• Moderne genteknologi

    Moderne genteknologi bruges bl.a. i forskning til at studere sygdomme, mikrobiologi eller udvikling af cellefabrikker. Cellefabrikker er celler, som producerer store mængder af værdifulde produkter, fx medicin.

    I dette materiale lærer du at designe din egen cellefabrik med genteknologi, og bagefter kan du selv afprøve hele processen fra DNA-design til færdigt produkt i det virtuelle laboratorium. Samtidig lærer du bl.a. om, hvordan DNA og gener fungerer som instruktioner i alle biologiske celler, og meget mere om de moderne genteknologiske værktøjer!

    Materialet er udviklet af Peter Rugbjerg og sponsoreret af Ministeriet for Videnskab, Teknologi og Udvikling, Novo Nordisk og Novozymes.

    Rigtig god fornøjelse med projektet!

  • Teori

    Teori-materialet består af 6 artikler. Flere af artiklerne kan læses uafhængigt af hinanden, men det anbefales at læse de tre første artikler kronologisk.

    Der hører også en række cases om faktisk brug af genteknologi til materialet.

    Rigtig god fornøjelse med den teoretiske del af materialet!

    Genteknologi gør det muligt at ændre i generne. Men hvad er gener, og hvordan styrer de cellerne? En vigtig forklaring findes i genernes kodning som DNA og i de cellebiologiske mekanismer, der tænder og slukker for generne.

    DNA og gener: Cellernes sprogkode

    Alle organismer på Jorden styres biologisk af deres gener – en særlig kode bygget op i lange DNA-dobbeltstrenge.

    DNA kan beskrives som et simpelt fire-bogstavsalfabet, der kan bruges til at skrive ord (generne), og DNA kan forstås ens på tværs af de forskellige livsformer, fx bakterier, fugle, mennesker og svampe!

    Hvorfor gener?

    Hele meningen med generne er, at de skal bruges som instruktion til dannelsen af forskellige proteiner. Hvert gen koder for et protein, og det er proteinerne, der udfører de vigtige opgaver i cellerne. De omdanner stoffer, giver signaler og struktur i cellerne blandt meget andet. Det er på den måde, generne er afgørende for vores biologiske udvikling og arv. DNA er det sprog, cellerne er styret af.

    Figur 1.1. De fire forskellige baser i DNA-nukleotiderne. Adenin, cytosin og guanin bruges også i RNA, hvorimod thymin erstattes af en anden base.

    Hver eneste celle indeholder som udgangspunkt alt det DNA, en organisme skal bruge, og det kan være store mængder! Menneskets DNA består af tre mia. nukleotider fordelt i 23 par af kromosomer. I udstrakt tilstand ville det være hele to meter langt. Kromosomernes tætte sammenrulning gør det dog muligt at rumme den store information inde i de mikroskopiske cellers kerner.

    For at vise hvor et gen starter og slutter i DNA’et, bruges bestemte sekvenser af nukleotiderne. Ud over disse proteinkodende gener deltager de øvrige DNA-områder bl.a. i den vigtige regulering af generne. En organismes samlede mængde gener (genom) rummer nemlig mange forskellige funktioner, der bestemt ikke er lige fordelagtige for alle dens celler hele tiden, og generne skal derfor reguleres. Det er bl.a. derfor vi ikke danner øjenpigment i tungen, selvom alle cellerne bærer de samme gener. Kræft kan også opstå, når nogle bestemte geners regulering forstyrres.

    Det centrale dogme

    Al den information, som ligger gemt i generne, følger en simpel vej, når den skal bruges i cellen. Denne vej kaldes biologiens centrale dogme. Dogmets regler går igen i al genetisk baseret viden og er derfor vigtige for at forstå molekylær biologi. Dogmet siger at gen-informationen ligger i DNA, afskrives til mRNA og oversættes til protein, der giver selve virkningen. Men hvorfor fungerer det sådan?

    Alle cellens gener er meget værdifulde og ligger derfor lagret som DNA – beskyttet i lange, dobbeltstrengede kæder af kromosomer (figur 1.2). Hvis gener skulle gå tabt eller ændres i en mutation, kan det nemlig betyde cellens død eller misvækst.

    Cellen bruger DNA i to processer: Replikation og transkription
    DNA’et bliver kopieret for at have en ekstra eksakt kopi, når cellen deler sig, og kopieringsprocessen for DNA kaldes replikation.

    DNA’et beskyttes så godt, at cellen ikke direkte har mulighed for at oversætte generne til de proteiner, de bærer instruktionerne (koden) for.

    DNA afskrives i stedet først i en proces, der kaldes transkription: Når et bestemt gen skal bruges i cellen, fx ved et sygdomstegn, bliver der dannet nogle særlige afskrifter af genets DNA i form af enkeltstrenget mRNA. Dermed er mRNA en afskrift af de gener, der netop nu er behov for i cellen.

    Figur 1.2. Det centrale dogme beskriver, hvordan DNA kopieres (replikation) eller aflæses til mRNA (transkription) for at blive oversat til protein (translation).

    Hvis der fx er stort behov for et gen, er det nemt at styre ved at transkriptere meget mRNA. Det mere ustabile mRNA går nemlig hurtigt til grunde – hvilket er smart, da et bestemt behov hurtigt kan forsvinde for cellen igen. Ud over kun at have én streng, adskiller RNA sig fra DNA ved en mindre kemisk forskel i nukleotiderne. De indeholder deoxyribose i DNA og ribose i RNA. Nukleotiderne er ellers de samme som i DNA med undtagelse af basen thymin, der i RNA-koden altid erstattes af uracil (U) (figur 1.3 og tabel 1.1).

    Figur 1.3. Basen uracil, der erstatter thymin i RNA. 

    Det sidste skridt i det centrale dogmes informationsvej er at få mRNA’et oversat til det protein, som dets gen koder for og som er genets mål. Denne proteinsyntese ud fra mRNA’et kaldes også translation.

    Translationen udføres af cellens ribosomer. De starter translationen i den position på mRNA’et, hvor de finder starten af et gen. Med kun ganske få undtagelser starter alle gener ved koden AUG. Dette får ribosomerne til at starte det nye protein med aminosyren methionin. Ribosomet læser nemlig hele tiden tre nukleotider ad gangen, således at næste aminosyre der indsættes i proteinkæden, afgøres af de følgende tre nukleotider efter AUG. Sådanne tre nukleotider, der læses til én aminosyre, hedder codons, og præcis hvilken aminosyre der fås af et bestemt codon, afgøres direkte af den genetiske kode (se figur 1.4).

    DNA RNA
    Dobbeltstrenget Enkeltstrenget
    Deoxyribose-nukleotider Ribose-nukleotider
    Bruger thymin (T)

    Bruger uracil (U)

    Tabel 1.1 Forskelle mellem DNA og RNA.

    Baseparring

    DNA-kædernes snoede dobbelt-helix-struktur indebærer, at hver DNA-streng har en matchende (komplementær) DNA-streng siddende overfor. Dette er endnu en beskyttende foranstaltning af de værdifulde gener (se figur 1.5).  Eksempel på læsning af den genetiske kode: Codonet CAG findes ved at finde C i venstre kolonne, A i top-rækken. Blandt de fire mulige, findes aminosyren Gln ud for G i højre kolonne. Gln er aminosyren glutamin. Som det ses koder flere codons for samme aminosyre. Dette omtales nærmere i 2 Cellefabrikker.

    I proteinsyntesen bygges et gens protein altså op, én aminosyre ad gangen ud fra de tilsvarende codons på mRNA-strengen. Proteiner findes i mange størrelser, og på et tidspunkt skal translationen ophøre. Det ordnes galant ved brug af et såkaldt stopcodon, der ikke koder for nogen aminosyre. Når ribosomet møder disse codons, slippes proteinet fri, og translationen er slut.

    Figur 1.4. Den genetiske kode

    De to DNA-strenge matcher hinanden ved baseparring. Det er nemlig altid de samme nukleotider, der sidder over for hinanden, hvilket skyldes hydrogenbindinger mellem nukleotidernes baser. De komplementære nukleotider, der altid parrer, er C – G og A – T (ses af figur 1.5).

    Kemien bag DNA

    DNA er en ekstremt vigtig biologisk forbindelse, men grundlæggende er det også bare et stort kemisk molekyle sammensat af nukleotider, der jo også er molekyler. Den varierende del af de fire nukleotider kaldes basen, og i DNA-dobbelthelixen vender de ind mod midten og baseparrer med de komplementære baser på den modsatte streng ved svage hydrogenbindinger. Nukleotider indeholder desuden en phosphat-gruppe og sukkergruppen deoxyribose. Den måde, nukleotiderne samles til en streng på, betyder, at en DNA-streng i den ene ende vil have 5’-carbon-atomet fra sukkergruppen fri og i den anden ende 3′-carbon-atomet. 3′ og 5′ bruger man derfor til at referere til retningen af en DNA-streng (se figur 1.5). DNA er en engelsk forkortelse for deoxyribonukleinsyre. Det centrale dogme beskriver altså, hvordan generne, godt beskyttet i lange DNA-kæder, styrer vores biologiske udvikling ved at blive transkripteret til mRNA og efterfølgende oversat i translationen til protein. Når gener bliver aflæst og skaber et protein, hedder det, at genet udtrykkes. Kendskab til DNA og det centrale dogme er grundlæggende for brugen af genteknologi. Genteknologi gør det muligt at ændre i generne.

    Figur 1.5Den dobbeltstrengede DNA-kæde som foldes op i et kromosom. De to DNA-strenge holdes sammen af hydrogenbindinger mellem de baseparrende, komplementære nukleotider.

    Da DNA forstås utroligt ens i alle organismer, gør genteknologi det muligt at flytte gener rundt mellem vidt forskellige organismer. Indsættelse af et fremmed gen i en mikroorganisme kan bruges til at skabe cellefabrikker af fx gærceller, der producerer store mængder medicinske proteiner såsom humant insulin til sukkersygepatienter. Vi ved som bekendt, hvad hver enkelt af de fire nukleotider i DNA-sekvenserne betyder for proteinernes aminosyre-sekvens (ses i den genetiske kode, figur 1.4), og derfor kan vi få cellefabrikker til at producere proteiner, som vi endda selv har udvalgt, optimeret og computerdesignet i håb om, at det fx resulterer i en forbedret medicinsk effekt.
    Genteknologien rummer et væld af værktøjer, der gør det muligt at ændre i gener. Ud over at indsætte nye gener kan man slette udvalgte gener, som måske har uønskede eller ukendte virkninger. Ved at slette et ukendt gen i en celle, kan man studere, hvordan cellen reagerer, hvis den kan overleve uden. Dermed kan man prøve at forstå genets normale funktion i cellen.
    Blandt andre kraftfulde værktøjer i genteknologien er metoden til at aflæse DNA (sekventering) og analysere det på en computer. Mikrochips kan fx bruges til hurtig og effektiv sammenligning af gener, som mistænkes for at spille en rolle i sygdomme.

    Gener, proteiner og enzymer – de grundlæggende elementer i cellen


    Et gen?
     

    Et gen er en sekvens af DNA, der koder for et protein, som en form for biologisk instruktion. Genet giver derved en arvelig egenskab, da DNA’et videregives til nye celler. Gener kan påvirke deres organisme meget tydeligt, fx bestemme hvad øjenfarven bliver. Men mange gener virker dog i samspil med hinanden, og der er fx ikke ét gen, der alene dikterer, hvor høj man kan blive.
    Et gen omfatter både den kodende del, der fører til proteinet, samt de omgivende regulerende områder, der hjælper med at tænde/slukke genet. Nogle særlige gener kommer ikke til udtryk som protein, fordi det som undtagelse faktisk er deres RNA-sekvens, som har den biologiske virkning. Et eksempel er de proteindannende ribosomer, som bl.a. består af store, foldede RNA-molekyler.

    Et protein?
     

    Proteiner er store, vigtige molekyler i cellerne, hvor de fx fungerer som enzymer, som signalgivere eller celleskelet. Ethvert protein er bygget op af en kombination af de 20 forskellige aminosyrer i en lang kæde. Og hver aminosyre har forskellige egenskaber, som påvirker, hvordan proteinet spiller sammen med andre molekyler i cellen, og hvordan den lange kæde af aminosyrer bliver foldet op i proteinets tredimensionelle struktur.

    Et enzym? 

    Enzymer er proteiner, der hjælper med at udføre bestemte biokemiske reaktioner. Denne assistering af reaktionerne kaldes katalyse. Enzymer findes derfor overalt i biologien og bliver kodet for af gener præcis ligesom andre proteiner. På den måde kan et gen styre, hvad der foregår i cellen, fx hvilke stoffer cellen skal danne. Enzymer kan være meget avancerede, som fx DNA-polymerase, der kopierer DNA og samtidig kan tjekke for fejl i kopieringen for at rette dem. Fordøjelsesenzymer er en anden type af enzymer, hvis særlige evne består i at nedbryde forskellige typer af molekyler såsom fedt og kulhydrat-kæder. I cellerne findes en meget bred variation af forskellige opgaver, der afhænger af assistance fra enzymer. Cellebiologien bag det centrale dogme.

    Indtil nu er de overordnede principper bag udtryk af DNA gennemgået, men hvordan håndterer cellen rent faktisk DNA’et og det mRNA og protein, der følger?

    Transkriptionen 

    Transkriptionen er mekanismen, hvor mRNA afskrives fra de store DNA-kæder for de gener, som cellen her og nu skal bruge. Som tidligere nævnt skal dette afskrevne gen ende med dannelsen af det kodede protein.

    Denne første del af vejen for udtrykket af et gen begynder i transkriptionen med, at forskellige aktiverende proteiner (transkriptionsfaktorer) binder til området lige inden selve den proteinkodende del af DNA’et. Dette bindingsområde kaldes en promoter.

    Bindingen af transkriptionsfaktorer gør det muligt for enzymet RNA-polymerase at binde sig til DNA’et for at foretage selve transkriptionen. RNA-polymerase er et meget stort enzym med en form lidt som en krappeklo. Med DNA’et i ’kloen’ bevæger enzymet sig langs DNA-strengen alt imens det syntetiserer mRNA-kæden ud fra DNA-sekvensen ved at bruge reglen om baseparring og komplementære

    nukleotider (se figur 1.6). Det vil altså sige, at et G på DNA-strengen fører til et C på mRNA’et. Da U som tidligere nævnt bruges i stedet for T i RNA, fører et A på DNA’et til et U på den nye mRNA-streng. Bakteriers RNA-polymerase kan transkriptere med en hastighed på omkring 2000 nukleotider i minuttet, og transkriptionen forløber, indtil enzymet møder en særlig terminator-sekvens, hvorefter mRNA-strengen frigives.

     Figur 1.6 Transkription, hvor RNA-polymerase syntetitserer en mRNA-streng (lilla) ud fra de komplementære nukleotider i DNA’et.

    EKSTRA BAGGRUND: Splicing af introns – nødvendigt i eukaryote celler

    Selvom transkriptionen er utrolig ens i alle levende organismer, er der nogle grundlæggende forskelle på de to forskellige celletyper: prokaryote og de mere avancerede eukaryote celler.

    Eukaryote celler har cellekerner, der indeholder cellens DNA og dermed det nytranskripterede mRNA. Inden mRNA’et derfor skal passere cellekernen ud til ribosomerne i cytoplasmaet, får det bl.a. tilføjet en poly(A)-hale, der består af en lang række adenin-nukleotider (A), som er med til at forlænge mRNA’ets levetid.

    Eukaryot DNA indeholder også nogle sekvenser, der kaldes introner. De ligger spredt og kan fx ligge midt i en proteinkodende sekvens og bliver derfor transkripteret med i mRNA’et. Introner skal klippes (splices) ud af mRNA’et, inden det kan translateres rigtigt til protein i ribosomerne. Disse processer er ikke nødvendige i prokaryote celler, da de hverken har cellekerner, som mRNA’et skal passere, eller introner, der skal splices ud.

    Translationen

    Translationen er den næste del af proteinsyntesen. Her oversættes mRNA’ets codons til deres tilhørende aminosyrer, som bliver bygget ind i aminosyrekæden. Aminosyrekæden udgør til sidst det endelige protein. Translationen er en nøje afstemt biologisk proces, som kan forløbe med en hastighed på op til ca. 15 aminosyrer i sekundet.

    Translationen begynder på mRNA-stengen ved startcodonet AUG, som har den tilhørende aminosyre methionin (Met). Translationen hjælpes af et stort molekyle, der kaldes et ribosom. Ribosomet vil ofte først binde til et ribosombindingsted på mRNA-strengen, som ligger inden startcodonet (figur 1.7). Efter ribosomet har oversat start-codonet til methionin, vil det fortsætte til det næste codon på mRNA’et, så den næste aminosyre kan sættes på proteinet.

    Hver af de tyve aminosyrer, der kan bruges i proteiner, bliver ’ladet’ (placeret) på en særlig type RNA, der kaldes tRNA (transfer-RNA). Denne påsættelse kaldes aminoacylering. tRNA’et er det molekyle, der afleverer den rigtige aminosyre, som et codon koder for i translationen. Hjulpet af ribosomet binder tRNA til det passende codon på mRNA’et, fordi det selv har et såkaldt anticodon, som består af de tre komplementære nukleotider til codonet (se figur 1.7). Her afleverer tRNA nu sin aminosyre til det protein, der dannes.

    Figur 1.7 Translationen hvor protein dannes fra mRNA. tRNA baseparrer til det næste ledige codon på mRNA-strengen. tRNA’et indsætter dermed den passende aminosyre i den voksende aminosyrekæde, der bliver det nye protein.

    Videoanimation af transkription og translation

    Denne animationen viser først transkription fra den røde DNA-streng. Læg mest mærke til de overordnede principper og hvor fortryllende stærkt, det går! Det er i real-time.

    Den gule streng, der dannes, er mRNA’et. Til sidst ses translation, hvor det blå ribosomkompleks danner proteinet (rødt). Engelsk tale

     

    Replikationen

    Replikation er måden, hvorpå cellen laver en kopi af sit DNA før en celledeling. Når replikationen af en DNA-dobbeltstreng skal til at starte, sørger enzymet helicase først for, at der er arbejdsrum. Helicase adskiller nemlig det dobbeltstrengede DNA til enkeltstrenge i et område, som kaldes replikationsboblen.

    Replikationen sker ved, at DNA-polymerasen katalyserer baseparring af nukleotider og sammensætter disse i en kæde. Derfor vil hver eksisterende DNA-streng få opbygget en helt ny komplementær streng over for sig (se figur 1.8). Resultatet af replikationen er altså, at én dobbeltstreng bliver til to dobbeltstrenge, der hver har én af de oprindelige strenge.

    DNA-polymerase kan ikke selv binde sig til DNA’et for at danne den nye DNA-streng; det er nemlig kun ekspert i at bygge videre på en eksisterende streng. Et andet enzym, primase, er derfor nødt til at danne en indledende komplementær sekvens, som kaldes en primer. Disse korte primere dannes med RNA-nukleotider og skal derfor senere også omdannes til DNA (se røde kugler, figur 1.8).

    Ligesom RNA dannes de nye DNA-strenge ved at tilføje ét nyt nukleotid ad gangen og danne en binding mellem 5’-enden til 3’-enden på det nye nukleotid. Men da der er to modsatrettede strenge, betyder det, at de to DNA-polymeraser må bevæge sig i hver sin retning! De to strenges replikation følger hinanden i samme replikationsboble, men boblens bevægelse vil kun kunne gå i samme retning som én af strengene (kaldes leading strand). Derfor må den modsatte af strengene (lagging strand) dannes i små bidder, der følger med replikationsboblen. Disse mindre stykker kaldes Okazaki-fragmenter (se figur 1.8).

    Især vigtigt at huske:

    Figur 1.8 Replikation af de to modsatrettede DNA-strenge, som resulterer i en kopiering af DNA’et. De nye DNA-strenge (rødlig) startes fra primerne (røde kugler) og syntetiseres af DNA-polymerase i retningen 5′ til 3′.

    Det centrale dogme inden for biologien beskriver den genetiske informationsvej, som alle organismer følger. Generne er kodet som DNA og afskrives efter behov til RNA i transkriptionen. mRNA oversættes i translationen til det protein, som genet koder for. Proteiner deltager i næsten alle vigtige processer i cellerne.
    DNA er dobbeltstrenget og består af fire forskellige nukleotider, der forkortes A, T, G og C. De baseparrer som A-T og C-G.
    mRNA er en enkeltstrenget afskrift af gener, som cellen har behov for. mRNA består af nukleotiderne A, U, G og C.
    Genteknologi gør det bl.a. muligt at ændre DNA og dermed både at slette gener og at indsætte nye eller ændrede gener.

    Naturen råder over mange spændende biologiske stoffer og proteiner, der kan være meget nyttige fx som medicin eller som miljøvenlige enzymer. Det er bare ikke altid muligt at udvinde store nok mængder fra naturlige planter eller organismer, og derfor bliver cellefabrikker interessante.

