraktivt enzym, venter der også en genteknologisk opgave med at få skabt en god cellefabrik til at producere det i store mængder og evt. forsøge at optimere virkningen af enzymet.

Enzymets struktur og kemiske grupper spiller sammen med reaktanterne under reaktionen og understøtter forløbet. Reaktionen kræver derfor mindre aktiveringsenergi og forløber ofte derved markant hurtigere. Enzymet indgår altså i reaktionen, men forbruges ikke selv og er derfor klar til at katalysere samme reaktion igen bagefter. Husk at enzymer og andre katalysatorer aldrig påvirker selve placeringen af reaktionens ligevægt – kun hvor hurtigt den indstiller sig (reaktionshastigheden).

Til kamp mod læbestiftspletter:

Udvikling af et fedtnedbrydende vaskeenzym

Et af de effektive, fedtnedbrydende lipase-enzymer er udviklet af Novozymes i Japan og Danmark til vaskemidler, der kan fjerne pletter fra fx smør, olie eller læbestifter. Enzymet er en bioteknologisk succeshistorie om en udviklingsproces, hvor forskerne som så ofte pludseligt måtte tænke kreativt, da de kom under tidspres.
Fedtnedbrydende lipaser fandtes allerede i 1970’erne til vaskemidler, men de var dengang ikke så effektive.

For at finde nogle bedre lipaser, startede Steen Riisgaard, den nuværende direktør for Novozymes, i 1982 et forskningslaboratorium med en lille håndfuld mennesker i Tokyo for Novo Nordisk (inden enzymdelen senere blev skilt ud i Novozymes). Laboratoriets første opgave blev at analysere en masse mikroorganismer for at se, om de producerede interessante lipaser, en almindelig strategi for at finde nye enzymer.
For at få mere fokus på lipaserne blev der i 1984 oprettet en lipase-gruppe med 15 personer, og i årene 1985-86 fokuserede de mest på bakterielle lipaser, specielt fra bakteriearten Pseudomonas. De fandt dog også adskillelige lipaser fra svampe, men spørgsmålet var, hvor godt de virkede.

Arbejdet i Japan

Måske fordi Steen Risskovs laboratorium lå i Tokyo, startede holdet et samarbejde med den japanske vaskemiddelproducent Lion, der var presset af konkurrence på markedet. Lion testede en række af Novo Nordisks lipaser sammen med deres vaskemiddel for at finde de bedste kandidater, og i sommeren 1987 vendte de tilbage med meddelelsen om, at de havde fundet en meget god lipase fra den termofile svamp Humicola lanuginosa.
Lipasen skulle gerne med i Lions nye produkt, som de ville introducere i april 1988. Det var en glædelig nyhed for udviklerne, men pludselig skulle det også gå stærkt, hvis de skulle kunne nå at levere nok af lipasen til det store japanske marked.
H. lanuginosa stammen producerede nemlig ikke meget lipase naturligt, så holdet gik i gang med at optimere fermenteringerne af svampen på klassisk vis. Det indebar bl.a. at danne forskellige tilfældige mutationer, som forhåbentlig førte til øget produktion, og det var ikke en nem opgave.

På dette tidspunkt sidst i firserne var genteknologien ny, men i kraftig udvikling, og det var året inden (1986) lykkes andre forskere i Novo Nordisk at producere rekombinant humant insulin med gær som en cellefabrik.
Derfor var der også nogle, der mente, at man også skulle satse på genteknologi til denne udfordring. En lille gruppe arbejdede derfor på at indsætte genet, der kodede for lipasen, i en ekspressionvektor. Ideen var så at sætte ekspressionsvektoren ind i Aspergillus oryzae, der er en god svamp til produktion. Til at begynde med gik det ikke så godt med det genteknologiske projekt, men i november 1987 lykkedes det med en god promoter foran H. lanuginosa lipase-genet at få høje lipase-udbytter i A. oryzae.

Den første produktion

På det tidspunkt havde Danmark vedtaget verdens første lov om genteknologi. Derfor var det svært at få en hurtig produktionsgodkendelse til en svamp, der var blevet genmodificeret. Heldigvis havde Novo Nordisk netop bygget en fabrik i Japan, så fermenteringerne blev foretaget der. Problemet var bare, at enzymer leveres i et granulat på pulverform, som den japanske fabrik ikke kunne lave. Den kim-filtrerede (uden levende materiale) fermenteringsvæske måtte derfor sendes til Danmark for at blive granuleret, hvorefter det blev sendt tilbage til Japan og Lion. I 1988 kom Lion efter planen på markedet med vaskemidlet Hi-Top, som indeholdt verdens første rekombinant producerede vaskeenzym – Lipolase.

Optimering af enzymet (Protein engineering)

Lipolase blev snart solgt godt rundt omkring i verden, og i starten af 90`erne ville Novo Nordisk gerne forbedre lipasen, så den virkede endnu bedre under vask. Et af problemerne var, at en del af fedtet blev nedbrudt efter selve vasken, så pletterne først gik væk ved anden vask!

For at forbedre enzymet skulle selve aminosyresekvensen altså ændres, og for at gøre det, måtte man altså ændre i genet. Da bakterier er lette at arbejde med, var planen, at bruge dem til at producere en række forskellige varianter af lipasen, hvor en eller flere aminosyrer var ændret. Desværre kunne lipasen slet ikke produceres i fornuftige mængder i bakterier, men det viste sig, at lipasen godt kunne produceres af gæren Saccharomyces cerevisae. Denne gær er også let at lave genteknologiske forsøg med, så det gav mulighed for at lave de mange forskellige varianter af lipasen, og man kunne undersøge, om varianterne blev bedre i vaskepulver.