    Cellefabrikker dannes grundlægges ved at flytte de gener, der instruerer en celle i et interessant stof, over til en mikroorganisme. Mikroorganismen producerer derefter det fx værdifulde medicinske stof, både sikkert og i store mængder.

    Her gennemgås hele designet af en ny cellefabrik, der laver et interessant protein (se eksempler på produkter i listen nedenfor til højre). Metoden kan derefter afprøves i Det virtuelle laboratorium.

    Celler er eksperter i at producere biologiske stoffer

    Genteknologi kan bruges til at omdanne en mikroorganisme til en cellefabrik, som kan producere store mængder af et værdifuldt, fremmed stof. Et stof, der måske har medicinske eller miljømæssige fordele, eller som er forbedret af forskere i forhold til et naturligt stof.

    De celler, der bruges som cellefabrikker, er for det meste gensplejsede med gener fra en fremmed organisme, som naturligt fremstiller det ønskede stof. Disse gener kan også aflæses af den nye celle som en instruktion til at danne stoffet. Generne koder nemlig for de ansvarlige enzymer.

    Figur 2.1. En cellefabrik omdanner simple næringsstoffer som fx glukose til værdifulde produkter.

    Cellefabrikker kan være attraktive af flere årsager. Måske bliver stoffet (produktet) kun naturligt produceret i meget små mængder af en organisme, der lever under nogle ekstreme forhold, som ikke er mulige at efterligne. Eller måske producerer fabrikker stoffet ud fra kemikalier baseret på olie og ved høje reaktionstemperaturer, hvilket heller ikke altid er økonomisk fordelagtigt eller miljøvenligt.

    Hvis det som alternativ kan lykkes at designe en cellefabrik, så producerer den stofferne mod, at cellerne bliver passet med omrøring, så de får ilt, samt at de er i en lun temperatur og får næring som fx glukose og salte. Penicillin produceres fx af en cellefabrik (en svamp). Lige siden penicillins opdagelse til medicin i 1930’erne har kemikere været interesserede i at finde en kemisk metode til at producere det populære antibiotikum. Men det er aldrig lykkes dem at gøre det mere effektivt end cellefabrikkerne, som sidenhen er blevet forbedret yderligere med hjælp af genteknologi.

    Genet for produktet bliver i cellen transkripteret fra DNA til mRNA, som videre translateres til et protein som om, det var cellens eget. Man kan derfor få skabt både kompliceret foldede proteiner af naturens sande eksperter i proteinsyntese og vigtige biologiske stoffer som fx penicillin.

    Nogle gange er cellefabrikkerne endda den eneste virkelige mulighed, hvis det ønskede produkt fx er et protein, man selv har udviklet eller forbedret.

    Gevinsten ved cellefabrikker

    Cellefabrikkernes arbejde kaldes også rekombinant produktion, fordi de anvendte organismer har en ændret genetisk ‘kombination’.

    Rekombinant produktion i cellefabrikker har haft en stor betydning fra midten af 1980’erne. Teknologien betyder fx, at det i dag ikke længere er nødvendigt at udvinde insulin til behandling af sukkersyge fra slagtede svin eller køers bugspytkirtler. I dag produceres insulin af cellefabrikker i store tanke. Insulin fra køer og svin ligner oven i købet ikke humant insulin helt og kan derfor bl.a. give allergiske reaktioner.

    Figur 2.23D-struktur for det menneskelige protein erythropoietin (EPO) fundet efter rekombinant produktion i bakterien Escherichia coli. Kilde: RCSB PDB (1BUY) og Cheetham, J.C. et al. 1998, se referenceliste. Udforsk proteinet i 3D her.

    Takket være cellefabrikker er det heller ikke nødvendigt at udtrække væksthormon fra menneskehjerner til børn med vækstmangel; insulin og væksthormon er i dag to af mange proteiner, som gensplejsede mikroorganismer producerer rent og sikkert (se flere eksempler i marginen).

    Blandt de mange andre vigtige rekombinante proteiner er også knoglemarvshormonet erythropoietin (EPO), der stimulerer dannelsen af røde blodceller. EPO kan gives til patienter med blodmangel, men kendes også især fra brug i cykeldoping.

    Forskningen har også taget rekombinant produktion med cellefabrikker til sig på andre måder. For at nærstudere et særligt celleprotein og fx afsløre 3D-struktur af det, kræves store mængder af proteinet. Tidligere kunne det tage flere år alene at oprense nok af de små naturlige mængder, men i dag kan proteinerne ofte produceres hurtigere rekombinant, så forskerne kan fokusere mere på selve studiet af proteinet.

    Efter teorien bag cellefabrikker er introduceret i denne artikel og Genetisk tuning, vil du selv kunne give dig i kast med at designe og gensplejse din egen cellefabrik i det virtuelle laboratorium. Flere af trinnene minder desuden om generel gensplejsning af mikroorganismer til andre formål end cellefabrikker.

    Ruten til design af en cellefabrik

    1.      Find det proteinkodende gen

    2.      Brug DNA, der aktiverer genet

    3.      Bestem, hvilken celletype der skal producere proteinet

    4.      Skab DNA-sekvensen og indsæt i cellen (gensplejsning)

    5.      Tjek at gensplejsningen lykkedes

    6.      Dyrk cellefabrikken (fermentering)

    7.      Oprens det færdige produkt

    Trinnene beskrives nærmere i det følgende afsnit.

     

    1. Find det proteinkodende gen 

    Grundlæggende handler designet af en ny cellefabrik om at udvælge og indsætte et fremmed gen i en organisme. Her bliver det udtrykt aminosyrer, hvilket vil sige, at organismen danner proteinet, som fx kunne være insulin eller et enzym.

    For at kunne fremstille det ønskede gen skal man først kende sekvensen af proteinet, altså rækkefølgen af  i proteinet.

    Figur 2.3 Oversigt over en rute til design og brug af cellefabrikker, som det forklares i denne artikel. 1. Genet for det ønskede produkt bestemmes ved fx at oversætte aminosyresekvensen til en DNA-sekvens. 2. Genet syntetiseres, så det er indsat i en ekspressionsvektor. 3. Der udvælges en celletype, som er i stand til at danne proteinet korrekt. 4. Cellen transformeres med ekspressionsvektoren. 5. De korrekt gensplejsede celler isoleres ved selektion med hjælp fra en bestemt sekvens i ekspressionsvektoren. 6. Organismen kan nu anvendes i en produktion ved fermentering. 7. Produktet oprenses efter fermenteringen, og produktets renhed sikres. 

    Ved hjælp af den genetiske kode kan aminosyresekvensen oversættes tilbage til den tilsvarende DNA-sekvens i genet (figur 2.4). Dette gøres ved at aflæse, hvilke codons i den genetiske kode, som de forskellige aminosyrer kodes af. Husk, at et codon er tre nukleotider af DNA. Fx koder codonet GTG for aminosyren valin (V) (alle codons kan aflæses i figur 1.3 i 1 Hvad er DNA og gener?). Codon for codon kan DNA-sekvensen dermed findes. Mange organismers totale DNA (genomet) er efterhånden kendt, og herfra kan det enkelte gens DNA-sekvens ofte også let identificeres. Den tilsvarende DNA-sekvens vil være tre gange så lang som aminosyre-sekvensen, fordi tre nukleotider (ét codon), som nævnt, koder for én aminosyre.

    Der findes hele 64 forskellige codons (mulige kombinationer af de forskellige fire nukleotider: 43 = 64), men der bruges kun 20 forskellige aminosyrer i cellerne. Derfor er der flere forskellige codons, der koder for samme aminosyre, og det er derfor muligt at vælge blandt flere forskellige codons, når man oversætter aminosyresekvensen til en DNA-sekvens, og stadig opnå samme aminosyre.

    Det første codon i et nyt gen skal være startcodonet ATG. Det fortæller nemlig cellen, at her begynder koden for genets protein. Som stopsignal, når proteinkoden er slut, findes der tre mulige stopcodons, fx TAG. Disse start- og stopcodons bliver sammen med resten af genets protein-kodende område aflæst til mRNA i transkriptionen på vejen mod at blive protein.

    De DNA-sekvenser, der bliver til protein, starter og slutter med andre ord med hhv. et start- og stop-codon. På deres ydersider findes desuden en række regulerende DNA-sekvenser, der hjælper med at aktivere transkriptionen af genet, så mRNA’et overhovedet dannes (se figur 2.5). Disse regulerende DNA-sekvenser koder ikke for selve proteinet.

    1. Kort fortalt: Genet for det protein eller enzym, cellefabrikken skal danne, skal først findes. Det gøres fx ved at oversætte aminosyrerne i proteinet ét ad gangen til deres codons, som er DNA.

    Figur 2.4Et proteins aminosyresekvens (med ét-bogstavsforkortelser) øverst slås op i den genetiske kode, hvorefter det kan oversættes tilbage til det DNA, der koder for det. ATG er fx startcodon og koder for aminosyren methionin (M), mens TAG er stopcodon (koder ikke for nogen aminosyre).

    Der findes hele 64 forskellige codons (mulige kombinationer af de forskellige fire nukleotider: 43 = 64), men der bruges kun 20 forskellige aminosyrer i cellerne. Derfor er der flere forskellige codons, der koder for samme aminosyre, og det er derfor muligt at vælge blandt flere forskellige codons, når man oversætter aminosyresekvensen til en DNA-sekvens, og stadig opnå samme aminosyre.

    Figur 2.5. Et gen er bygget op af forskellige områder. Codons består af tre nukleotider. Det protein-kodende område består af mange codons.

    Det første codon i et nyt gen skal være startcodonet ATG. Det fortæller nemlig cellen, at her begynder koden for genets protein. Som stopsignal, når proteinkoden er slut, findes der tre mulige stopcodons, fx TAG. Disse start- og stopcodons bliver sammen med resten af genets protein-kodende område aflæst til mRNA i transkriptionen på vejen mod at blive protein.

    De DNA-sekvenser, der bliver til protein, starter og slutter med andre ord med hhv. et start- og stop-codon. På deres ydersider findes desuden en række regulerende DNA-sekvenser, der hjælper med at aktivere transkriptionen af genet, så mRNA’et overhovedet dannes (se figur 2.5). Disse regulerende DNA-sekvenser koder ikke for selve proteinet.

    1. Kort fortalt: Genet for det protein eller enzym, cellefabrikken skal danne, skal først findes. Det gøres fx ved at oversætte aminosyrerne i proteinet ét ad gangen til deres codons, som er DNA.

    Kort, fiktivt eksempel: Et hold forskere vil gerne fremstille et nyt lovende vaske-enzym, som de har fundet i en kulde-elskende bakterie på Grønland. Dette protein vil måske være rigtig godt i tøjvaske ved de miljørigtige, lave temperaturer. De oversætter derfor proteinets 310 aminosyrer ud fra den genetiske kode, så de kender DNA-sekvensen for det nye enzym. Genet indeholder derfor 930 nukleotider samt et stop-codon.

    Et hold forskere vil gerne fremstille et nyt lovende vaske-enzym, som de har fundet i en kulde-elskende bakterie på Grønland. Dette protein vil måske være rigtig godt i tøjvaske ved de miljørigtige, lave temperaturer. De oversætter derfor proteinets 310 aminosyrer ud fra den genetiske kode, så de kender DNA-sekvensen for det nye enzym. Genet indeholder derfor 930 nukleotider samt et stop-codon.

    2. Brug DNA, der aktivere genet

    Genets proteinkodende område (fra start-codon til stop-codon) er som nævnt ikke nok til at få cellen til at producere det kodede protein. Før området skal der være et aktiverende element, og efterfølgende et element, der slukker genet. Disse regulerende områder kaldes promoter, ribosombindingssted (RBS) og terminator (se nærmere i artikel 3 Genetisk tuning).

    For nemt at kunne koble et nyt gen sammen med disse nødvendige hjælpesekvenser, eksisterer der en række forskellige, færdiglavede ekspressionsvektorer. De er cirkulære DNA-sekvenser (plasmider) og indeholder netop de nødvendige, ekstra sekvenser, der passer sammen med den valgte produktionsorganisme og produktet for at give en god produktion af genets protein (udtryk af gen).Genet skal derfor blot sættes ind i ekspressionsvektoren (figur 2.6).

    I det virtuelle laboratorium skal du selv designe det DNA, der skal indsættes i ekspressionsvektoren, og indsætte de forskellige regulerende hjælpesekvenser.

    Figur 2.6. En ekspressionsvektor er et cirkulært DNA (plasmid), der indeholder de nødvendige dele til at udtrykke et ønsket gen i en given celle (ekspression). Det blå element dækker både over genet og de regulerende sekvenser, såsom promoter, RBS og terminator. Selektionsmarkøren beskrives i afsnit 5. Replikations ori er nødvendig for, at ekspressionsvektoren kopieres til cellens datterceller. Promoter, RBS, terminator og Ori forklares nærmere i artikel 3 Genetisk tuning.

    2. Kort fortalt: Det gen, som ønskes brugt, skal aktiveres i cellen, og derfor skal det ledsages af nogle regulerende DNA-sekvenser. Sekvenserne sidder allerede i ekspressionsvektorer, som derfor ofte bliver brugt til at ledsage det ønskede gen.

    Kort, fiktivt eksempel: Forskerne har svært ved at få den grønlandske bakterie til at producere enzymet i laboratoriet og vil gerne flytte det til en effektiv cellefabrik. Derfor vælger de at flytte genet til en ekspressionsvektor, som også indeholder de vigtige regulerende områder, som fx en stærk promoter, så genet bliver effektivt transkriberet i en ny, fremmed celle.

    3. Bestem, hvilken celletype der skal producere proteinet

    Der skal også vælges den produktionsorganisme, som skal anvendes som ‘fabrikken’. Der findes overordnet to forskellige celletyper: Prokaryote og eukaryote. Disse varierer på flere områder, og i designet af en rekombinant produktion må der tages højde for fordelene og ulemperne ved brugen af den ene eller den anden slags celler.

    Figur 2.7Saccharomyces cerevisiae-celler (bagegær). De små, nye celler dannes ved knopskydning fra de store.

    De mindre prokaryote organismer er bl.a. bakterierne. De har den fordel, at de er simplere og hurtigere at arbejde med. Men prokaryoter har ikke det nødvendige indre maskineri til at foretage avancerede, afsluttende ændringer i det protein, som de skal producere. Fx kan de mangle evnen til at folde proteinets vigtige tredimensionelle struktur korrekt eller tilføje sukker-grupper til proteinet (glykosylering), som kan være vigtige for fx medicinske proteiners funktion. I cellefabrikker, hvor man kan nøjes med en prokaryot organisme, kan valget fx falde på bakterierne Escherichia coli eller Bacillus subtilis, der er simple og nemme arbejdsorganismer.

    I andre tilfælde vil man i stedet vælge en eukaryot organisme. Her bliver bagegæren Saccharomyces cerevisiae (figur 2.7) ofte brugt, da den også er nem at arbejde med genetisk, og dens indre reaktioner er meget velkendte.

    De eukaryote celler indeholder et endoplasmatisk reticulum, der kan modtage de nye, translaterede proteiner for at foretage eventuelle glykosyleringer eller andre modifikationer.

    Til rekombinant produktion af visse medicinske proteiner, som fx EPO, kræves faktisk så komplicerede glykosyleringer, at der i stedet må bruges celler udvalgt fra de eukaryote mammale organismer (dvs. pattedyr, som fx hamstere). Mammale celler efterligner de menneskelige glykosyleringer meget bedre end simplere eukaryoter, som fx gær. Men mammale celler er meget mere skrøbelige, langsomme og kræver nænsom pasning! Det kan sågar også være nødvendigt at tilsætte dyrt serum fra dyreblod i næringsmediet, for at de skal gro godt.

    Andre avancerede celletyper kan være insektceller eller skimmelsvampe.

    3. Kort fortalt: Den celletype, der ønskes brugt til at producere det biologiske stof, skal vælges med omhu. Bakterier er simple, men hurtige og nemme. Avancerede medicinske proteiner vil typisk bedre blive dannet af celler fra pattedyr, som er meget vanskeligere at dyrke.

    Kort, fiktivt eksempel: Forskerne vil helst lave en meget simpel cellefabrik, og de vælger derfor bakterien E. coli som produktionscelle. De tror nemlig ikke, at deres vaskeenzym er for avanceret at danne, nu hvor det også naturligt bliver produceret af en bakterie.

    4. Skab DNA-sekvensen og indsæt i cellen (gensplejsning)

    Hele det nye, rekombinante DNA, der skal indsættes i cellen, findes selvfølgelig ikke færdigt sammensat nogen steder i naturen. De enkelte DNA-sekvenser (fx selektionsgen, promoter og proteinkodende region) skal derfor sættes sammen med hjælp fra genteknologien. Til dette findes der forskellige metoder. For eksempel kan det proteinkodende DNA, som nævnt sættes ind i en færdig ekspressionsvektor ved brug af restriktionsenzymer og ligase.

    Figur 2.8. Ved transformation optager en celle fremmed DNA.

    I forskning og udvikling, hvor der ikke altid er tid til de ældre metoder til at sammensætte DNA, er det omkring udgangen af 2000’erne blevet økonomisk realistisk at bestille hele den færdigt sammensatte DNA-sekvens. DNA-sekvensen bliver da kemisk syntetiseret af specialiserede syntetiseringsfirmaer

    I det virtuelle laboratorium vil du få syntetiseret hele dit designede DNA kemisk på denne måde.

    Selve indsættelsen af DNA’et i den nye celle kan foregå på forskellige måder. Alle måderne har det til fælles, at cellens ydre membran gøres gennemtrængelig, så det nye DNA kan bevæge sig (diffundere) fra opløsningen og ind i cellen (figur 2.8). Optagelsen af fremmed DNA kaldes transformation.

    I det virtuelle laboratorium benytter vi elektroporation som transformationsmetode. Her udsættes cellerne for et kortvarigt, højt elektrisk felt.

    Der findes dog også andre tricks for at få en celle til at optage det fremmede DNA

    Kort fortalt: Det nye DNA skal først skabes. Det kan ske ved kemisk syntese (dannelse) eller med restriktions- og ligase-enzymer (klippe og klistre). Derefter skal cellerne optage DNA’et. Denne proces kaldes transformation.
    Kort, fiktivt eksempel: Forskerne indsætter genet i ekspressionsvektoren. De tilsætter DNA’et til en lille opløsning med bakteriecellerne, som de giver stød med elektroporatoren. Nu har nogle af coli-cellerne forhåbentligt optaget genet.

     Figur 2.9. Kun de gensplejsede celler vil kunne gro på næringsplade med antibiotikum, fordi de har opnået et resistensgen i gensplejsningen

     

    5. Tjek, om gensplejsningen lykkedes

    Kun meget få celler vil rent faktisk ende med at optage DNA’et efter en gensplejsning. For at undgå at komme til at udvælge en af de upåvirkede celler, når der arbejdes videre, efterfølges transformationen af en selektion (udvælgelse)

    Selektionen betyder, at kun de få, gensplejsede celler kan overleve.

    I selektion bruges et selektionsgen, som også sidder i ekspressionsvektoren (figur 2.6). Selektionsgenet giver de korrekt transformerede organismer en overlevelsesfordel, fx resistens over for et antibiotikum. I en selektion med antibiotikum kan organismerne udplades på en petriskål med et antibiotikumholdigt medium. Her vil kun de transformerede celler kunne vokse videre. Hvis en cellekoloni vokser frem, er den derfor højst sandsynligt gensplejset (figur 2.9).

    Nogle gange er selektionsgener ikke kun nødvendige for at udvælge en transformeret celle, men også for at tvinge cellen til at beholde DNA’et bagefter. Det hænder nemlig, at ikke alle celler under de næste celledelinger får en kopi af ekspressionsvektoren med. Det kan ske, hvis det indsatte DNA ikke er sat fast som en del af kromosomerne, men sidder i en ekspressionsvektor, som repliceres (kopieres) uafhængigt af kromosomerne. Cellerne uden vektoren gror gerne hurtigere, fordi de ikke skal tynges af at producere produkter, som for cellen blot er ligegyldigt protein. De vil derfor begynde at udkonkurrere de langsommere, gensplejsede celler.

    Cellerne kan tvinges til at fastholde DNA’et ved at fortsætte tilsætningen af antibiotikum. Her dør de celler, som måtte have tabt DNA’et (og dermed selektionsgenet).

    Som nævnt kan DNA’et indsættes direkte i et kromosom i cellen som alternativ til at indsætte DNA’et i en ekspressionsvektor. Når DNA’et først sidder i kromosomet, er der ikke den samme risiko for, at DNA’et forsvinder igen. I cellefabrikker i industrien er dette bl.a. ønskeligt for at undgå brugen af antibiotika. Ekspressionsvektorer bruges især gerne i de indledende forsøg, mens indsætning af DNA’et på cellens kromosom mere bruges til færdige cellefabrikker.

    En genetisk variant af en organisme kaldes en stamme, transformant eller mutant. De nye gener i stammen gør den (forhåbentlig) til en effektiv, kommende cellefabrik. Det kan bekræftes endeligt, om det nye DNA er sat ind som planlagt, ved at foretage en DNA-sekventering af det område af kromosomerne, der skulle ændres.

    Southern blotting kan også anvendes til at fastslå, at en bestemt DNA-sekvens er til stede, fx det indsatte gen

    Efter priserne for nylig er faldet på DNA-sekventering, er det dog tit det mest attraktive valg.

    5. Kort fortalt: Det er sjældent lige til at se på en celle, om den har optaget det DNA, man har villet gensplejse ind i den. Derfor skal man bruge selektion til at udvælge de korrekt gensplejsede celler. For at være helt sikker kan man desuden vælge at aflæse selve DNA’et, hvilket kaldes sekventering.

    Kort, fiktivt eksempel: De fleste celler overlevede ikke elektroporatorens elektriske felt, men en lille del ser ud til at kunne vokse i et medium med antibiotikum. Dette betyder, at disse celler nu formentlig har det nye gen, fordi det blev indsat sammen med et gen for antibiokaresistens i en ekspressionsvektor.

     

    Protein eller metabolit?

    Cellefabrikkens produkt kan være et protein eller en metabolit, og det er vigtigt at forstå forskellen. Proteiner er de direkte produkter, der skabes ud fra den indsatte DNA-sekvens, fx insulin. Metabolitter er derimod det overordnede navn for alle de stoffer, der dannes i cellen ved biokemiske reaktioner. Reaktionerne foretages af enzymatiske proteiner, som fx kan være skabt fra en indsat DNA-sekvens. Cellens DNA afgør således også, hvilke metabolitter der produceres, ved at kode for de ansvarlige enzymatiske proteiner. Metabolitterne er typisk væsentligt mindre end proteinerne.

    I nogle få cellefabrikker er man interesseret i cellemassen og ikke dens produkter. Fx er et projekt under udvikling, hvor havalger dyrkes op til brug som biobrændsel.

    6. Dyrk cellefabrikken (fermentering)

    Den nye genmodificerede organisme er i princippet klar allerede nu til at producere det rekombinante protein eller metabolit i store mængder. Men for at få det største udbytte vil man typisk først eksperimentere i mindre laboratorieskala for at finde de optimale forhold. Mikroorganismer kan være stædige, besværlige producenter, der fx kun producerer nok, hvis de bliver sultet svagt med næringen eller oplever en bestemt pH-værdi! Årsagen findes gerne i cellens indre mekanismer, som hele tiden sørger for at styre de forskellige biokemiske reaktioner. Disse mekanismer kan være svære, men nødvendige, at forstå for at udvikle en effektiv cellefabrik.

    Produktionen, der forløber, mens mikroorganismerne dyrkes, kaldes fermentering (eller gæring). Den foregår for det meste i tanke, der har en størrelse fra en halv liter i laboratorierne til op mod 200.000 liter i industrien (se figur 2.10).

    Figur 2.10. Små laboratorie-fermentorer, hvor cellefabrikker kan dyrkes og undersøges. Fermentorer fra Institut for Systembiologi, DTU.

    Små laboratorie-fermentorer, hvor cellefabrikker kan dyrkes og undersøges. Fermentorer fra Institut for Systembiologi, DTU.

    6.  Kort fortalt: Dyrkningen af mikroorganismerne kaldes fermentering. Der foretages gerne mange små forsøgs-fermenteringer for at finde de optimale forhold.

    Kort, fiktivt eksempel: Forskerne kan nu dyrke (fermentere) deres celler i små forsøgstanke for at producere vaskeenzymet. På den måde kan de eksperimentere med temperatur, pH, osv. for at optimere cellefabrikkens udbytte og hastighed

     

    7. Oprensning til færdigt produkt

    Når en fermentering er løbet til ende, høstes fermenteringsblandingen. En høstet fermenteringsblanding består af de tilbageværende næringssalte, celler og deres udskilte metabolitter. Under fermenteringen produceres produktet enten intracellulært (inden i cellerne) eller ekstracellulært, hvor de eksporteres ud af cellen. Derfor venter der efter fermenteringen en svær og vigtig udfordring med at sikre en høj andel af produktet i en acceptabel renhed.

    Kravet til renhed er meget højt for medicinske stoffer, mens produkter til industriel brug typisk kan accepteres i lidt lavere renhed. Årsagen til, at det kan være fordelagtigt at acceptere en lavere renhed, skyldes, at en mindre del af produktet går tabt under oprensningen, når der stilles lavere renhedskrav. Desuden betyder små urenheder ikke altid så meget. I oprensning af enzymer kan fx 70 % gå tabt undervejs.

    Design af en mikrobiologisk oprensningsproces kræver både kendskab til de biologiske og kemiske forhold for det aktuelle produkt og fermenteringsblanding. Processen er typisk sat sammen af en række trin, alt efter behov. Blandt de vigtige er filtrering, centrifugering og kromatografi.

    Produktets renhed og kvalitet kan til sidst sikres ved test med kromatografisk udstyr.

    Og hvad bliver der af alle cellerne (biomassen) efter fermenteringen? Hvis de slås ihjel med varmebehandling, kan de fx blive til gavn en sidste gang som næringsrigt gødning på markerne.

    Hvis produktet består kvalitetstesten, er det nu klar til pakning og salg, såfremt det har myndighedernes godkendelse.

    7. Kort fortalt: Når cellerne er færdige med at producere deres produkt, skal det værdifulde nye produkt oprenses fra alle celleresterne og de andre dannede stoffer. Herefter skal det kvalitetstestes inden salg.

    Kort, fiktivt eksempel: Vaskeenzymet skal adskilles fra den høstede fermenteringsblanding. Oprensningsopgaven bliver desværre ekstra besværlig, fordi den valgte bakterie ikke eksporterede enzymet ud af cellen. Efter flere oprensninger er der ikke meget af enzymet tilbage, men heldigvis viser tests dog, at produktet er tilstrækkelig rent. Udviklerne får derfor besked af ledelsen på, at de godt kan skynde sig at optimere cellefabrikken til masseproduktion i store fermenteringstanke.

    Især vigtigt at huske:

    Cellefabrikker er celler, der fermenteres for at producere et interessant protein såsom insulin eller metabolitter såsom penicillin.

    Cellefabrikkerne kan designes ved at gensplejse cellen med en ekspressionsvektor, der indeholder det proteinkodende DNA og de nødvendige genregulerende sekvenser.

    •  Selektion kan bruges for at udvælge de rigtigt gensplejsede celler med fx antibiotikaresistens.
    • Cellerne dyrkes ved fermentering, hvor de optimale produktionsforhold skabes mht. næring og temperatur m.m. Til sidst skal produktet oprenses fra alle de øvrige celledele.

    I fremtidens samfund kan der blive mangel på stoffer, vi i dag bruger, som fx benzin fra olie og måske endda visse fødevarer, som følge af befolkningsudviklingen.
    Det er en af grundene til, at det er interessant at optimere en cellefabrik, så den producerer mest muligt af dens værdifulde produkt.

    Bør læses efter artikel 2 om cellefabrikker.

    Cellen har tusindvis af gener, så derfor er den nødt til at styre, at kun de nødvendige gener er aktive.

    Ved at forstå gen-reguleringens tænd/sluk-mekanismer kan de efterlignes til at tune en celle, så den producerer mere!

    Det er ikke sikkert, at en ny cellefabrik producerer særlig meget af det ønskede stof. Et eksempel er fx miljøvenligt biobrændstof, som forskere forsøger at producere ved at indsætte de nødvendige enzymer i mikroorganismer, der gerne skulle omdanne fx affald til bio-ethanol! Gener aflæses med forskellig styrke, som afhænger af genets regulering. Det gælder også et indsat gen, der instruerer cellen i at danne dens produkt, fx et nødvendigt enzym i dannelse af bio-ethanol.

    Den stigende forståelse for genreguleringen har gjort det muligt at skrue op for de interessante gener og derved ‘tune’ cellen til at producere øgede mængder. Og på samme måde kan vi også skrue ned for de uønskede gener i cellen eller helt fjerne dem.

    Hvis cellerne producerer et sjældent medicinstof, kan man givetvis score så stor en økonomisk gevinst ved omsider at kunne tilbyde en behandling, at det ikke er værd at bruge meget tid på at optimere organismen. Men hvis stoffet fx skal sælges i konkurrence med den kemiske industri, er det uhyre vigtigt, at cellen ikke spilder værdifuld næring på ligegyldige stoffer eller er for sløv, så prisen bliver for høj. Man kan derfor forsøge genetisk at ’tune’ organismen til at producere mere og hurtigere eller fx udnytte næringen bedre, så udbyttet forbedres.

    I denne artikel behandles disse genetiske mekanismer, der styrer cellen, og som kan ændres med genteknologi. Nogle af disse produktionsforbedringer kan også opnås ved at eksperimentere med at finde cellens foretrukne temperatur, næringskoncentration og andre betingelser. I industrien vil man ofte forsøge begge dele ved udviklingen af cellefabrikker.

    Genetisk optimering af en cellefabrik handler grundlæggende om at øge produktionen af protein fra det kodende gen. Generne kan fx aktiveres kraftigere ved at ændre i den biologiske regulering, som styrer både transkriptionen fra DNA til mRNA, og translationen af mRNA til protein. Men fordi det drejer sig om komplekse, levende organismer, findes der ingen fast, idiotsikker metode; man må tænke og eksperimentere sig frem fra situation til situation.

    Genregulering – Genernes tænd/sluk-knapper

    Hvorfor genregulering?

    Mange gener er kun nødvendige i særlige situationer og har derfor behov for en skarp regulering af deres ekspression (udtryk).
    Nogle bakterier bærer fx særlige selvmordsgener, som selvsagt ikke skal udtrykkes normalt, mens andre gener hjælper til som forsvar på varmechok, og derfor kun skal udtrykkes som beskyttelse ved høje temperaturer.

    I flercellede organismer styrer reguleringen også den specialisering, der skaber de forskellige celletyper. Således dannes det iltbærende protein hæmoglobin fx i de røde blodceller, men ikke i huden, hvor det er ubrugeligt.

    Figur 3.1 Oversigt over nødvendige, regulerende dele for gen-ekspression. Det ses desuden, om de er til stede på DNA-, mRNA og protein-niveau. Længderne på figuren svarer ikke til de aktuelle længder. RBS: Ribosombindingssted. ATG: Startcodon. TAG: Stopcodon

    Reguleringen af generne er utrolig vigtig for, hvordan cellerne bliver, men også fordi den også sikrer, at organismen sparer på ressourcerne ved kun at producere de proteiner, der er nødvendige.

    Som figur 3.1 viser, vil DNA’et for ét gen typisk indeholde mange flere elementer end blot den proteinkodende region. Også de omkringliggende elementer deltager i genreguleringen.

     

    Promoter: Øgning af genets transkription

    Når et protein fra et gen skal bruges i cellen, bliver transkriptionen af genets DNA aktiveret. Der dannes nu mRNA og dermed protein (forklaret i 1 Hvad er DNA og gener?). Kort inden den protein-kodende region af genet sidder der på DNA-strengen en bestemt sekvens kaldt en promoter, der netop har den opgave at hjælpe med at aktivere transkriptionen (figur 3.1). Gener, der altid bruges, har meget stærke promotere, som gør at generne altid er tændte og transkripteres. Omvendt findes promotere, der kun aktiveres i ganske særlige situationer, hvor genet er nødvendigt. Det kunne fx være, hvis cellen får et varmechok og skal beskytte sig. Genteknologien gør det muligt snedigt at udvælge lige den promoter, der passer godt til at aktivere det producerende gen i en bestemt cellefabrik.

     

    Promoterens biologiske virkningsmekanisme

    DNA’et der udgør en promoter, kan tiltrække helt særlige proteiner, der binder til promoteren. Disse proteiner kaldes transkriptionsfaktorer. Transkriptionsfaktorer kan være meget specialiserede til bestemte promoterer, hvor de kan binde til en helt speciel DNA- sekvens. Transkriptionsfaktorerne er kun til stede i cellen, når der er behov for transkription af de pågældende gener. Binding af disse transkriptionsfaktorer til promoteren på DNA’et er nemlig med til at guide enzymet RNA-polymerase til også at binde DNA’et, så det kan begynde at transkriptere DNA’et til mRNA. En sådan transkriptionfaktor kaldes også en aktivator.

    I genetisk optimering af en cellefabrik er det som udgangspunkt smart at vælge en kraftig promoter, der fører til produktion af meget protein og dermed det ønskede produkt.
    En promoter, der altid fører til transkription af DNA’et, kaldes konstitutiv. Men disse promotere er ikke altid de smarteste at anvende til at styre transkriptionen i en cellefabrik. Man kan nemlig ikke forhindre genet i at blive transkriperet hele tiden. Cellerne går straks i gang med at producere proteinet, selv mens de er i deres begyndende vækstfase, hvor ressourcerne måske hellere skal spares til først at skabe flere celler, inden selve produktionen af proteinet startes.

    En anden promotertype kaldes inducibel, fordi bestemte forhold skal til for at starte transkriptionen. Det kan enten være fysiske betingelser (fx lav/høj temperatur) eller kemiske betingelser (fx tilstedeværelsen af et bestemt stof). En inducibel promoter kan derfor være smart at bruge med produktionsgenet i en cellefabrik. Det er især klogt, hvis produktet ligefrem har en giftig påvirkning af værtscellen. Med en inducibel promoter, kan man vente med at aktivere genet, til rigtig mange celler er vokset frem.

     

    Terminator af transkription

    Det kan være klogt at tilføje en terminator-sekvens lige efter genet, der koder for proteinproduktet (figur 3.1). En terminator sørger for at transkriptionen ophører, når RNA-polymerase når frem til den på sin vej hen ad DNA’et. Uden en terminator risikerer man også at få transkripteret så meget af den efterfølgende, irrelevante DNA-kode fra ekspressionsvektoren, at det forstyrrer cellen. Det ekstra mRNA som følger med kan også gøre mRNA’et meget ustabilt og letnedbrydeligt.

     

    Ribosombindingssted (RBS) hjælper med genets translation

    Translationen af mRNA til protein kan også øges genetisk. Inden selve den protein-kodende sekvens på mRNA’et (dvs. inden startcodonet) sidder der nemlig en sekvens, der er et ribosombindingssted (RBS) (figur 3.1). Der er forskel på typerne mellem eukaryoter og prokaryoter, men fælles er, at ribosomet her bindes inden, det bevæger sig hen til startcodonet og begynder selve proteinsyntesen. Ved at vælge bestemte RBS’er kan det lade sig gøre at opnå en bedre ribosombinding og dermed bedre translation af mRNA’et til protein.

     

    Start- og stopcodon

    Det første codon, der translateres til et protein, er altid startcodonet med mRNA-koden AUG. AUG koder for aminosyren methionin (T i DNA erstattes som bekendt af U i mRNA). I princippet begynder alle proteiner derfor med methionin. Tre af de 64 forskellige codons koder ikke for en aminosyre, men er i stedet stopcodons: DNA-koderne UAG, UGA og UAA får translationen af mRNA’et til at ophøre (figur 3.1). Læs mere om codons i artiklen Cellefabrikker.

     

    Flere kopier af genet

    Hvis et gen findes i flere kopier i cellen, øges også muligheden for at lave mere mRNA af det, og dermed øges også hvor meget protein der i sidste ende dannes. Når genet sidder i en ekspressionsvektor, afgøres genets antal kopier i cellen af den Ori-sekvens (Origin of replication), der er sat i vektoren. DNA-replikationen starter nemlig ved Ori, og der findes både stærke og svage af disse sekvenser. Nogle Ori-sekvenser giver fx kun én kopi af ekspressionsvektoren i cellen, mens andre stærke Ori kan give omkring 200 kopier i hver celle. Inden man så nu skynder sig at vælge den kraftigste Ori-sekvens, skal man være opmærksom på, at cellens vækst sænkes af at producere rigtig mange kopier, så produktionen måske slet ikke bliver større alligevel!

     

    Optimering der ikke skyldes genregulering

    Codon-optimering

    Som nævnt koder flere forskellige codons i den genetiske kode for den samme aminosyre. Men det har vist sig, at nogle organismer foretrækker bestemte codons. Fx koder AAT og AAC begge for aminosyren asparagin, og hele seks forskellige codons koder for arginin (figur 1.3). Men én organismes gener vil typisk kun bruge nogle bestemte codons for hver aminosyre, idet hvert codon kræver én slags tRNA, og tRNA’et har forskellig udbredelse i de forskellige organismer. Der er udviklet små computerprogrammer, der kan lave optimeringen af det DNA, der skal bruges. DNA’et kunne fx stamme fra et pattedyr med væsentligt anderledes codon-brug end den bakterie- eller gærcelle, der skal bruges i cellefabrikken.

    Optimering til oprensning: His-mærke

    Genetisk optimering for at forbedre den efterfølgende oprensning kan også være en god idé, da gevinsten ved et højt DNA-udtryk nemt mistes, hvis proteinet bagefter viser sig svært at oprense, og der derfor tabes en stor andel af proteinet for at opnå den nødvendige renhed.

    I bakterien Escherichia coli og andre prokaryoter kan en af optimeringsmetoderne være at koble et histidin-mærke (på engelsk: His-tag) til proteinet. Histidin-mærket består af mindst seks efterfølgende histidin-aminosyrer, der gør det nemmere at fiske netop dette protein fra alle de andre under oprensningen. Codons for histidin-halen indsættes som en del af det nye DNA i cellen, så det automatisk vil være koblet til en af enderne på det færdige protein.

    Histidin er en aminosyre, som gerne vil binde til metalioner som fx Ni2+ og Zn2+. Med en hel række af histidiner påsat for enden vil disse proteiner kunne binde til et net af nikkel-ioner, som oprensningsvæsken hældes igennem (figur 3.2).

    Figur 3.2. Oprensning af protein med histidin-mærke. Mærket indsættes genetisk til produktet, og produktet vil nu pga. histidin-grupperne binde til et nikkelgitter, mens resten af væsken rinder igennem og kasseres. Derefter frigives produktet ved at skylle med fri histidin, der vil binde til nikkelgitteret i stedet for det histidin-mærkede produkt.

    Især vigtigt at huske:

    • En cellefabrik kan optimeres genetisk ved at bruge forskellige tricks, der ofte ændrer ved genreguleringen.
    • Genregulering er en meget vigtig egenskab, der hele tiden sørger for, at kun de nødvendige gener udtrykkes.
    • Det er vigtigt at vælge en egnet promoter til rekombinant produktion. Promoteren er en slags startknap til genets transkription og findes i forskellige typer og styrker.

    Genteknologien besidder flere kraftfulde værktøjer, som bl.a. kan tages i brug ved design af en ny cellefabrik og i generel biologisk forskning.

    Det er disse teknikker, der bl.a. kan skabe en ny DNA-sekvens til indsætning i en celle og bagefter teste, om sekvensen faktisk er til stede i organismen.

    De genteknologiske værktøjer kan fx afsløre, hvad der foregår langt under mikroskopisk niveau i en prøve med bare få nanogram DNA!

    Flere af værktøjerne kan forstås uden kendskab til hinanden, så vælg evt. de ud, der er interessante for dig.

     

    Grundlæggende værktøjer til sammensætning af ny DNA-sekvens:

    • PCR
    • Kemisk DNA-syntese
    • Gelelektroforese: Adskillelse af DNA eller protein
    • DNA restriktionsskæring og ligering


    Værktøjer til gensplejsning:

    • Transformation
    • Screening og selektion


    Værktøjer til at teste om gensplejsningen er lykkedes:

    Er DNA’et i cellen?

    • Southern blotting
    • DNA-sekventering: Næste generation

    Er proteinet, som DNA’et koder for, i cellen?

    • Western blotting
    • ELISA

    Værktøj til at teste genets påvirkning af cellen og bruge cellefabrikken:

    • Fermentering med cellefabrikker

     

    DNA-sekventering (næste generation)

    DNA-sekventering vil sige at aflæse rækkefølgen af nukleotiderne (A, T, C og G) i et stykke DNA.

    Niveau: Mellem-højt, også interessant i kemi

    DNA-sekventering er kortlægningen af den nøjagtige DNA-sekvens, altså rækkefølgen af nukleotiderne A, T, C og G.

    Siden forskere i halvfemserne gik i gang med den enorme opgave at sekventere al DNA på et menneskes kromosomer (det humane genom), er teknikken udviklet kraftigt, så prisen og tiden er markant mindsket. Derfor kan et menneskes 3 mia. nukleotider DNA i dag sekventeres på uger modsat de over 10 år, som det første humane genom tog! DNA-sekventering kan også bruges fx til at kontrollere en DNA-sekvens, forskere selv har sat sammen i laboratoriet.