Overraskende opdagede forskerne, at lipase produceret fra gær i sig selv virkede bedre i vaskepulver end selvsamme lipase produceret i A. oryzae. Gæren kunne dog ikke producere så store mængder af lipasen, at det kommercielt kunne betale sig. Forskerne måtte derfor finde ud af hvad årsagen var til denne forskel mellem lipase produceret i A. oryzae og i gær. Det viste sig, at der var tilføjet nogle flere positivt ladede aminosyrer på enden (N-) af lipasen produceret i gær, hvilket gav den øgede aktivitet af lipasen i vaskepulveret. Mange forsøg blev gjort på at lave en ligeså god lipase, som kunne produceres i store mængder af A. oryzae. Heldigvis havde man fået lavet en røntgenstruktur af lipasen, som gjorde det muligt at se lipasen i 3D.
Derfor kunne man præcist sige, hvor de ekstra positive aminosyrer var placeret i lipasens tredimensionelle struktur. Der blev lavet en række lipase-varianter, hvor man ændrede aminosyrerne i samme region af lipasen til positivt ladede aminosyrer. En af disse varianter viste sig at være rigtig god. Den kunne endda produceres i store mængder af A. oryzae, og den er siden blevet til Novozymes’ vaskeenzym Lipex.

Arbejdsspørgsmål:

Slå med fordel op i ‘Genteknologiske værktøjer’ undervejs.

1. Hvilke funktioner er de industrielle enzymer i stand til at hjælpe med? Og hvordan bliver de typisk fundet?
2. Hvad vil det sige, at et enzym er hydrolytisk i sin funktion?
3. I denne case hører vi hvordan forskerne fik hjælp fra tre forskellige organismer til at udvikle de fedtnedbrydende enzymer. Forklar hvilke og hvad hver organisme i korte træk blev brugt til.
4. Foreslå en genteknologisk metode, forskerne kunne bruge til at sammensætte det DNA, de skulle gensplejse svampene med?
5. Når forskellige DNA-stykker sættes sammen, kan der dannes stykker af forkert længde. Foreslå, hvordan forskerne kunne oprense det rigtige.
6. Giv et forslag til, hvordan forskerne kunne se, om den gensplejsede svamp overhovedet havde optaget og indeholdt den nye indsatte DNA. Forklar kort hvordan

Case: Udvikling af hurtigtvirkende insulin

Man producerede derfor forventningsfuldt X10 til kemiske forsøg på cellekulturer, hvilket gav positive resultater. Men som det ofte sker med potentielle lægemidler i udvikling, måtte projektet afbrydes, da forsøg med rotter viste dårlige resultater. Forsøget viste en forhøjet risiko for mælkekirtelkræft hos de rotter, som fik X10 ift. rotter som til sammenligning kun fik indsprøjtet saltvand.

Vejen fra idé til færdigt, godkendt lægemiddel er lang og meget dyr. I den allersidste udviklingsfase af alle nye lægemidler skal stofferne testes i mennesker igennem en række kliniske forsøg, der bl.a. skal skaffe viden om lægemidlets funktion og sikkerhed. I denne flerårige periode opdages og stoppes lægemidler, hvis de viser sig at have uønskede bivirkninger.

Ideen skulle nu udføres i praksis, og gærceller blev derfor gensplejset med en ekspressionsvektor, der indeholdt genet for den nye variant kaldet insulin aspart. Den eneste forskel i genet var altså codonet for B28, der nu kodede for asparaginsyre. Da gærcellernes ny-producerede insulin aspart var oprenset, kunne forskerne spændt undersøge resultatet.

Test af insulin aspart

Insulin aspart skulle naturligvis også igennem en lang undersøgelsesprocedure for at sikre kendskab til virkningen og sikkerheden ved det. Til stor glæde for udviklerne, viste stoffet efter mange forsøg sig sikkert at bruge, og absorptionen af insulin aspart i blodet var dobbelt så hurtig som for humant insulin. Insulin aspart kunne stadig binde sig til receptoren på cellerne, og det havde altså ikke tabt sin virkning i forbindelse med den opnåede nye virkningshastighed.

Insulin asparts hurtige absorption efter indsprøjtning, minder mere om raske menneskers udskillelse af insulin til blodet i forbindelse med måltider Derfor var insulin aspart en interessant forbedring af diabetes-behandlingen for mange patienter.

I 1999 fik insulin aspart godkendelse til salg i EU med navnet NovoRapid og året efter i USA med navnet NovoLog.

Den hurtigtvirkende insulin, NovoRapid er et eksempel på, hvordan genteknologi ikke kun kan bruges til at producere lægemidler identiske med naturens, men også mere avancerede varianter, hvor dele af genet er ændret. Som nævnt er genteknologi også udnyttet til at udvikle langsomt virkende insulin, som hjælper med at fastholde insulin-niveauet over længere tid.

I dag arbejder Novo Nordisks forskere videre med at forbedre behandlingen af diabetes ved hjælp af genteknologi. En af de store satsninger er stamceller (Biotech Academy har et andet projekt omhandlende dette), der måske vil kunne kurere diabetes, men som al medicinsk forskning rummer udviklingen mange udfordringer. De forbedrede insulin-varianter såsom insulin aspart forventes derfor også at være en stor hjælp i diabetes-behandlingen mange år frem endnu.