    Ud over det humane genom er en lang række organismers genomer i dag sekventeret, og de store længder DNA-sekvens er tilgængelige på særlige websites. Eksperter forventer, at prisen inden for 10 år vil falde nok til, at vi alle får råd til at kende vores personlige genom og dermed tilbøjeligheden til visse sygdomme m.m.

    Der sker i øjeblikket en kraftig udvikling i nye teknologier til DNA-sekventering for at imødekomme behovet for hurtig og præcis sekventering af de store længder DNA i et genom. En ny teknologisk generation er derfor i færd med at afløse de tidligere metoder, som fx Sanger-metoden (med dideoxy-nukleotider), der er for dyr og langsom til store længder DNA.

    Her beskrives én af de førende, næste generations-metoder:
    Illumina-metoden

    Forberedelse af skabelon til sekventeringen

    DNA’et, der skal sekventeres, skæres først i kortere længder, som skilles fra hinanden og bliver sekventeret hver for sig. De skal først kopieres op i antal, så de senere kan give et tydeligt signal i sekventeringen. Denne forstærkning af DNA’et minder om en slags PCR og sørger for, at de kopierede sekvenser er fæstnet til bunden ved siden af hinanden i ens grupper. De er nu klar til at blive aflæst i selve sekventeringen (se øverst i figur 1).

     

    Sekventeringen

    Sekventeringen er en utrolig blanding af kemi og biologi, hvor specialdesignede nukleotider og det DNA-replicerende enzym DNA-polymerase indgår i en særlig reaktion. I denne sekventeringsteknik bruges cyklisk reversibel terminering (CRT).

    Overordnet går CRT-metoden ud på, at DNA-polymerase sættes til at replicere (kopiere) det bundfæstnede, enkeltstrengede DNA, der er forberedt til sekventeringen. Men i stedet for at bygge en ny kopi af DNA-strengen med de naturlige nukleotider, er der tilsat nogle kemisk forandrede udgaver af nukleotiderne (figur 2), som gør det muligt at aflæse hvilke nukleotider, der indsættes i kopien.

    Figur 1DNA-sekventeringen foregår ved en særlig kopiering af DNA’et, hvor de brugte byggesten (nukleotiderne) bærer en fluorescerende gruppe. I aflæsningsresultatet er hver farveplet et område, hvor en gruppe af ens DNA-strenge sekventeres. Der nås til den næste nukleotid i sekvensen for hvert billede, og ved brug af farvekoderne, kan sekvenserne derfor afkodes.

    Når enzymet DNA-polymerase i en celle replicerer en DNA-streng, aflæser den sekvensen og indsætter det komplementære nukleotid overfor i den nye streng. Dette princip bruges også her, men ved CRT-sekventering, indeholder nukleotiderne også en blokerende kemisk gruppe, samt en fluorescerende gruppe (figur 2), der både giver et farvet, fluorescerende signal og blokerer DNA-polymerasen i at fortsætte til næste nukleotid. Dette stopper DNA-polymerase i dens fremfærd og betyder, at den kun kan sætte ét nukleotid på.Hver af nukleotiderne har sin fluorescerende farve, og derfor kan en laser-læser afkode præcis, hvilket nukleotid, der nu er sat på DNA-strengene i hver af grupperne, som er fæstnet på bunden (nederst figur 1).
    Det specielle nukleotids blokerende og fluorescerende grupper, kan nu kløves af, og DNA-polymerase kan dermed fortsætte videre til næste nukleotid – deraf navnet cyklisk reversibel terminering. Hele denne proces sker i en næsten svimlende hastighed, der svarer til at ca. 50 nukleotider afkodes i sekundet (2010). Som nævnt sekventerer man DNA’et i mindre fragmenter ad gangen. Disse DNA-fragmenter sættes bagefter sammen til fulde sekvenser ved at sammenligne overlappende sekvenser i fragmenterne med computerprogrammer.

    Flere andre teknologier til DNA-sekventering, der bygger på andre principper, er også i udvikling i den skarpe konkurrence om høj hastighed og lav pris. Interessen i at kortlægge DNA forventes nemlig kun at stige.

    Figur 2. Eksempel på et af de særlige nukleotider, der bruges til at kopiere en DNA-streng under sekventeringen. De fire forskellige baser har hver deres fluorescerende farve, så en laser kan aflæse hvilket nukleotid, der er sat på. Hvis der fx sættes et C (cytosin) på, må der således sidde et G (guanin) dette sted i den sekventerede streng. Når farven er aflæst, skæres de to grupper af, så den næste komplementære nukleotid kan påsættes og dermed aflæses

    Eksempler på brug af DNA-sekventering:

    Genom-kortlægning

    DNA-sekventering bruges til at kortlægge samtlige gener (genomet) i efterhånden rigtig mange organismer. Det første humane genom blev offentliggjort i 2003 og var 13 år undervejs! I mellemtiden er teknologien blevet så hurtig og relativ billig, at fx heavy metal-ikonet Ozzy Osbourne i 2010 fik sit genom fuldt sekventeret, og det hele tog under fire måneder. Andre stjerner har også fået deres fulde genom sekventeret, og eksperterne spår, at fremtiden kun vil gøre kortlægning af vores genomer mere udbredt.

    Se en oversigt her fra det amerikanske National Center for Biotechnology Information over det voksende antal sekventerede genomer fra forskellige organismer.

    Gentest for sygdomme:
    En fuld genom-sekventering er stadig dyr, så i stedet tilbyder firmaer fra bl.a. USA og Island at sekventere særlige gener ud fra en indsendt spytprøve. Resultatet kaldes en gentest og kan vurdere sandsynligheden for at udvikle visse sygdomme m.m. Gyldigheden af disse gentests diskuteres dog stadig, da flere eksperter ikke mener, det er muligt at udregne disse sandsynligheder særlig troværdigt i øjeblikket.

    Arbejdsspørgsmål:

    1. Hvad vil det sige at sekventere DNA?
    2. Hvilke fordele kan det have at kende DNA-sekvensen i fx et menneske?
    3. Hvad gør DNA-polymerase normalt i en celle, og hvad er forskellen, når enzymet bruges i sekventering?
    4. Hvad er grunden til, at der kommer et farvet signal, hver gang et af nukleotiderne i en DNA-sekvens aflæses?

     

    Kemisk DNA-syntese

    Kemisk DNA-syntese bruges til at fremstille DNA-strenge med en ønsket sekvens (rækkefølge af nukleotiderne A, T, C og G).

    Niveau: Mellem-højt, også interessant i forbindelse med kemiundervisningen

    Prisen er på det seneste faldet drastisk på DNA-sekvenser, der fremstilles kemisk. I dag kan man via internettet bestille præcis sin ‘favorit DNA-sekvens’, som ikke findes naturligt nogen steder, og få den sendt til laboratoriet. Et eksempel kunne være et naturligt optrædende gen sat sammen med genet for grønt fluorescerende protein (GFP). GFP får det naturlige gens protein til at blive selvlysende, hvilket kan afsløre proteinets placering i cellen.

    Den store fordel ved kemisk DNA-syntese er, at de langsommere molekylærbiologiske klonings teknikker kan springes over, så det nye DNA hurtigere kan bruges til gensplejsning. Kemisk DNA-syntese bruges også til at designe primere, der er ca. 20 nukleotider lange sekvenser anvendt i PCR, som bruges til opkopiering af DNA i meget molekylærbiologisk arbejde.

    De fire trin i cyklussen

    En cyklus, der forlænger DNA-strengen én gang, kan opdeles i disse fire trin (se også figur 2):

    1. DMT fjernes. Den beskyttende DMT-gruppe på den foregående nukleotid fjernes ved reaktion med en syre, så 5′-enden bliver reaktiv.
    2. Ny phosphoramidit tilsættes. Den næste phosphoramidit i sekvensen (A, T, C eller G) aktiveres og tilsættes blandingen. Den danner nu en phosphit-triester-binding til 5′-hydroxygruppen, hvorved DNA-strengen forlænges.
    3. Capping. En lille andel binder ikke nogen ny phosphoramidit, og disse ‘cappes’, hvilket vil sige, lukkes for fremtidige reaktioner i kommende cyklusser, så der ikke opstår sekvenser undervejs med manglende nukleotider. Cappingen foregår ved påsætning af en acetyl-gruppe (-COCH3).
    4. Oxidation. Mellem det nye og foregående nukleotid oxideres phosphit-gruppen til den naturlige phosphat-gruppe i tilstedeværelse af iod og en svag base, og cyklussen er nu tilendebragt.

    Figur 2Oversigt over en kemisk DNA-synteses fire trin i en cyklus nummer n. I hver cyklus tilføjes et nyt nukleotid til DNA-strengen. Her er det nye nukleotid markeret med gul.

     

    Når alle de brugervalgte nukleotider er sat på, skal strengen løsnes fra støtten, og det sidste nukleotids DMT-gruppe fjernes. Da phosphoramiditterne bærer en methyl-gruppe (-CH3), skal disse også fjernes fra alle samlingerne af nukleotiderne. Når de syntetiserede DNA-strenge bliver lange, øges risikoen for fejl, og man vil derfor sjældent syntetisere længere sekvenser end ca. 200 nukleotider. Hvis en længere DNA-sekvens skal bruges, kan kortere sekvenser i stedet klones sammen efterfølgende.

    Figur 1. Brønde i en ELISA-plade set tæt på efter en farvedannende reaktion er foregået.

    ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

    ELISA er en måle-metode, der kan afsløre koncentrationen af et bestemt protein i en prøve.

    ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) er en teknik til måling af koncentration af bestemte proteiner (antigener eller antistoffer) ved at udnytte særlige antistoffers evne til at binde til dem.

    En ELISA kan foretages med antistoffer i to trin i den såkaldte sandwich-metode, hvor man i princippet skaber en molekylærbiologisk “klap-sammen” med antistof og protein.

    I bunden af en ELISA-brønd (figur 1) fæstnes antistoffer, der er specifikke overfor (binder til) netop det bestemte protein, man undersøger (figur 2). Derpå tilsættes protein-opløsningen, der skal undersøges, og hvis det bestemte protein er til stede, binder det sig fast til antistoffet i bunden. Derefter skylles brønden, så de ubundne proteiner vaskes af.

    Nu tilsættes et andet antistof, som vil kunne binde til det bundne protein, men som også har påkoblet et enzym. Ubundet antistof vaskes af, og der tilsættes et stof, som det påkoblede enzym, omdanner til et farvestof. Tilstedeværelsen af proteinet kan således ses med det blotte øje eller måles præcist med et spektrofotometer, fordi opløsningen er blevet farvet.

    Mængden af dannet farve bliver samtidig et mål for koncentrationen af proteinet, da mere protein binder og aktiverer mere farvedannende enzym. Så ved at måle opløsningens absorption ved den bestemte bølgelængde, som farven har, kan man præcist fastslå koncentrationen.

    Antistoffer kendes fra immunologien som molekyler med evne til at binde til bestemte strukturer (epitoper) på et protein (antigen). I dag er det muligt at få lavet antistoffer, der er specifikke over for helt bestemte antigener, så man kan fastslå om netop ens yndlingsprotein er til stede.

     

    Eksempel på brug af teknikken

    ELISA kan anvendes til at sandsynliggøre smitte med HIV, der er et virus, som fører til AIDS. I blodet på en HIV-patient vil der noget tid efter smitten være dannet antistoffer overfor virusset. Over for disse antistoffer findes specifikke antistoffer koblet til et farvedannende enzym, og disse kan bruges i en ELISA til at afsløre HIV i en patient. Det kræver også positivt (bekræftende) testresultat fra et Western blot, før en patient kan diagnosticeres med HIV.

    Figur 2. ELISA til bestemmelse af tilstedeværelsen af et protein/antigen (orange).

    Fermentering med cellefabrikker

    Fermentering er den produktionsproces, der forløber, når der dyrkes mikroorganismer som fx cellefabrikker. Processen kaldes også gæring (selv hvis cellen ikke er gær). Fermenteringer i industriel storskala eller mindre laboratorieskala foregår efter samme princip, nemlig at forsøge at skabe ideelle betingelser for cellerne. Her kan man studere cellernes opførsel, heriblandt vækst og udskillelse/optag af stoffer. Dette kan bruges til at forsøge at få dannet mest muligt produkt!

    Figur 1.Små fermentorer med en computer (th.), der styrer temperatur, tilsætningen af næring osv. Her kan en cellefabriks vækst studeres. Fermentorer fra Institut for Systembiologi, DTU.

    Fermentorer

    Fermenteringerne foregår i lukkede tanke, der kaldes fermentorer. Til dem kan der tilsættes sterilt medium og luft, samt udtages prøver m.m.. En kraftig omrører sikrer tilførsel af O2 i hele blandingen. Målere følger intensivt udviklingen i pH, temperatur og CO2-gas, et biprodukt bl.a. ved organismens respiration. Afhængigt af målingerne justeres automatisk op eller ned for fx kølelegemerne, så de optimale betingelser fastholdes. Selv små forbedringer har ofte betydning for udbyttet. Den næring, der bruges, afhænger af cellefabrikken, men kan fx være glucose og diverse næringssalte. Hvis der skal laves mange testfermenteringer, kan rystekolber også bruges, men her har man ikke samme kontrol med processen og kan ikke så nemt udtage sterile prøver undervejs.

     

    Cellernes vækst i fermentorer

    Mikroorganismernes vækst afhænger af fermenteringsmetoden. Fermenteringen indledes, når det sterile næringsmedium i tanken inokuleres med produktionsorganismen.
    Nu gennemlever kulturen (mikroorganismerne) forskellige vækstfaser, heriblandt den eksponentielle, hvor celletallet fordobles for hver gang en bestemt tid er gået – denne såkaldte fordoblingstid er helt ned mod kun tyve minutter for Escherichia coli-bakterier ved optimale forhold (faserne er beskrevet i Biotech Academy materiale om øl).
    Gærceller, der gror i et glucose-medium, vil nedbryde glucosen for at skaffe energi i form af ATP og som biprodukt bl.a. ethanol og CO2. Væksten vil ophøre, når der ikke er mere tilgængelig næring, hvilket bl.a. afsløres som et øjeblikkeligt fald i CO2-produktionen, som kan følges live af måleinstrumenter.

     

    Fermenteringsstrategier

    Når cellerne har spist næringen i mediet, kan man fortsætte efter tre overordnede, forskellige strategier: batch, fed-batch og kontinuert produktion:

    • Batch produktion er den simpleste, og her afbrydes hele fermenteringen, når al næring er opbrugt. Herefter høster man produktet.
    • Da produktionen typisk er hurtigst netop inden næringen er opbrugt, fortsætter man i fed-batch produktion i stedet fermenteringen ved løbende at tilsætte en koncentreret næringsblanding i en efterfølgende periode. Tilsætningen afstemmes, så næringskoncentrationen konstant ligger på et optimalt niveau. For høje koncentrationer kan nemlig starte ineffektive nedbrydningsveje i organismen, og for lave kan selvsagt mindske hastigheden. På et tidspunkt er fermentorens volumen fyldt op, og celletætheden maksimal. Her afbrydes fermenteringen, og produktet høstes.
    • Anderledes er den kontinuerte produktion. Karakteriseret ved at køre uafbrudt, forløber den med en løbende næringstilsætning som i fed-batch fermenteringen, men samtidig tappes fra fermenteringsblandingen med samme hastighed, og dermed høstes produktet løbende undervejs. På den måde kan de optimale næringskoncentrationer fastholdes længe, og uden at der ophobes stoffer, der inhiberer produktionen. Kontinuert fermentering kræver nøje kendskab til den specifikke produktionsorganisme og er ikke så udbredt, skønt metoden er meget effektiv.

     

    Gateway kloning

    Gateway er et kommercielt kloningssystem til sammensætning af DNA-sekvenser og kan fx bruges, hvis der skal kobles grønt fluorescrende protein (GFP) til et gen.

    Niveau: Meget højt!

    Forudsætter: PCR og gelelektroforese

    Der eksisterer i dag en række moderne kloningsværktøjer, der kan bruges til at sammensætte DNA-sekvenser i stedet for den klassiske ’klippe/klistre’-metode med restriktionsenzymer og DNA ligase.

    Gateway er et sådant kloningsværktøj og er baseret på rekombination. Rekombinationen gør det muligt at indsætte en DNA-sekvens i et specifikt rekombinationssted i en anden DNA-sekvens. Disse steder har nogle helt særlige Gateway DNA-sekvenser. Gateway-sekvenserne placeres også for enderne af det DNA, der skal flyttes i kloningen (se figur 1). Det er nyttigt fordi man på den måde kan flytte et gen til et særligt Gateway-plasmid, der fx allerede indeholder et andet gen, som man vil sætte sammen med. Eksempelvis kunne det være green fluorescent protein (GFP), som fluorescerer grønt, og koblet til et protein dermed afslører hvor i cellen det befinder sig.

    Gateway rekombination stammer fra en bakterie-virus (bakteriofag) der hedder lambda. Den angriber E. coli og rekombinerer sit eget DNA ind i bakteriens DNA netop der hvor Gateway-sekvenserne naturligt er placeret i E.colis eget DNA. Rekombinationen katalyseres af særlige enzymer, som også indgår i Gateway systemet og nu kaldes clonase.

    Gateway kloningsenzymerne

    Der eksisterer to forskellige Gateway clonaser: BP clonase og LR clonase, som katalyserer hver deres retning af rekombination-reaktionen. Hvis et DNA-fragment indsættes med BP clonase, ændres Gateway-sekvensen således, at DNA-fragmentet vil blive trukket ud igen ved senere brug af LR clonasen.

    Der findes fire forskellige overordnede Gateway-sekvenser, der kan bruges for enderne af de DNA-fragmenter, der skal udskiftes og der hvor de skal skiftes hen.

    Sekvenserne kaldes attB, attP, attL og attR. Navnene hænger sammen med clonaserne, således at fragmenter med attB-ender rekombinerer og udskiftes med et fragment, der har attP-ender, når BP clonasen bruges. Under rekombinationen ændrer attB og attP sig til hhv. attL og attR. LR clonasen kan så styre den modsatrettede rekombination. Der er dog sjældent nogen grund til blot at vende direkte tilbage til udgangspunktet, så derfor skal det nye plasmid isoleres fra resten af blandingen og forstærkes i antal.

    Figur 1. En BP-kloning hvor et GEN-fragment med attB-haler udskiftes med ccdB-fragmentet i pENTR-plasmidet. Reaktionsblandingen transformeres ind i E. coli i kanamycin-medium for at blive opformeret i antal, så de skal have kanr-genet fra pENTR for at overleve. De vil dog dø af ccdB-genet, hvis de modtog en pENTR, som ikke reagerede i BP-kloningen.

    En styrke ved Gateway er ’selvmordsgenet’ ccdB, der sidder i det fragment, som man bytter ud i Gateway-plasmiderne ved rekombinationen.

    Når selve Gateway-kloningsreaktionen er overstået, transformerer man nemlig E. coli med reaktionsblandingen. Her dræbes de E. coli der får de uinteressante Gateway-fragmenter (med ccdB), mens E. coli som modtager et rigtigt klonet plasmid nu er fri for selvmordsgenet og dermed kan forstærkes i antal, når E. coli-bakterierne vokser. Gateway-plasmidet indeholder også et resistensgen til antibiotika, så man kan dræbe de E. coli, der hverken blev transformeret med rigtigt eller forkert Gateway-plasmid.

     

    Gateway i praksis

    Gateway-sekvenserne er ned til ca. 20 nukleotider lange og tilføjes til enderne af et DNA-fragment med PCR. I PCR forstærkes det specifikke fragment som er placeret mellem de to brugte primer-sekvenser. Gateway-enderne påsættes ved at designe primerne, så Gateway-enderne sidder som en hale til primerne. Under PCR-reaktionen vil de dermed blive sat for enderne af det forstærkede DNA-fragment (se figur 1). Gel-elektroforese benyttes efterfølgende til adskillelse og oprensning af de nye fragmenter med Gateway-haler, som nu er klar til at indgå i en Gateway-kloning.

    Brugen af E. coli til at opkopiere antallet af rigtigt klonede plasmider, betyder at man efter en nats dyrkning af bakterierne, slår bakterierne ihjel og udtrækker de nu mange plasmider med et særligt oprensnings-kit.

    Hvis man i en Gateway-kloning fx har indsat et gen ved siden af GFP på et plasmid, for at klone de to gener sammen, skal man til sidst trække selve det nye gen ud fra plasmidet. Det foregår med en nye PCR, hvor primerne er valgt til at forstærke netop fra starten af det oprindelige gen og til GFP slutter (figur). Gateway kan også klone DNA til brug i sletning af hele gener eller introduktion af enkelte punktmutationer udover at påsatte fx GFP, som forklaret her. På grund af Gateway-sekvenserne vil de to klonede proteiner få 7-8 aminosyrer sat i mellem sig. Gateway er et kommercielt kloningssystem, som ejes og udvikles af Invitrogen. Systemet har væsentligt flere muligheder end eksemplificeret her.

    Alternative kloningssystemer er fx USER og fusion.

    Gelelektroforese: Adskillelse af DNA eller protein

    Gelelektroforese er en adskillelsesteknik, der kan bruges til at separere forskelligt DNA eller protein i en gel (se gel i figur 2). Det gør det bl.a. muligt forholdsvis præcist at måle enten antallet af basepar i en DNA-prøve eller længden af forskellige proteiner (se figur 1).

    Adskillelse af forskellig DNA og proteiner er også nyttigt til oprensning fra en prøve. Fx kan man mindske risikoen for at bruge fejldannet DNA ved gensplejsning med DNA, man selv har fremstillet, hvor der samtidig er blevet dannet andre længder DNA end det korrekte; man adskiller simpelthen de forskellige længder og skærer den rigtige længde ud af gelen. Gelelektroforese bruges derfor ofte på flere forskellige stadier i udviklingen af en ny genmodificeret organisme.

    Figur 1Resultat af gelelektroforese med DNA. Hver lodrette bane er en DNA-prøve, der er løbet fra toppen mod bunden. DNA’et er adskilt i de forskellige længder i lysende bånd, så de korteste er løbet længst ned gennem gelen. (Foto: MnolfGFDL).

    Adskillelse af DNA

    I gelelektroforese af DNA udnyttes den negative ladning, som DNA har, til at adskille DNA af forskellig længde i en prøve. Den negative ladning stammer fra phosphatgrupperne i hvert nukleotid af DNA’et. De geler, der bruges, er faste og gennemsigtige. De støbes ud fra en opløsning af nogle særlige molekyler fx agarose.

    DNA-prøven tilsættes i en brønd (fordybning) for enden af en gel, og der tilsluttes derefter elektrisk spændingsforskel. Herved skabes en frastødende negativ pol ved DNA-prøven og en tiltrækkende, positiv pol i den anden side af gelen (figur 2). DNA’et vil altså nu trække gennem gelen mod den positive side. De mikroskopiske huller i gelen gør bevægelsen sværere for DNA’et, jo længere det er. Derfor løber de korte DNA-molekyler hurtigere igennem end de længere.

    Efter en gelelektroforese vil DNA’et derfor ligge sorteret i forskellige bånd efter antal basepar (alle, der er 600 basepar, ligger fx lige oven i hinanden).

    Flere forskellige stoffer kan gøre DNA’et synligt for fotografering. Ofte brugt er ethidiumbromid, som binder sig til DNA’et, der herved bliver synligt i ultraviolet lys, som bruges ved fotograferingen af den færdige gel. Man kan køre flere prøver ved siden af hinanden i en gelelektroforese, hvor den yderste typisk vil være en markør, der indeholder nogle allerede kendte længder, så man kan sammenligne med prøverne.

    Figur 2. Princippet i DNA gelelektroforese, hvor de forskellige størrelser DNA adskilles i en gel. Gelen ligger i et kar med en buffer-væske.

    Adskillelse af protein: SDS-PAGE og pI

    Gelelektroforese af protein bruges til at adskille forskelligt protein, fx efter proteinernes længde.

    Modsat DNA har proteiner ofte meget indviklede tredimensionelle strukturer, der derfor vil være afgørende for, hvor hurtigt de forskellige proteiner bevæger sig igennem gelens mikroskopiske huller.  For at kunne bestemme længden, skal det imidlertid kun være proteinernes længde, der afgør hastigheden, og man foretager derfor en denaturering af proteinet med SDS (natriumdodecylsulfat). I denaturingen udfolder SDS-molekylerne proteinet og binder sig jævnt langs det. Da SDS er et negativt ladet molekyle, får hver proteinkæde en negativ ladning svarende til dens længde. Den nye, negative ladning overdøver i styrke klart en evt. positiv ladning, som proteinet havde inden. Dermed resulterer SDS-behandlingen i et udfoldet protein, hvis længde kan måles.

    Man bruger en polyakrylamid-gel (PAGE) til gelelektroforese af protein, men princippet er det samme som ved DNA-gelelektroforese: En negativ og positiv elektrisk pol driver proteinprøven gennem gelen, og hastigheden gennem de mikroskopiske huller afhænger af proteinets længde. Derfor opnår man en længdeafhængig adskillelse, som giver sig til syne, når proteinerne til slut farves. Størrelsen af proteiner opgøres gerne i kDa (kilodalton), som svarer til massen i kilogram af et mol af proteinet.

    Adskillelse ved isoelektrisk punkt pI

    Proteiner har andre forskellige egenskaber, som kan bruges til at sortere og adskille dem i en gelelektroforese. Én er deres isoelektriske punkt (pI), som er den pH-værdi, hvor proteinets aminosyrer samlet set vil være neutrale i ladning. Hvis pH i opløsningen kommer under dette punkt, bliver der flere positive ladninger end negative på proteinet, og proteinet vil fremstå positivt. Modsat bliver proteinet samlet set negativt, hvis opløsningens pH kommer over pI.

    Man kan adskille forskellige proteiner efter deres pI-værdi i en gel, hvor pH-værdien på langs gradvist stiger fra lav til høj. I den lave pH-ende sætter man en positiv elektrisk pol, og i den høje pH-ende en negativ pol. For når et protein befinder sig ved pH-værdier over dets pI, er det som nævnt negativt i samlet ladning, og det vil derfor automatisk drive mod dets pI-værdi (der jo er i retning mod den positive pol og lavere pH-værdier). Denne drivning vil fortsætte, lige indtil proteinet når den pH, der er lig dets pI-værdi. Ved denne pH er dets samlede ladning nul, og proteinet ligger derfor stille, upåvirket af elektrisk tiltrækning! Dermed vil proteinerne altså langsomt placere sig på den position i gelen, hvor pH er lig dets pI.

    Figur 3. Princippet i en 2D gelektroforese af protein, hvor proteinerne først adskilles i 1. dimension efter deres isolelektriske punkt og dernæst i 2. dimension efter deres størrelse med SDS.

    I en 2D gelelektroforese kan man adskille en proteinprøve efter både pI og længde. På den ene led af gelen adskiller man først efter pI-værdi, og når proteinerne er sorteret efter det, vender man gelen og tilsætter SDS, så de nu på den anden led kan blive adskilt efter længde (figur 3 og 4).

    Resultatet er således en gel med prøvens forskellige proteiner principielt spredt ud over hele gelen. Hvis to forskellige proteiner i prøven fx havde samme pI-værdi og derfor ikke blev adskilt efter denne egenskab, er det sandsynligt, at de har forskellig længde og derfor vil blive adskilt på den anden led.

     

    Eksempler på brug af gelelektroforese:

    Gelelektroforese er meget ofte brugt i arbejde, hvor DNA eller protein håndteres eller synliggøres. Den anvendes fx ved:

    •  (DNA)Southern blotting
    • (protein)Western blotting
    • Restriktionsskæring
    • PCR

    Figur 4. 2D gelelektroforese af proteiner fra humant blodplasma. Proteinerne er på horisontalt led adskilt efter isoelektrisk punkt (pH) og på vertikalt led adskilt efter størrelse (kDa). Gel fra Institut for Systembiologi, DTU.

    PCR (Polymerase Chain Reaction)

    PCR til at opkopiere bestemte DNA-sekvenser i en prøve er nu en af genteknologiens absolut vigtigste værktøjer.

    Niveau: Mellem-højt

    PCR (Polymerase Chain Reaction) er en af de mest udbredte molekylærbiologiske teknikker i dag og er helt uundværlig i mange situationer. PCR udnytter et af naturens egne enzymer, DNA-polymerase, til at opkopiere en bestemt DNA-sekvens i en række gentagne cyklusser. Med PCR er det altså nemt og hurtigt at skabe millioner af kopier af så lidt som én DNA-streng, fx fundet på en mulig forbryder til brug i retsmedicin.

    Ideen med PCR er som nævnt at foretage et antal gentagne cyklusser, hvor en udvalgt DNA-sekvens kopieres i hver cyklus og derved principielt fordobles i antal for hver gang (en kædereaktion). Ligesom i naturen kan DNA-polymerase kun kopiere DNA, hvis der til rådighed er såkaldte korte primer-sekvenser af komplementær DNA. Primerne binder til DNA’et der, hvor kopieringen skal begynde.

     

    Valg af primere – kopiernes start og stop

    DNA har som bekendt to strenge, der løber i hver sin retning (3′ til 5′ og 5′ til 3′). Derfor vil DNA-polymerase i PCR også kopiere de to strenge i hver sin modsatte retning. Dette indebærer, at der skal bruges to forskellige primere – én til start af kopiering i hver retning. DNA-polymerase bygger nemlig udelukkende en ny streng op i retningen fra 5′ til 3′. Den streng, enzymet bruger som skabelon, skal altså gå modsat, dvs. fra 3′ til 5′ (se figur 1). Det betyder, at de to nødvendige primeres sekvenser skal vælges, så den ene baseparer til startstedet på den ene streng, og så den anden baseparrer til den anden strengs startsted. Da strengene er modsatrettede, ligger det ene startsted automatisk samme sted som stopstedet på den modsatte streng (se figur 1).

    Figur 1. Opkopieringen af en specifik DNA-sekvens med PCR ved tilsætning af primere (gul og rød), der binder til startstedet for kopieringen på hver af de to DNA-strenge. Binding af primere afgør altså hvilken DNA-sekvens, der skal opkopieres fra det tilgængelige skabelon-DNA.

    Hvorfor startstedet på én streng samtidig er slutstedet på den anden streng, kan være lidt svært at forstå. Men det skyldes, at de DNA-strenge, som dannes i den første cyklus, også vil fungere som skabelon i den næste fordoblingscyklus, men nu for den modsatte streng og retning. Derfor er strengen ikke længere, når DNA-polymerasen kommer frem til det oprindelige startsted – som derfor bliver et stopsted (se figur 1).

    Faserne i en PCR-cyklus

    Hver cyklus er delt op i tre forskellige faser, der har hver deres temperatur og varighed (se figur 1).

    1. Opvarmning (denaturering af DNA)

    Det dobbeltstrengede DNA, der skal bruges som skabelon i reaktionen, skal først denatureres ved høj temperatur (ca. 95 oC) nogle sekunder. Dette gør DNA’et enkeltstrenget, så hver streng kan få bygget en ny komplementær streng senere i PCR-cyklussen.

    2. Nedkøling (binding af primere til DNA)

    Temperaturen sænkes til omkring 60 oC, hvor de tilsatte primere vil kunne binde til startstederne på det enkeltstrengede DNA.

    3. Elongering (dannelse af de nye, komplementære DNA-strenge)

    Temperaturen hæves til 72 oC, hvor DNA-polymerase binder til primerne ved startstederne og bygger videre på de nye, komplementære DNA-strenge. DNA-polymerasen fortsætter, så længe temperaturen ikke hæves, og så længe der stadig er skabelon-DNA til rådighed. Varigheden af trinnet beregnes derfor, så cyklussen først genstarter, når hele den interessante DNA-sekvens er forlænget (elongeret).

    En PCR med 30 cyklusser varer gerne 2-3 timer.

     

    Nytten i at opkopiere DNA: Forskellige roller for PCR

    Teknikken med at kunne opkopiere et bestemt område fra ganske lidt skabelon-DNA er meget anvendelig i genteknologien.

    Her er to ud af mange anvendelser:

     

    Danne DNA til gensplejsninger

    PCR kan bruges i arbejdet med at danne det DNA, der skal indsættes i en organisme, som gensplejses. Ved hjælp af særlige primere kan det desuden lade sig gøre at sætte to stykker DNA sammen fx et protein og grønt fluorescerende protein (GFP). På den måde bliver proteinet selvlysende, og man kan se det inde i cellen. Denne metode til sammensætning af DNA kaldes fusions-PCR og forklares ikke nærmere her.

     

    Diagnostisk PCR

    PCR kan bruges til at vurdere, om bestemte mikroorganismer (fx sygdomsfremkaldende bakterier) er til stede. Til DNA’et i prøven tilsættes særlige primere, som ville kunne binde til et område af bakteriens DNA og opkopiere det i PCR. Hvis resultatet viser en opkopiering af DNA af netop den forventede længde, tyder det på, at bakterien var til stede. På samme måde kan det undersøges med PCR, om en gensplejset organisme rent faktisk indeholder det indsatte DNA.

    Teknikken bag PCR

    PCR’en foregår typisk i en lille blanding på kun 30-70 mikroliter, for her kan stadig være millioner af DNA-kopier.

    Det nødvendige temperaturprogram styres fra en lille computer i PCR-maskinen, der konstant regulerer de forskellige temperaturer, som styrer hvilken af de tre faser, der foregår. Den DNA-polymerase, man anvender i PCR, er meget varmestabil, hvilket betyder, at den ikke ødelægges (denaturerer) af de høje temperaturer, som bruges. En PCR-primer har typisk 20 basepar, og de syntetiseres kemisk af firmaer til bestilling på nettet. En sådan primer koster p.t. ca. 20-30 kr.

    Læs også om brug af PCR i:

    Biotech Academys projekt Fra Darwin til bioteknologi

    Figur 2PCR-rør er kun ca. 2 cm høje, men store nok til at rumme de millioner af kopier af DNA, som bliver dannet under PCR.

    DNA restriktionskæring og ligering

    En af de vigtigste opdagelser indenfor genteknologien var den række af enzymer, der klipper DNA over helt bestemte steder.
    Restriktionsenzymer (eller restriktions-endonukleaser) findes i hundredvis af varianter, der hver skærer DNA-strenge over ved en bestemt sekvens som typisk er 4-8 nukleotider lang, fx AGATCT.

    Figur 1Restriktionsskæring med enzymet EcoRI giver sticky ends.

    Restriktionsenzymerne var et guldfund for forskerne pga. muligheden for at skære DNA over ved en præcis sekvens. Denne præcise skæring af DNA kan bruges sammen med sammenklæbningsenzymet DNA-ligase til populært sagt at klippe og klistre DNA og dermed gener sammen. Kendskabet til disse enzymer betød gensplejsningens fødsel og gjorde det bl.a. muligt at producere de første rekombinante proteiner.

    Restriktionsenzymerne virker ved at skære det dobbeltstrengede DNA over, typisk skråt, så der skabes enkeltstrengede ender (sticky ends) (se figur 1). Sticky ends har som navnet antyder en slags klistrende evne, da de komplementære, enkeltstrengede ender gerne vil finde tilbage til hinanden og genetablere deres indbyrdes tiltrækkende hydrogenbindinger ved almindelig baseparring. Denne tiltrækning eksisterer naturligvis ikke for de lige skårne blunt ends, så det kan være svært at vide, hvordan de sad sammen før skæring.

    Den sekvens, som restriktionsenzymerne genkender, er ofte palindromisk. Det vil sige, at sekvensen ved skæringsstedet er ens på begge strenge blot set fra hver sin retning (se eksempel på palindromisk skæring i figur 1).

     

    Eksempler på brug af restriktionsskæring

    Metoden med at ‘klippe/klistre’ med restriktionsenzymer og DNA-ligase kan fx bruges til at sætte en proteinkodende DNA-sekvens (et gen) ind i en ekspressionsvektor, når man skal lave en celle, der producerer et nyt protein. Det kræver simpelthen, at der sidder de samme skæringssekvenser der, hvor den proteinkodende DNA-sekvens og ekspressionsvektoren skal klippes op og sættes sammen.

    Restriktionsenzymer anvendes også i mange andre genteknologiske værktøjer. Fx når en hel organismes DNA (genom) skal analyseres med et Southern blot.

    Selektion og screening

    Efter en gensplejsning vil kun et fåtal af cellerne faktisk være korrekt gensplejset, men dem har man værktøjer til at udvælge blandt alle de andre.

    Selektion

    Selektion er en udvælgelse af bestemte genetisk forandrede celler (mutanter), fx efter en gensplejsning. I gensplejsning vil typisk kun en lille andel af cellerne faktisk blive gensplejset som ønsket. For at undgå at skulle teste en masse forkerte celler, kan man bruge selektion.

    Figur 1. Selektion med antibiotikum for at udvælge de gensplejsede celler. Kun de gensplejsede celler bærer selektionsgenet, som giver dem resistens overfor antibiotikumet. På vækstpladen med antibiotikum vil kun disse celler gro frem. Uden antibiotikum på pladen ville celler, der ikke blev gensplejset, også kunne gro frem.

    Ved selektion skaber man et miljø for cellerne, hvor kun celler med et bestemt selektionsgen kan vokse, fx et resistensgen til antibiotika. Dette selektions-gen sætter man ind sammen med det nye gen under gensplejsningen. Selektions-genet bliver på den måde en markør for, at gensplejsningen er lykkedes. Dette skyldes, at kun de rigtigt gensplejsede celler vil kunne overleve sammen med det valgte antibiotikum. Princippet er en positiv selektion, da de interessante celler, der selekteres for, netop overlever.

    Selektionsformer

    Antibiotikaresistens er en populær selektionsform. Den kan bruges fx i bakterier, der er følsomme over for et antibiotikum. Man skal kende et selektionsgen for resistens, der fjerner denne følsomhed. Ampicillin og kanamycin er eksempler på forskellige antibiotika, man genetisk kan give resistens overfor. Kanamycin virker dræbende for bakterier ved en mekanisme, der er udbredt for antibiotika. Stoffet binder sig til et område af ribosomerne, så de forstyrres kraftigt i proteinsyntesen, og bakterien dør.

    Selektion
      Selektionsmedium
      Eksempel på gen
    Antibiotikaresistens
      + antibiotikum
      ampr. ampcillin-resistens
    Auxotrofi
      – livsnødvendig aminosyre
      HIS3. Histidin-syntese

     

    Tabel 1. Eksempler på selektionsformer.

    Resistensgenet over for kanamycin virker ved at kode for et enzym i cellerne, der inaktiverer kanamycinen.
    Det kan anses som kritisabelt at indsætte resistens-gener i organismer, der sættes ud i naturen, som fx GM-afgrøder. Generne kan i teorien spredes til andre, vilde planter, og man kan derved fx frygte, at antibiotikaresistensen spreder sig til farligere organismer.

    Auxotrofi er et andet princip, som også bruges til selektion. En organisme, der ikke kan klare sig uden at få tilført et bestemt næringsstof, siges at være auxotrof overfor det. Når man gensplejser, kan man selektere de rigtige celler ved at give et selektionsgen med, der får disse celler til selv at danne næringsstoffet, så de kan overleve uden. Når man ikke tilsætter næringsstoffet, vil kun de rigtige celler overleve – de er altså selekteret.
    Næringsstoffet kan fx være et bestemt nukleotid eller aminosyre, som fx aminosyren histidin. Organismen skal starte som histidin-auxotrof, så hvis den ikke er det, må man slette et af de histidin-ansvarlige gener, som fx HIS3-genet i bagegær (S. cerevisiae). Den histidin-auxotrofe organisme kan dermed bruges til selektionen med et HIS3-selektionsgen.

    Screening

    Screening er en metode til at kunne genkende bestemte genetiske mutanter, fx efter en gensplejsning, hvor man vil kunne udvælge en celle, der er korrekt gensplejset. I modsætning til selektion, hvor kun de rigtigt gensplejsede mutanter vil gro frem, kan screening foregå ved at de transformerede celler fx får en anderledes farve eller udskiller et farvet stof blandt de andre celler. Disse kolonier af celler udvælger man så selv fra vækstpladen.

    Et udbredt screeningsgen er lacZ der stammer fra E. coli og koder for enzymet β-galactosidase. Cellekolonier, man får til at udtrykke lacZ-genet, vil få en blålig farve, når de vokser på et næringsmedium tilsat stoffet X-gal (5-brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid), og de giver sig derfor tydeligt til kende (figur 2).

    Figur 2Bakteriekolonier i screening med screeningsgenet lacZ fremstår blå på medium med X-gal. Foto: Navaho (GFD licens v. 1.2)

    Screening for spændende stoffer

    Screening bruges også til at finde mikroorganismer, der producerer interessante stoffer, som fx antibiotika eller enzymer. Her kan tusindvis af fundne kandidater vurderes for at se, om nogle af dem producerer nogle interessante stoffer.

    Southern blotting

    Southern blotting bruges til at søge efter tilstedeværelsen af en specifik DNA-sekvens i en DNA-prøve.
    Forudsætter: Gelelektroforese (af DNA) og evt. restriktionsskæring.

    Southern blotting er en teknik til at bestemme om en specifik DNA-sekvens er til stede i en prøve. Metoden er derfor bl.a. egnet til at kontrollere, at man har skabt den rigtige DNA-sekvens, eller at en gensplejset organisme rent faktisk også er gensplejset.

    Princippet i Southern blotting består i at lave en kunstig, enkeltstrenget DNA-streng (probe) med den nøjagtige sekvens, man ønsker at søge for. Proben vil nu kunne binde til DNA-prøven ved komplementær baseparring, hvis prøven netop indeholder den søgte sekvens. DNA-proben mærkes radioaktivt, så dens binding til prøven vil kunne kendes.

     

    Sådan bruges Southern blotting

    DNA-prøven skæres først i tilfældige, mindre stykker ved brug af et restriktionsenzym. Herved er det muligt at få spredt den ud efter længde ved hjælp af gelelektroforese (figur 1). Prøven denatureres nu med varme, så hydrogenbindingerne mellem de to DNA-strenge brydes, og de deles i enkeltstrenget DNA. De længdeadskilte DNA-stykker, der måske et sted indeholder den prøve, der søges for, overføres nu til en membranplade, der fastholder de forskellige DNA-længder i deres position.

    Figur 1. Southern blotting. DNA’et skæres først i mindre stykker med et restriktionsenzym, og de forskellige længder adskilles med gelelektroforese. DNA’et overføres til en membranplade. Hvis en radioaktiv probe (grøn) kan binde, afslører det, at den søgte sekvens var til stede. 

    Når proben nu tilsættes, vil den kunne binde ved baseparring til eventuelt identiske sekvenser i DNA-prøven, da de begge er enkeltstrengede, og DNA som bekendt gerne vil være dobbeltstrenget. På den måde får man en binding af proben, hvis den søgte DNA-sekvens er til stede i prøven. Det kan til sidst afsløres ved at vaske ubundet probe af og tage et røntgenfoto af prøven, fordi proben vil blive siddende på membranen de steder, den har bundet til en identisk sekvens. At sekvensen var til stede i DNA-prøven, er hermed vist.Længden af prober, der søges med, er gerne mellem 100 og 1.000 nukleotider, og den radioaktive mærkning kan foregå ved at have en phosphor-32 isotop i stedet for normalt phosphor i nukleotidernes phosphat-grupper.

     

    Eksempel på brug af teknikken:

    Southern blotting blev anvendt af forskere i udviklingen af en medicinproducerende, transgen ged (læs case).

    Transformation

    Transformation er indsættelsen af fremmed DNA i en celle, som det fx sker i gensplejsning.

    De fleste celler vil normalt ikke optage DNA fra omgivelserne, og flere metoder til transformation består derfor i at gøre deres membran permeabel (gennemtrængelig) for DNA. Det er meget forskelligt, hvilke metoder der virker på de enkelte organismer.

    Figur 1. Ved transformation optager en celle fremmed DNA. Der findes forskellige metoder til denne optagelse.

    • Elektroporation er en nem og hurtig metode, hvor en blanding af DNA og celler udsættes for et kortvarigt elektrisk felt i en elektroporator. Herved bliver cellemembranen permeabel, og nogle af cellerne vil derved optage DNA’et og blive transformerede. Cellerne vil efterfølgende være skrøbelige og skal derfor håndteres skånsomt, indtil de er “kommet sig”.
    • Kemisk kompetence er en anden transformationsmetode, hvor cellerne behandles kemisk med fx calcium-ioner (Ca2+), så de kan optage fremmed DNA (bliver kompetente).

    Planter er væsentligt mere avancerede organismer end de encellede gær- og bakterieceller. Planter kan transformeres med den særlige bakterie Agrobacterium tumefaciens. Bakterien transformeres først selv med det ønskede gen i en særlig vektor. Bakterien kan bagefter selv indsætte genet i planten, da den naturligt lever ved netop at gensplejse de planter, den skal gro på.

    Plante-transformation er ikke yderligere beskrevet i dette materiale, men forklares i mange undervisningsbøger og på adskillige websider.

     

    Western blotting

    Western blotting kan bruges til at måle, om et bestemt protein er til stede.

    Forudsætter: Gelelektroforese (af protein)

    Western blotting bruges til at bestemme, om specifikke proteiner er til stede i en prøve. Metoden udnytter binding med bestemte antistoffer, der er lavet, så de netop genkender specifikke områder i proteinet og derfor binder sig. Efterfølgende tilsætning af nye antistoffer med et påkoblet signal kan afsløre binding af de første antistoffer og dermed det søgte protein.

    Western blotting minder omELISA pga. begge teknikkers måling af proteiner ud fra antistof-binding.

    Sådan foretages Western blotting

    Proteinerne, der skal undersøges, adskilles først i en gelelektroforese efter deres længde (SDS PAGE). Disse udspredte proteiner overføres nu til en membranplade, som kan fastholde proteinerne i deres position (figur 1).

    Specifikke antistoffer påføres nu. Antistoffer har den egenskab, at de binder til det undersøgte protein. Membranen skylles bagefter, så ubundet antistof bliver vasket af. Nye antistoffer, der kan binde til de første antistoffer, påføres herefter. Disse er påkoblet et målbart signalstof, der fx er radioaktivt. Det betyder, at der efter skylning vil sidde radioaktive stoffer tilbage på pladen, der hvor det søgte protein eventuelt er til stede. Det kan dermed afsløres ved radiografi.

    Antistoffer kan skabes, så de er specifikke overfor (binder til) lige præcis en særlig proteinstruktur. Strukturen kan fx findes på proteiner forbundet med sygdomme som fx leverbetændelsen hepatitis C.

    Der bruges to forskellige antistoffer, så det første er et specifikt over for proteinet, der måles på. Det andet, signalkoblede antistof binder mere generelt til de brugte, specifikke antistoffer, og kan derfor bruges som antistof ved måling af forskellige proteiner.

    Figur 1. Western blotting.

    Western blotting minder om Southern blotting, hvor det er en specifik DNA-sekvens, der søges efter, i stedet for protein.

    Navnet hentyder ikke til nogen geografisk ‘vestlig’ retning, men er et lille molekylærbiologisk ordspil, da ideen til teknikken kommer fra Southern blotting, opfundet af Edwin Southern. Der eksisterer i dag også Northern blotting, Southwestern blotting m.fl.

     

    Eksempler på brug af teknikken

    • I designet af en ny cellefabrik kan der være tvivl om det rigtige protein faktisk bliver dannet, hvilket Western blotting vil kunne hjælpe med at afklare.
    • Den sjældne hjernesygdom kogalskab rammer også mennesker i form af Creutzfeldt-Jakobs. Sygdommen skyldes en særlig form for skadelige proteiner (prioner). Som diagnose af sygdommen kan Western blotting bruges.

    Videreudviklingen af genteknologien udnytter kreativitet og den teknologiske udvikling til at opfinde helt nye biologiske funktioner.

    Syntetisk biologi er et voksende højfokus forskningsområde, hvor der skabes nye biologiske funktioner, som ikke findes i naturen. Denne videreudvikling af genteknologien er gjort mulig af de seneste års forbedrede viden om generne og kunstig fremstilling af DNA. Et af målene er nytænkende produktion af medicin, der fx sænker prisen.

    Et andet håb er at kunne samle fremmede gener og deres enzymer for at skabe hele kunstige systemer, som kan fungere i nye biologiske celler. I dag er simple, kunstige systemer fx allerede blevet skabt i bakterie-celler, som får dem til at registrere forskellige farlige stoffer i deres omgivelser. De rapporterer det derefter ved udsendelse af farve eller lugt af banan og pebermynte – indflydelsen fra engagerede og alternativt tænkende studerende er altså mærkbar!

    I syntetisk biologi udnyttes den naturlige fordel, som cellerne har til at arbejde i komplekse systemer og producere biologiske stoffer – men nu endnu mere efter menneskets ønsker. Sagt med andre ord er syntetisk biologi forsøget på at introducere sand ingeniørkunst i biologien inspireret bl.a. af elektronikkens sejrsgang de sidste hundrede år. Den teknologi hjalp til at sammensætte velforståede, elektriske enkeltdele i nye kombinationer og systemer. Det tillod ingeniørerne at designe tv, computere, mobiltelefoner m.m.

    Figur 1. Syntetisk biologi metaforisk illustreret som celler, der fungerer som tandhjul i et system. Af websitet OpenWetWare.org (CC by-sa 2.5).

    På samme måde er det den syntetiske biologis håb at finde eller udvikle enkelte biologiske gen-dele og forstå dem så godt, at gen-delene vil kunne udvælges og samles til at bygge helt nye systemer op i en celle. På den måde skaber generne nye, syntetiske, biologiske funktioner, og cellen kan pludselig sammenlignes med en lille maskine. Udviklingen står derfor i kontrast til tidligere, hvor mikrobiologien mere beskæftigede sig med at opdage de eksisterende, naturlige biologiske systemer.

     

    Syntetisk biologi bygger med gen-dele

    Almindelige “gammeldags” gensplejsninger med restriktionsenzymer har været mulige siden 1970’erne. De har sammen med PCR-genforstærkning og DNA-sekventering udgjort grundlaget for genteknologien, hvor man foretog enkelte, ret simple genetiske ændringer i bakterier og andre celler.
    Syntetisk biologi er en videreudvikling, der udnytter, at forskerne nu kan sammensætte DNA hurtigt og billigt. Samtidig er håbet at forstå de mange gen-dele på en standardiseret måde, så forskellige dele nemt kan sættes sammen med hinanden, med den bonus at den nye funktion så vil kunne forudsiges, allerede inden den genetiske ændring af cellen er skabt.
    De nye gen-dele skal helst være ortogonale. Det betyder, at deres virkning ikke afhænger af de oprindelige omgivelser, og gen-delene kan derfor sættes fleksibelt sammen med helt andre gen-dele og stadig virke. Ideelt med samme frihed som elektronik.

     

    Ved at samle to gen-dele fås en ny funktion

    Eksempelvis kan gen-dele indsættes i en slags tom, simpel celle, der er ændret til ikke at have nogen særlig funktion selv – nærmest som en skal eller et chassis. Her kan gen-delen fx sørge for en særlig opgave, som at gøre cellen selvlysende, producere gift eller måske nedbryde fremmed gift.
    En anden gen-del, der fungerer som en tænd/sluk-knap (promoter), kunne så indsættes foran den første, så den nu bliver reguleret af tænd/sluk-gen-delen. Her kunne man udvælge én, der kun tændes ved særlige signaler – fx hvis giften er til stede!
    Dermed har man i teorien udviklet en celle, der simpelt reagerer på gift ved enten at nedbryde den eller blive selvlysende, alt efter hvilken gen-del, man valgte (se figur 2).

    Figur 2. To gen-dele sættes sammen for at skabe en celle, der bliver selvlysende ved tilstedeværelse af en gift. Den grønne pil symboliserer en promoter, den røde pil et protein.

    iGEM-dysten samler studerende fra hele verden
    Mange af gen-delene bliver sorteret og sat i katalog af den amerikanske BioBricks-fond, som bagefter lægger dem ud til bestilling på deres website.

    Her bliver de især udnyttet af de mange hundrede studerende, der deltager i den syntetiske biologis årlige, internationale iGEM-dyst. I iGEM konkurrerer universiteternes hold om at skabe nye, nyttige biologiske funktioner, og Danmark har været repræsenteret af Syddansk Universitet (SDU) og Danmarks Tekniske Universitet (DTU).

    De over 100 hold bruger eksisterende gen-dele, men skal samtidig også beskrive og indsende nye gen-dele til BioBricks-kataloget. Samtidig er målet med forløbet at foreslå en innovativ organisme med en ny biologisk funktion. Blandt de vindende deltagere i 2010 var et hollandsk hold, der udviklede dele til en bakterie, der ville kunne bekæmpe olieforurening i havene.

    Figur 3. De dystende hold i iGEM 2010 fra hele verden mødtes på universitetet MIT i USA. Foto: iGEM og Justin Knight.

    Den syntetiske biologis idé om at skabe nye biologiske funktioner og organismer kan finde mange anvendelser.

    Inspireret af tankegangen “Hvad jeg ikke kan bygge, kan jeg ikke forstå” forsøger forskere fx at genskabe de biologiske systemer, de undersøger, ved at flytte generne over i en simpel, velkendt organisme som fx gær. De nødvendige gener kan hurtigt syntetiseres kunstigt eller klones sammen. Hvis det lykkedes at genskabe systemet med de forudsagte fremmede gener, har de et stærkt fingerpeg om, at det er disse gener, systemet drives af.

     

    Biologien i garagen

    Internettet og den kraftigt mindskede pris på udstyr til at arbejde med DNA har åbnet for en ny biologisk gren, der kaldes garagebiologi og gør-det-selv biologi. Her eksperimenterer såkaldte amatør- eller garagebiologer, som måske er studerende, derhjemme med små forsøg fx med en brugt PCR-maskine efter inspiration fra internettet eller iGEM. På den måde når biologien bredere ud end tidligere, og måske kan amatørerne ligefrem hjælpe de professionelle forskere.

    I forbindelse med garagebiologien har visse skeptikere dog også luftet bekymring for, at amatører bevidst eller ubevidst kunne komme til at producere miljø- eller sundhedsskadelige bakterier. Forskere har desuden tidligere bevist, at de fx kunne genskabe farlige vira ved at syntetisere viraenes DNA. Biosikkerheden ved nye syntetiske organismer, der har fået indsat et sæt helt fremmede gener er også en udfordring i sig selv. Sikkerheden er indtil videre holdt oppe ved at sikre en fuldstændig indelukning af de nye genmodificerede organismer. Hvis en oliefjernende havbakterie skal få en praktisk anvendelse en dag, kræver det naturligvis at den sikkert kan udsættes i naturen – dvs. uden at udgøre en trussel for de eksisterende naturlige økosystemer (se Etik og lovgivning i genteknologi).

    Den videre fremtid for syntetisk biologi

    Syntetisk biologi er som nævnt et meget nyt begreb, og præcis hvordan, det vil udvikle sig i fremtiden, er noget uklart, måske især fordi mange forskere gerne vil bryste sig af det hippe navn. Det skyldes måske også, at syntetisk biologi ikke bygger på nogen markant teknologisk nyudvikling ud over den kraftigt nedadgående pris på kunstigt syntetiseret DNA sammensat efter forskernes ønsker.

    Nogle forskere strækker den syntetiske biologi endnu længere og arbejder på at skabe decideret kunstigt liv. Det kunne fx være i form af celler bygget af helt andre bestanddele end naturens, men som stadig er i stand til at dele og udbrede sig med en form for arvemateriale. Udvikling af en sådan kunstig form for liv påkalder sig naturligvis også etiske og filosofiske overvejelser om, hvad liv overhovedet er – og har lov til at være. Men foreløbig er der også meget lang vej igen for disse forskere.

    Der er ingen tvivl om, at det er en kæmpemæssig udfordring at forsøge at genskabe livets opståen. På samme måde er den syntetiske biologis forsøg på at omprogrammere de nuværende biologiske celler også besværlige opgaver. Indtil videre forbliver biologiske kredsløb trods alt langt mere uforudsigelige end deres elektriske modparter, men viljen og kreativiteten i syntetisk biologi er stærkt til stede for at opfinde nye biologiske funktioner.

    Grænsen for hvad biologiske celler er i stand til, vil formentlig rykke sig i fremtiden.

    Læs mere

    Videnskab.dk: Kunstig DNA vækkes til live – Craig Venter

    Information: Vi kan lave jetbrændstof med syntetisk biologi – Interview med Jay Keasling

    Registry of Standard Biological Parts – Bioklods-kataloget

    iGEM-dysten

    – holdet fra Syddansk Universitet (SDU)

    – holdet fra Danmarks Tekniske Universitet (DTU)

    OpenWetWare – Amerikansk wiki, hvor forskere og andre biologi-interessere kan dele erfaringer

    Genteknologi er en teknologi med meget store muligheder, der vil kunne gavne miljøet, samfundet eller menneskers sundhed. Men som mange andre teknologier kan genteknologi også misbruges eller utilsigtet skabe fejl. Derfor er brugen af genteknologi omgærdet af vigtige etiske spørgsmål og reguleret af EU-lovgivning. Denne etiske diskussion er knyttet til emner fra det øvrige materiale om genteknologi og cellefabrikker.

    Efterhånden som mulighederne udvides for at flytte rundt på gener og ændre dem, bliver det vigtigt at tage etisk stilling til, hvor grænserne sættes. Genteknologien gør det muligt at arbejde kreativt med vores biologiske arv og potentielt skabe nye transgene organismer, der kan løse problemer med sundhed, sult eller manglende ressourcer. Men i nogle situationer kan genteknologi også medføre en vis risiko for uoprettelig spredning af fremmede gener i naturen. Man må derfor vurdere, om brugen er acceptabel, fx hvis nytteværdien kan betyde, at der reddes liv, eller at prisen på dyrkningen af afgrøderne falder. Desuden er der måske grænser for hvilke dyrearter, vi vil gensplejse i menneskets tjeneste, selv hvis gensplejsningen ikke påfører dem smerter?

    Dette er kun nogle af de etiske spørgsmål, som følger med brugen af genteknologi, og som man må afklare, inden man iværksætter og går i laboratoriet med et nyt genteknologisk projekt.

    I denne diskussion gennemgås etiske holdninger til brugen af genteknologi i forhold til emner i dette materiale. Desuden præsenteres de vigtigste regler for brug af genteknologi, herunder dyrkning af genmodificerede (GM) planter.

    Risiko ved og lovgivning om genteknologi

    Genteknologi kan anvendes på meget forskellige måder. Der er væsentlig sikkerhedsmæssig forskel på en genmodificeret organisme, der holdes indesluttet i laboratorier og fermenteringstanke til produktion af medicin eller enzymer og på organismer, der udsættes i naturen såsom GM-planter, der vil kunne påvirke økosystemerne. Forskellen ses også af lovgivningen.
    Genteknologi reguleres i Danmark af Lov om miljø og genteknologi, som følger EU’s regler på området.

    Brug af GMO’er i forskning og produktion

    Arbejde med genmodificerede organismer (GMO’er) i forskning og produktion skal tillades af myndighederne, så faciliteterne er sikre og der ikke slipper levende GMO ud.
    Hvis en GMO skal indgå i produktion fx som cellefabrik, skal virksomheden dokumentere overfor myndighederne, at mikroorganismen ikke er giftig eller sygdomsfremkaldende for mennesker, og at den ikke har nogen overlevelsesfordel i forhold til de naturlige mikroorganismer og derved kan etablere sig i naturen.
    Et produkt fremstillet i en gensplejset cellefabrik, som fx citronsyre, insulin og penicillin vil ikke selv være GMO, fordi GMO kun har været et hjælpemiddel i produktionen af stoffet og ikke kommer med i produktet. Anderledes er det med GM-planterne, der skal bruges som foder eller fødevarer.

    GM-planter

    Især relevant efter læsning af cases: Insekttolerant bomuld og Gylden ris 2.0

    Ifølge lovgivningen skal GM-planter godkendes i EU, før de kan udsættes og dyrkes i naturen. En ny GM-plante skal derfor risikovurderes af myndighederne, hvor der bl.a. bliver udført ekstra sikrede forsøgsdyrkninger. Planten kan så godkendes, hvis myndighederne vurderer, at den i pagt med forsigtighedsprincippet ikke udgør nogen risiko for miljøet, samt for dyrs og menneskers sundhed.

    Figur 1. Europæisk majsmark. Kun én GM-majs er godkendt til dyrkning i EU, mens GM-majs er mere udbredte globalt set.

    Spredning af de indsatte gener til naturlige planter vurderes af de fleste som uønskeligt, da det bl.a. kan risikere at forstyrre økobalancen, hvis naturlige småplanter fx bliver til såkaldte superplanter resistente overfor sprøjtemiddel. Måske sker der intet, men pointen hos mange kritikere er, at det er for risikabelt, når man ikke ved, hvad der vil ske. Risikoen for spredning til naturlige planter kan mindskes, hvis planterne ikke har nogen naturlige (evolutionære) fordele ved at opnå de fremmede gener, eller hvis de ikke har nogen nære, vilde slægtninge. Derfor gælder loven om sameksistens i Danmark, som pålægger krav om afstand mellem GM-marker og de øvrige marker, samt offentliggørelse på nettet af markernes placering (læs mere her).

    Meget få GM-planter er godkendt til dyrkning i EU. Af dem er det stort set kun den insekttolerante Bt-majs MON810, der reelt dyrkes i dag, og det sker i de sydlige medlemslande; de insekter, der rammes, er ingen trussel i fx Danmark, hvor den eneste dyrkning af GM-planter sker på forsøgsbasis i dag. I en række år har EU holdt pause for godkendelse af nye GM-sorter, men i 2010 godkendte de dyrkning af kartoflen Amflora, der er velegnet til udvinding af stivelse til papirfremstilling.

    Fødevarer, der er fremstillet med genmodificeret indhold (fx soja eller majs), skal mærkes på etiketten, så forbrugerne har et personligt valg. Flere GM-planter må godt importeres til EU, selvom dyrkning her er forbudt. Disse kan man også af og til købe i danske butikker (varer med op til 0,9 % utilsigtet GM-indhold kan undgå mærkning).

    Fodring med godkendte GM-planter såsom sojaskrå er almindeligt i Danmark, og det skal ikke mærkes på fx kødet, æggene eller mælken. Økologisk foder må dog ikke indeholde GMO.

     

    Etiske holdninger til gensplejsning

    Et fremført argument imod gensplejsning af dyr og planter er, at det er et kunstigt, menneskeligt indgreb, som påvirker både deres integritet og naturlighed. Etisk taler man om, at naturen kan miste sit væsen og reduceres til en ren menneskelig ressource eller råstof, mens artsforskellene forstyrres, når transgene organismer skabes. Integriteten skades, når et dyr mister sin naturlige helhed og bringes ud af sin verden, som det måske har tilpasset sig gennem mange tusinde års udvikling og evolution. Visse religiøse mennesker opfatter brugen af gensplejsning som at ‘lege Gud’ og er derfor stærke modstandere.
    Andre ser således på det, at mennesket allerede gennem århundreder har påvirket dyr og planters genetiske udvikling ved traditionel forædling, hvor de mest attraktive afkom udvælges til avl. Denne selektive brug af naturlig kønnet formering har skabt de højtydende afgrøder og dyreracer, som landbruget benytter i dag, og som principielt også har mistet en vis naturlighed. Denne traditionelle forædling har også frembragt diskutable resultater såsom hårløse katte, bulldogs med dårlig vejrtrækning og kyllinger, der gror hurtigere, end benene kan følge med til. Men uanset menneskets indgriben ved traditionel forædling, ligger disse nye arter dog hele tiden inden for naturlig formerings egne genetiske variationer.

    I vurderingen af nye gensplejsede organismer anlægger flere en nytteetisk betragtning og mener derfor, at godkendelse af genmodificerede planter og dyr godt kan accepteres, hvis de tjener en tilstrækkelig nytteværdi. Præcis hvilken nytte, der skal til for at opveje bestemte etiske forbehold, er svært at enes om.
    Der er en forventning blandt flere om, at fremtidige GM-planter vil have nemmere ved at blive accepteret af de kritiske europæiske forbrugere, hvis de tilførte egenskaber kommer dem personligt til nytte. De nuværende insekttolerante og giftresistente GM-planter tjener primært til bøndernes fordel og en lavere produktionspris. Der forskes fx også med genteknologien i at skabe tørke- og salt-tolerante planter, der kunne blive til gavn for bl.a. afrikanske bønder og måske afhjælpe en fødevarekrise i fremtiden. Planter med en vaccinerende virkning over for sygdomme er også under udvikling. En genmodificeret ris med højt A-provitamin-indhold forventes at kunne blive godkendt i 2012 (læs case). Trods disse mulige nytteværdier af genmodificering har andre den holdning, at genmodificering af planter og dyr principielt er forkert uanset formålet.

    I casen Geden som en moderne medicinfabrik beskrives, hvordan en ged med et menneskeligt gen indsat kan udskille et medicinsk protein i mælken. Processen er godkendt af de amerikanske myndigheder, og medicinen er også godkendt i EU. Geden lider ingen smerte ved produktionen. Alligevel kan det diskuteres, om det overhovedet er etisk acceptabelt at indsætte fremmede gener i dyr for at give mennesket medicinske fordele, selvom geden måske behandles bedre end en konventionel malkeko.

    Etik og dyr i genteknologisk forskning og knockout-mus

    I biologisk forskning er gensplejsning af mikroorganismer meget udbredt til at studere betydningen af forskellige gener. Deres proteiners samspil i cellerne kan fx følges ved at mærke dem med et fluorescerende protein som fx GFP (grønt fluorescerende protein). Dette kan gøres genteknologisk ved at indsætte GFP-genet i forlængelse af det ønskede gen lige inden dets stopcodon.

    De etiske problematikker i forskningen optræder især i forbindelse med brug af højerestående organismer, som fx mus i sådanne eksperimenter.
    Mus bruges bl.a. i genteknologisk forskning til at studere effekten af mulige sygdomsfremkaldende gener, fx ved skabelse af såkaldte ‘knockout’-mus.
    For at opdage hvad et gens betydning er, laves der i forskningen gerne et ‘knockout’ af genet. Et gen-knockout er simpelthen en ødelæggelse af genet, og her er mus populære pga. deres relativt store genetiske lighed med mennesker.

    Figur 2Mus med genet for GFP indsat. Genet stammer fra en bestemt vandmand, men det kan flyttes med genteknologi og fx bruges til at følge placeringen af et interessant protein i organismen.

    Ved at studere musens reaktion på at mangle genet, kan det give en idé om, hvad genets normale virkning er. Lidt som hvis man udelod husblassen i en citronfromage, og derved erkendte ud fra det yderst flydende resultat, at husblas er nødvendigt for fromages stivhed. Disse knockout-mus kan have alvorlige defekter som følge af mangel på et vigtigt gen, men den viden, de giver, kan til gengæld potentielt redde menneskeliv, fordi det måske bliver muligt at designe ny medicin.

    Igen omgiver etiske dilemmaer altså genteknologien som følge af de medførte risikozoner og nye muligheder.

     

    Etiske diskussionsspørgsmål

    Der er således mange argumenter både for og imod de forskellige anvendelser af genteknologien, ligesom genteknologien også kan diskuteres etisk ud fra spørgsmål om fx kloning, stamceller og udvælgelse af designerbørn, der ikke er behandlet her. De følgende spørgsmål er ment til diskussion ud fra dette oplæg. Der er naturligvis ingen ‘rigtige’ eller ‘forkerte’ svar.

    1. Mener du, det er etisk acceptabelt, at benytte genmodificerede mikroorganismer (cellefabrikker) til at producere værdifulde stoffer som fx medicin eller brændstof?

    2. Mener du, det er etisk acceptabelt, at frembringe genmodificerede dyr til fx medicinproduktion, hvis de ikke har nogen smerte ved det? Hvad hvis de havde en begrænset smerte?

    3. Vil du være tryg ved at spise godkendte GM-planter med hensyn til din sundhed og hvorfor/hvorfor ikke?

    4. Hvad ser du som den største risiko ved at udsætte GM-planter i naturen?

    5. Hvilke forskelle er der på traditionel plante- og dyreforædling i landbruget og genmodificering af de samme dyr og planter?
    6. Er det etisk acceptabelt at genmodificere dyr i laboratorier, fx mus, hvis det medfører smerter, men kan lede til opdagelsen af ny medicin mod fx HIV?
      Ændrer du holdning, hvis formålet var medicin mod fedme?
  • Cases: Genteknologi

    Tre cases beskriver eksempler på, hvordan genteknologien faktisk benyttes til genetiske ændringer af planter og dyr.

    Generel introduktion til genteknologi i planter og dyr
    Det er ikke kun mikroorganismers DNA, der kan ændres med genteknologien. I dag kan forskere skabe både planter og dyr, der er transgene dvs. med fremmede gener indsat, enten som en hjælp i et forskningsprojekt eller for at give dem helt nye egenskaber.

    Siden halvfemserne har verden således set forskellige nye genmodificerede (GM) organismer, som fx tomaten Flavr Savr, der ikke sådan lige rådnede, “gyldne ris” fyldt med provitamin A og geder, der udskiller komplekse lægemidler i mælken. Konsekvenserne for miljøet og bønderne ved dyrkning af GM-afgrøder kan være både dårlige og gode, men i hvert fald svært gennemskuelige, og derfor føres der meget streng godkendelseskontrol med nye transgene planter, der skal sættes fri i naturen. Alligevel er der forskel i landenes godkendelseskrav, hvorfor især GM-bomuld, -majs og -soya i dag er meget udbredte uden for EU, mens EU har godkendt færre planter til dyrkning (læs mere i Etik og lovgivning i genteknologi).

    Trods den især europæiske forbrugerskepsis overfor GM-fødevarer, udvikles der stadig nye arter, heriblandt Golden Rice-projektet, der har til mål at få risplanter til at danne provitamin A (β-caroten) i riskornene. A-vitaminmangel findes nemlig blandt omkring 140 mio. mennesker i tredjeverdenslande, og ris er en billig, udbredt fødevare mange af de steder.

    Genteknologi bruges også i pharming, der i stedet for at indsætte forbedrende egenskaber, er brugen af planter og dyrs avancerede cellulære maskineri til at producere komplekse medicinske proteiner – i princippet en slags højavanceret cellefabrik (som introduceret i 2 Cellefabrikker). Efter disse levende ”medicinalfabrikkers” dyrkning kan stofferne høstes fra fx tidslers blomster, tobaksblade eller i en geds mælk.

    Case: Insekttolerant bomuld

    Insekttolerance er en af de forholdsvis få egenskaber, der med succes er givet til genmodificerede planter, men der er stadig en række udfordringer.

    En af de få genmodificerede planter, der virkelig er blevet udbredt, er den insekttolerante Bt-bomuld, der nu findes på store arealer i USA og flere udviklingslande heriblandt Kina og Indien. Bt-bomuldsplanten har gener fra bakterien Bacillus thuringiensis (Bt) indsat, så bakteriens naturlige insektgift Bt toxin produceres i planten til skade for angribende insekter. Virkningsmekanismen af insekttolerancen er altså relativt simpel, da planten så at sige overtager bakteriens beskyttelse, som bekvemt kan kodes for af ét gen. Siden 1996 har insekttolerant bomuld været på markerne i forskellige lande – og samme princip bruges også i bl.a. genmodificerede majs, soya og kartofler. Bt-majs (MON810) er en af de få godkendte genmodificerede planter i EU, men den er forbudt i visse medlemslande og dyrkes ikke i Danmark.

    Figur 1 – Høstklar bomuldsmark. Foto: David Nance

    Bt-bomulden er blevet så udbredt, at forskellige varianter med Bt toxin dækker 45 procent af verdens bomuldsareal i 2009, og da markerne giver 30-40 procent mere udbytte end de normale, er det i dag godt over halvdelen af verdens bomuldsproduktion, der stammer fra denne genmodificerede (GM) bomuldstype. Flere udviklingslande har taget planten til sig, og der har for nylig været rapporter om en betydelig levevilkårsforbedring for bl.a. kvinder i bomuldslandbruget i Indien pga. Bt-bomulds højere udbytte. Tøj købt i Danmark kan altså sagtens indeholde Bt-bomulden, men Bt-toxinet generer ikke mennesker.

    Det insektdræbende Bt-toxin

    Bt-toxin er et lille krystalprotein skadeligt for cellerne i fordøjelseskanalen hos mange insekter inklusiv nogle af dem, der angriber bomuldsmarkerne. Når tarmen således ødelægges, dør insektet. Med Bt-bomuld kan sprøjtningen med belastende pesticider derfor mindskes. Bt-toxinet er ikke nyt som giftmiddel, og bruges faktisk også som sprøjtemiddel af konventionelle afgrøder, og Bt-bakterien må også udsættes til skadedyrsbekæmpelse på økologiske afgrøder. Ved sprøjtning er ulempen, at der kun rammes de insekter, der er til stede ude på planten under sprøjtningen. Larver der angriber bomuld, opholder sig ofte inde i planten, og sprøjtning helt op til 15 gange kan være nødvendig per dyrkning.

    Kritik: Skaber de tolerante planter resistente insekter?

    GM-planter med Bt toxin kritiseres fra flere sider. Som med andre giftstoffer kan de ramte insekter udvikle resistens, så de ikke længere dræbes af giften, hvilket har været frygtet af nogle lige fra starten; ingen kender langtidsvirkningerne på miljøet fra en forandret plante.

    I 2010 vakte det derfor opmærksomhed, at et af firmaerne bag planterne, Monsanto, selv rapporterede, at den røde bomuldslarve (pink bollworm) i flere indiske provinser havde udviklet resistens overfor Bt toxin (fra genet cry1Ac) og derfor kan angribe planterne igen.

    Fordi GM-markerne næsten ikke sprøjtes, er det også frygtet, at det forandrede miljø i markerne betyder, at nye skadedyr vinder indpas i disse marker. Disse skadedyr blev tidligere holdt nede af insekterne.

    En af metoderne, som resistensudviklingen forsøges holdt nede med, er ved at dyrke markerne med forskellige varianter og kombinationer af Bt-toxinet indsat i generne. Fordelen er, at selvom et insekt udvikler resistens over for den ene af toxin-varianterne, vil det sandsynligvis stadig dræbes af det andet Bt-toxin. Risikoen for resistens er derfor væsentligt mindre. I det konkrete indiske tilfælde var markerne med resistens dyrket med kun én variant. En anden medvirkende årsag, kan også have været mangel på plantning af de såkaldte Bt-fri refugier.

    Bt-fri refugium i markerne

    Udvikling af resistens er et naturligt fænomen, som også kendes fra sygehusene, hvor superbakterier bliver resistente over for antibiotika. Som værn mod resistensen i marker, forpligter brugere af Bt-planterne sig til, at plante et såkaldt refugium af samme afgrøde, men uden Bt-toxin på 20-50 procent af markarealet. Her må almindelige pesticider anvendes, og de overlevende insekter vil ikke være resistente over for Bt-toxin.

    Manglen på Bt-resistens i refugiet mindsker resistensudviklingen i de nært voksende Bt-sorter, fordi insekterne fra refugiet vil bevæge sig ind og parre sig med eventuelt Bt-resistente insekter, som er opstået. Her vil de få et afkom, der både har et allel af genet, der fører til Bt-resistens og et allel, som ikke gør; insektet er altså heterozygot (se figur 2). De heterozygote insekter er ikke resistente overfor Bt, fordi resistens-genet er recessivt(vigende), og de vil derfor efterfølgende sandsynligvis dø af Bt-toxin.

    To heterozygote insekter vil dog sammen kunne et få homozygot afkom, som er Bt-resistent, og brug af refugier er bestemt heller ingen total beskyttelse mod resistensudvikling.

    Anden generation af GM-planter udvikles nu til at blive tolerante for fysisk stress som fx kulde, saltvand og tørke. Den første tørke-tolerante bomuldsplante forventes at kunne komme på markerne omkring 2012. I mellemtiden rejses spørgsmålet om den første generation af Bt-planter måske snart forældes, fordi insekterne muligvis udvikler mere resistens for Bt-toxinet.

    Disse rapporter tyder ifølge nogle på, at gensplejsning næppe er nogen mirakelløsning, men måske et hjælpemiddel, og at udviklerne må fortsætte kampen og måske foretage nye gensplejsninger for at bevare virkningen. Hvis resistensen bliver mere udbredt, må bomuldsbønderne muligvis igen til at tage flere gamle skadedyrsmidler i brug.

    Arbejdsspørgsmål

    1. Hvordan virker de insekttolerante bomuldsplanter?
    2. Hvilke fordele får bønderne af at bruge insekttolerante bomuldsplanter? Er der også fordele for miljøet?
    3. Hvilken kritik er der rejst imod Bt-bomuld?
    4. Hvordan ser det ud til at gå for Bt-bomuldsplanten i dag?
    5. Forklar hvilke ting bønderne kan gøre for at undgå at udvikle resistente insekter og hvordan det virker.
    6. Hvordan virker et Bt-frit refugium? Forklar figur 2.
    7. Diskuter jeres egne holdninger til brug af genteknologi i planter og sæt det i forhold til de dilemmaer, som I tror regeringerne har i udviklingslande som Kina og Indien med fattige bønder og manglende ressourcer.

    Figur 2 – Oversigt over hvordan krydsning af et Bt-resistant insekt (rødt) med et ikke-resistent fra et refugium uden Bt-planter vil føre til heterozygot, ikke-resistent afkom, der kan dø af Bt-toxinet. Da resistens-genet er recessivt, kræves nemlig to r-alleler for at skabe et resistent insekt.

    Case: Gylden ris 2.0

    Gylden ris er en genmodificeret plante lavet for at bekæmpe A-vitamin mangel, men 20 år efter projektets start er planten stadig undervejs.

    Mange af de udviklede genmodificerede afgrøder gør mest livet nemmere for bønderne, men projekt Golden Rice har andre, mere humanitære ambitioner. Projektet blev startet af forskeren Ingo Potrykus ved ETH

    Zürich, Schweiz i 1992, og efter syv års arbejde kunne hans hold præsentere en ny, genmodificeret ris-sort designet til at tackle verdens problem med A-vitaminmangel. 140 mio. mennesker skønnes at lide af manglen, der fører til blindhed og 6.000 dødsfald dagligt. Trods stor opmærksomhed har projektet mødt en del udfordringer bl.a. med at skaffe de fornødne godkendelser, og i dag forventer Potrykus, at risen tidligst kan være dyrkningsklar i 2012 – tyve år efter projektets start.

    Figur 1 – Almindelig og gylden ris. Foto venligst stillet til rådighed af Golden Rice Humanitarian Boardwww.goldenrice.org

    Den gyldne ris er tilført to fremmede gener, der får den hvide del af riskornene (frøhviden) til at producere det orangerøde β-caroten, der især kendes fra gulerødder. β-caroten er et provitamin, som kroppen selv kan omdanne til vitamin A. Det var også risenes karakteristiske gyldne farve, der gav dem navnet gylden ris.

    Udvikling af planten

    Risplanter producerer faktisk β-caroten helt naturligt, men desværre ikke i den del af risene, der spises. Så den genteknologiske opgave forskerne satte sig, var at skabe den kemiske produktionsvej i risens frøhvide.

    Risen danner naturligt stoffet geranylgeranyl-PP, som i en række af fire trin kan ende som β-caroten (figur 2), hvis de rette enzymer er til stede. For at danne enzymerne indsatte forskerne derfor først genet psy, som de fandt i påskeliljer. Det koder for det nødvendige enzym phytoen synthase, der styrer første trin i reaktionsvejen. Men forskerne koblede også endnu en lille sekvens til genet, som klogt nok dirigerer enzymet hen til netop plastiderne.

    Figur 2 – Den nye reaktionsvej i den gensplejsede risplante for at omdanne geranylgeranyl-PP til β-caroten. Hver pil er en reaktion (et trin), der styres af et nødvendigt enzym (i kursiv). Enzymerne kommer fra generne psy, crt1 og lcy (nævnt i parentes). Det er altså de tre gener, som skal fungere i risens frøhvide. 

    Til det næste trin i omdannelsen fandt forskerne genet crt1 fra en jordbakterie (Erwinia uredovora). Genet koder for det næste nødvendige enzym phytoen desaturase, som katalyserer både det andet og tredje trin i omdannelsen til β-caroten (figur 2). Det sidste trin fra lycopen til β-caroten fandtes der allerede enzymer for i riskornen. Den gyldne farve af de gensplejsede ris tydede på, at forsøget var lykkedes, og målinger gav dem efterfølgende ret: β-caroten blev produceret i frøhviden.

    Potrykus blev verdensberømt, da hans hold offentliggjorde deres resultater i 2000, men der viste sig en række problemer. Selvom risene blev flot gyldne, var β-caroten-indholdet så lavt, at man skulle indtage usandsynligt store mængder ris for at nå det anbefalede daglige A-vitaminindtag.

    For at løse det fattigdomsproblem, som A-vitaminmangel primært er, var et yderligere problem, at Potrykus’ hold havde brugt en række genteknologiske metoder, som bioteknologiske virksomheder havde rettighederne til, fordi de havde opfundet dem. De ville derfor skulle have royalty-penge i licens, som kunne gøre risen alt for dyr. Desuden havde to firmaer skudt penge i projektet, hvorfor de også skulle have andel i det. De to firmaer skabte derfor selskabet Syngenta, der fik patentretten til de gyldne ris. Til gengæld skal de bl.a. stille risplanterne licensfrit (dvs. svarende til almindelig ris) til rådighed til brug for bondefamilier, der tjener mindre end 10.000 USD årligt, så Potrykus’ oprindelige drøm om at hjælpe fattige mennesker stadig kan opfyldes.

     

    Genetisk optimering til version 2.0
    Der var dog stadig problemet med risens lave indhold af β-caroten, og forskerne skulle derfor optimere de indsatte gener. Forskerholdet i Syngenta fik den ide, at niveauet kunne øges ved at fjerne en såkaldt flaskehals ved det første reaktionstrin (psy-genet) i reaktionsvejen (se figur 2). Det tydede nemlig på, at dette første omdannelsestrin foregik meget langsommere end de næste trin.

    Flaskehalsen blev opdaget, fordi forskerne kunne måle, at der stadig var rigeligt af startstoffet geranylgeranyl-PP til stede i de gyldne ris, men meget lidt af de næste stoffer, der altså blev omdannet hurtigst muligt af næste enzym i rækken. Deres løsning var derfor at finde en hurtigere variant af det langsomme første enzym, for dannelsen af β-caroten vil ikke være hurtigere end det langsommeste trin i reaktionsvejen. Forskerne testede derfor forskellige andre organismers udgave af psy-genet i stedet for det oprindelige fra påskelilje. Og da de afprøvede psy-genet fra majs, var resultatet en svimlende 23-dobling af det første udbytte; de opnåede 31 mikrogram β-caroten per gram ris. Dette boost af produktionen var vigtigt, fordi halvdelen af et 3-årigt barns anbefalede daglige indtag på 300 mikrogram A-vitamin dermed ville kunne opnås af 72 g tør ris. Kroppen omdanner nemlig β-caroten til A-vitamin cirka i forholdet 12:1.

     

    Miljøorganisationer som Greenpeace har fra begyndelsen haft en negativ holdning til den genmodificerede gyldne ris. Blandt andet kritiserer de, at β-caroten i en vis grad går tabt under kogningen, så ris ikke er nogen god kilde. Desuden hæfter Greenpeace sig ved, at langtidsvirkningerne ikke er kendte, men de går heller ikke ind for at undersøge dem. I forhold til at risen endnu ikke har reddet nogen, mener de snarere, at projektet har fået alt for meget mediehype.

    Ingo Potrykus selv følger stadig projektet og er i dag utilfreds med den lange tid, han føler, at han har ”mistet” i projektet på at skaffe omfattende testresultater og godkendelser hos myndigheder. Han gætter nu (2010) på, at risen kan nå bønderne i 2012, igen afhængigt af myndighederne.

    Den gyldne ris er måske eksemplet på, at en mere humanitær genmodificeret organisme kan skabes, men viser også, at myndighederne er faste i deres krav til godkendelse.

     

    Arbejdsspørgsmål
    Nogle spørgsmål tager udgangspunkt i teori fra resten af materialet.
    1. Hvordan kan β-caroten være til gavn i udviklingslandene?
    2. Hvordan kan det lade sig gøre, at få en risplante til at danne β-caroten i frøhviden?
    3. Hvilken opgave har generne psy, crt1 og lcy i den gyldne ris? Findes nogle af generne også i almindelig ris?
    4. Hvilken kritik er der rejst af den gyldne ris?
    5. Giv et eksempel på et genteknologisk værktøj, som forskerne kunne bruge for at teste, at de nye gener faktisk var indsat i risplanten?
    6. Forklar hvorfor der var behov for at lave den nye variant gylden ris 2.0.
    7. Hvordan fandt forskerne på at indsætte et nyt psy-gen i gylden ris 2.0 ?
    8. Beregn ud fra oplysningerne i casen, hvor meget vitamin A, man ville få i kroppen ved at spise 72 gram af den gyldne ris 2.0.
    9. Foreslå mindst to andre optimeringsmetoder fra 3 Genetisk tuning, man måske kunne bruge, og forklar din idé.
    10. De lokale dyrkningsforhold for ris i Asien er meget varierende, og forskellige rissorter er populære alt efter hvor, man er. Hvordan kunne man tage højde for det, hvis man vil tilbyde bønderne ’den gyldne ris’ tilpasset lokale forhold?
    11. Er β-caroten et protein eller en metabolit? Hvorfor?

     

    Figur 3 – Rismark

    Figur 4 – Udbyttet af β-caroten i den oprindelige gyldne ris i forhold til den forbedrede (2.0), hvor forskerne udskiftede det langsomme enzym gen psy med et tilsvarende fra majs.

     

    Case: Geden som en moderne medicinalfabrik

    Transgene geder er udviklet til at producere humant antithrombin og udskille det i mælken.

    Medicinske proteiner, som en patient måske ikke længere selv producerer tilstrækkeligt, kan være komplekse. Så komplekse at en simpel E. coli-bakterie eller gær ikke kan producere stoffet. En mere avanceret organisme, der ligner mennesker mere, kan derfor blive interessant at bruge. En af disse er geden, som det lykkedes forskere at gensplejse til at udskille et stof i mælken mod blodstørkning.

    Det værdifulde stof hedder antithrombin. Dermed blev malkning pludselig et vigtigt trin i en lægemiddelproduktion, og produktet er nu godkendt af både EU og USA’s medicinalmyndigheder til behandling. Mangel på blodproteinet antithrombin (AT) er medfødt hos 1 ud af 5.000 mennesker. De har ved behov tidligere fået AT fra menneskeligt donorblod, men for alene at udvinde 1 kg, kræves 20.000 blodportioner, og behandlingen er derfor ganske omkostningsfuld. På en særlig indrettet gård i Massachusetts, USA har et firma i stedet en stald med nogle genetisk modificerede geder, der hver især vil kunne producere 1 kg humant antithrombin (rhAT) om året.

    Figur 1 – Blodpropper kan dannes af thrombin, der omdanner blodproteinet fibrinogen til det uopløselige fibrin. Her ses røde blodceller i en åre.

    Gederne malkes, og fra mælken oprenses proteinet, der som tørt pulver kan opløses og gives til trængende patienter på hospitaler, hvilket bl.a. mindsker risikoen for blodpropper. Da donorblod principielt kan bære sygdomme som HIV og Creutzfeld-Jacobs fra en uopdaget syg donor, må man benytte store screeningsprogrammer for at sikre, at der ikke videregives sådanne sygdomme med lægemidler udvundet fra blod – dette behov medfører rekombinant produktion ikke.

    Antithrombin i blodet: Modvirker størkning

    AT virker i blodet ved at hæmme enzymet thrombin, der får blod til at størkne. Thrombin omdanner nemlig blodproteinet fibrinogen til det uopløselige fibrin, så størkningen foregår (se figur 2). Thrombin aktiveres derfor ved sår for at undgå blodtab, men antithrombin er også vigtigt for at indstille den balance, som sikrer, at blodet kun størkner det rigtige sted og ikke bliver for tykt.

    Patienter, der mangler antithrombin, er mere udsatte for at danne blodpropper, og ved operationer og fødsler kan man derfor give patienterne AT for at genoprette deres balance. AT er et større protein (58 kDa), som er glykosyleret (påhæftet sukkermolekyler). Glykosyleringen styrer bl.a. stoffets halveringstid i blodet, og derfor skal glykosyleringen gerne minde mest muligt om den humane, for at rekombinant AT vil være effektivt.

    Design af ekspression

    Forskerne, der udviklede den transgene ged, var naturligvis ikke interesserede i bare at få en ged, der producerede meget humant antithrombin (rhAT) i alle dens celler. Så for at lokalisere produktionen til mælkekirtlerne, indsatte de genet for rhAT efter en særlig promoter for mælkeproteinet β-kasein. Promoteren aktiverer netop transkriptionen af dens gen i cellerne i mælkekirtlerne, hvor β-kasein også produceres. På den måde kunne det dannede rhAT blive udskilt i gedemælken ligesom β-kasein (læs evt. mere om promotere i Genetisk tuning)

    Figur 2 – Antithrombins bremsende virkning på blodstørkningen. Antithrombin hæmmer enzymet thrombin, som får blod til at størkne ved at omdanne fibrinogen til fibrin. 

    I laboratoriet blev DNA’et injiceret i gede-ægceller, som blev indsat i en hunged, der fungerede som rugemor. Efter fødslerne fandt man en hanged ved hjælp fra bl.a. Southern blotting, der bar det nye gen. Hangeden vil ikke producere rhAT, selvom den bærer genet, fordi det aktiveres i mælkekirtlerne, så man kunne kun kigge på selve DNA’et.

    Efter parring med en almindelig ged, blev der født hungeder, der producerede rhAT i mælken. Koncentrationen nåede ca. 2 g/L mælk i de bedste kandidater, som man gik videre med. Udviklingen var dog ikke problemfri, og der fødtes bl.a. transgene geder, der var sterile eller for tidligt ophørte med at danne mælk.

    Den rekombinante antithrombin fra geder viste sig også at være lidt anderledes glykosyleret end humant antithrombin, men undersøgelser viste, at det stadig var effektivt.

    Brug af rekombinant antithrombing

    AT er et protein, og en eventuel forestilling om at kunne udstyre AT-mangel-patienter med frisktappet rhAT-gedemælk, vil ikke virke, hvor praktisk tiltalende den end lyder. Proteinet vil som de øvrige proteiner simpelthen blive nedbrudt i maven og ikke få sin effekt. AT skal gives intravenøst (i blodbanen) og skal derfor først oprenses fra mælken. Lægemiddelproduktion stiller desuden altid meget høje krav til kvalitet, renhed og selve produktionen. Disse krav må firmaet bag rhAT også opfylde.

    rhAT sælges nu under navnet ATryn og er det første godkendte lægemiddel, som er produceret i transgene dyr. ATryn vil kun blive brugt på hospitaler, hvor operationer især udgør en fare for patienter, der mangler AT.

    Forbruget af antithrombin i USA og EU tilsammen ligger forholdsvist lavt for lægemidler på omkring 250 mio. kr/år. Udvikling af lægemidler er samtidig en ekstremt omkostningstung affære, men myndighedernes godkendelse af ATryn er blevet set som et grønt lys til sikkerheden ved disse lægemidler produceret i transgene dyr, og udviklingen kan fortsætte mod medicin til mere udbredte sygdomme.

    Ud over mælk, arbejder forskere nu med at udtrykke humane proteiner til medicin i hønseæg og tidselblomster. Måske er fremtidens avancerede medicinfabrikker biologiske på en facon, man ikke havde troet for tyve år siden!

    Diskussions- og arbejdsspørgsmål

    1. Forklar thrombins betydning for at blod kan størkne.
    2. Hvordan påvirker antithrombin blodstørkningen?
    3. Hvordan kunne forskerne få en ged til at producere humant antithrombin?
    4. Hvorfor brugte forskerne en promoter til at aktivere antithrombin-genet netop i mælkekirtelcellerne? (Overvej hvad der måske kunne ske, hvis der blev produceret store mængder antithrombin i alle gedens celler?)
    5. Hvilke fordele/ulemper er der ved at producere antithrombin rekombinant i en ged ift. udvinding fra menneskeligt donorblod?

     

    Figur 3 – Landbrugsgeder, ikke-genmodificerede. Foto: Fir0002/Flagstaffotos (GFDL 1.2).

    Enzymer har i dag vundet indpas som biologiens løsning på flere udfordringer i den moderne verden. Som det er tilfældet i cellerne, kan enzymer i dagligdagen og industrien nemlig gøre reaktioner mulige, som ellers ikke ville forløbe nævneværdigt.

    Men hvordan findes og udvikles disse smarte enzymer? Genteknologi er en del af svaret.

    Hvorfor enzymer?

    En gren af bioteknologien beskæftiger sig netop med at opdage og udvikle enzymer, der fx hjælper til at forbedre bagning og andre fødevarer, producere biobrændstof og behandle tekstiler. Enzymer kan åbne for nye muligheder eller de kan erstatte kemikalier, der fx ikke har den biologiske fordel, at de som enzymerne består af aminosyre-kæder, der er nemt nedbrydelige i naturen.
    Et andet stort område er vaskemidler, hvor enzymer katalyserer nedbrydning af snavs og har gjort det muligt at vaske tøj rent ved kun 20 °C, samt erstatte nogle mere miljøbelastende kemiske midler.

    Figur 1. Jagten på nye enzymer bringer forskerne vidt omkring. Foto: Novozymes.

    Novozymes er verdens førende udvikler og producent af enzymer til bl.a. vaskemidler og har hovedkontor i Bagsværd nord for København. Novozymes’ vaskeenzymer hjælper med nedbrydning af snavs som proteiner, stivelse og fedt, men udviklingen af dem kan være lang.
    Enzymer, der udvikles af et firma som Novozymes, bliver først fundet i naturen. Det kunne være i mikroorganismer, der lever i barske miljøer, som minder om de ret basiske forhold i en vaskemaskine. Men udover den første udfordring med at opdage et attraktivt enzym, venter der også en genteknologisk opgave med at få skabt en god cellefabrik til at producere det i store mængder og evt. forsøge at optimere virkningen af enzymet.

    Enzymers virkning kort fortalt

    Et enzym er et protein, som har et active site område, der kan katalysere en kemisk eller biologisk reaktion. Enzymer er ofte meget specifikke i hvilken reaktion, de katalyserer, fordi reaktanterne skal passe rummeligt ind i deres tredimensionelle struktur for at blive omdannet til produktet. Snavs af proteiner, stivelse og fedt nedbrydes af hhv. proteaser, cellulaser og lipaser, der alle er hydrolytiske enzymer. De nedbryder de lange kæder af stofferne til mindre molekyler ved tilføjelse af H2O til deres bindinger, der derved deles i mindre dele. De mindre molekyler kan derfor langt nemmere skylles af tøjet (se reaktionsligning, figur 2).

    Figur 2Reaktionsligningen for enzymet lipolases spaltning af triglycerider (fedt) i mindre molekyler, som lettere kan skylles væk.

    Enzymets struktur og kemiske grupper spiller sammen med reaktanterne under reaktionen og understøtter forløbet. Reaktionen kræver derfor mindre aktiveringsenergi og forløber ofte derved markant hurtigere. Enzymet indgår altså i reaktionen, men forbruges ikke selv og er derfor klar til at katalysere samme reaktion igen bagefter. Husk at enzymer og andre katalysatorer aldrig påvirker selve placeringen af reaktionens ligevægt – kun hvor hurtigt den indstiller sig (reaktionshastigheden).

     

    Til kamp mod læbestiftspletter:

    Udvikling af et fedtnedbrydende vaskeenzym

    Et af de effektive, fedtnedbrydende lipase-enzymer er udviklet af Novozymes i Japan og Danmark til vaskemidler, der kan fjerne pletter fra fx smør, olie eller læbestifter. Enzymet er en bioteknologisk succeshistorie om en udviklingsproces, hvor forskerne som så ofte pludseligt måtte tænke kreativt, da de kom under tidspres.
    Fedtnedbrydende lipaser fandtes allerede i 1970’erne til vaskemidler, men de var dengang ikke så effektive.

    For at finde nogle bedre lipaser, startede Steen Riisgaard, den nuværende direktør for Novozymes, i 1982 et forskningslaboratorium med en lille håndfuld mennesker i Tokyo for Novo Nordisk (inden enzymdelen senere blev skilt ud i Novozymes). Laboratoriets første opgave blev at analysere en masse mikroorganismer for at se, om de producerede interessante lipaser, en almindelig strategi for at finde nye enzymer.
    For at få mere fokus på lipaserne blev der i 1984 oprettet en lipase-gruppe med 15 personer, og i årene 1985-86 fokuserede de mest på bakterielle lipaser, specielt fra bakteriearten Pseudomonas. De fandt dog også adskillelige lipaser fra svampe, men spørgsmålet var, hvor godt de virkede.

     

    Arbejdet i Japan

    Måske fordi Steen Risskovs laboratorium lå i Tokyo, startede holdet et samarbejde med den japanske vaskemiddelproducent Lion, der var presset af konkurrence på markedet. Lion testede en række af Novo Nordisks lipaser sammen med deres vaskemiddel for at finde de bedste kandidater, og i sommeren 1987 vendte de tilbage med meddelelsen om, at de havde fundet en meget god lipase fra den termofile svamp Humicola lanuginosa.
    Lipasen skulle gerne med i Lions nye produkt, som de ville introducere i april 1988. Det var en glædelig nyhed for udviklerne, men pludselig skulle det også gå stærkt, hvis de skulle kunne nå at levere nok af lipasen til det store japanske marked.
    H. lanuginosa stammen producerede nemlig ikke meget lipase naturligt, så holdet gik i gang med at optimere fermenteringerne af svampen på klassisk vis. Det indebar bl.a. at danne forskellige tilfældige mutationer, som forhåbentlig førte til øget produktion, og det var ikke en nem opgave.

    På dette tidspunkt sidst i firserne var genteknologien ny, men i kraftig udvikling, og det var året inden (1986) lykkes andre forskere i Novo Nordisk at producere rekombinant humant insulin med gær som en cellefabrik.
    Derfor var der også nogle, der mente, at man også skulle satse på genteknologi til denne udfordring. En lille gruppe arbejdede derfor på at indsætte genet, der kodede for lipasen, i en ekspressionvektor. Ideen var så at sætte ekspressionsvektoren ind i Aspergillus oryzae, der er en god svamp til produktion. Til at begynde med gik det ikke så godt med det genteknologiske projekt, men i november 1987 lykkedes det med en god promoter foran H. lanuginosa lipase-genet at få høje lipase-udbytter i A. oryzae.

     

    Den første produktion

    På det tidspunkt havde Danmark vedtaget verdens første lov om genteknologi. Derfor var det svært at få en hurtig produktionsgodkendelse til en svamp, der var blevet genmodificeret. Heldigvis havde Novo Nordisk netop bygget en fabrik i Japan, så fermenteringerne blev foretaget der. Problemet var bare, at enzymer leveres i et granulat på pulverform, som den japanske fabrik ikke kunne lave. Den kim-filtrerede (uden levende materiale) fermenteringsvæske måtte derfor sendes til Danmark for at blive granuleret, hvorefter det blev sendt tilbage til Japan og Lion. I 1988 kom Lion efter planen på markedet med vaskemidlet Hi-Top, som indeholdt verdens første rekombinant producerede vaskeenzym – Lipolase.

     

    Optimering af enzymet (Protein engineering)

    Lipolase blev snart solgt godt rundt omkring i verden, og i starten af 90`erne ville Novo Nordisk gerne forbedre lipasen, så den virkede endnu bedre under vask. Et af problemerne var, at en del af fedtet blev nedbrudt efter selve vasken, så pletterne først gik væk ved anden vask!

    For at forbedre enzymet skulle selve aminosyresekvensen altså ændres, og for at gøre det, måtte man altså ændre i genet. Da bakterier er lette at arbejde med, var planen, at bruge dem til at producere en række forskellige varianter af lipasen, hvor en eller flere aminosyrer var ændret. Desværre kunne lipasen slet ikke produceres i fornuftige mængder i bakterier, men det viste sig, at lipasen godt kunne produceres af gæren Saccharomyces cerevisae. Denne gær er også let at lave genteknologiske forsøg med, så det gav mulighed for at lave de mange forskellige varianter af lipasen, og man kunne undersøge, om varianterne blev bedre i vaskepulver.

    Overraskende opdagede forskerne, at lipase produceret fra gær i sig selv virkede bedre i vaskepulver end selvsamme lipase produceret i A. oryzae. Gæren kunne dog ikke producere så store mængder af lipasen, at det kommercielt kunne betale sig. Forskerne måtte derfor finde ud af hvad årsagen var til denne forskel mellem lipase produceret i A. oryzae og i gær. Det viste sig, at der var tilføjet nogle flere positivt ladede aminosyrer på enden (N-) af lipasen produceret i gær, hvilket gav den øgede aktivitet af lipasen i vaskepulveret. Mange forsøg blev gjort på at lave en ligeså god lipase, som kunne produceres i store mængder af A. oryzae. Heldigvis havde man fået lavet en røntgenstruktur af lipasen, som gjorde det muligt at se lipasen i 3D.
    Derfor kunne man præcist sige, hvor de ekstra positive aminosyrer var placeret i lipasens tredimensionelle struktur. Der blev lavet en række lipase-varianter, hvor man ændrede aminosyrerne i samme region af lipasen til positivt ladede aminosyrer. En af disse varianter viste sig at være rigtig god. Den kunne endda produceres i store mængder af A. oryzae, og den er siden blevet til Novozymes’ vaskeenzym Lipex.

     

    Arbejdsspørgsmål:

    Slå med fordel op i Genteknologiske værktøjer undervejs.

    1. Hvilke funktioner er de industrielle enzymer i stand til at hjælpe med? Og hvordan bliver de typisk fundet?
    2. Hvad vil det sige, at et enzym er hydrolytisk i sin funktion?
    3. I denne case hører vi hvordan forskerne fik hjælp fra tre forskellige organismer til at udvikle de fedtnedbrydende enzymer. Forklar hvilke og hvad hver organisme i korte træk blev brugt til.
    4. Foreslå en genteknologisk metode, forskerne kunne bruge til at sammensætte det DNA, de skulle gensplejse svampene med?
    5. Når forskellige DNA-stykker sættes sammen, kan der dannes stykker af forkert længde. Foreslå, hvordan forskerne kunne oprense det rigtige.
    6. Giv et forslag til, hvordan forskerne kunne se, om den gensplejsede svamp overhovedet havde optaget og indeholdt den nye indsatte DNA. Forklar kort hvordan

    Flere biologiske lægemidler produceres i cellefabrikker ved at anvende genteknologi.Blandt de forskellige lægemidler er f.eks. visse hormoner, vacciner, antistoffer og det bakteriedræbende stof penicillin, hvis naturlige produktion i en skimmelsvamp er blevet betydeligt optimeret med genteknologi. Et andet eksempel er insulin mod diabetes (sukkersyge).

    Medicinalvirksomheden Novo Nordisk har gennem mange år anvendt genteknologi til udvikling og fremstilling af lægemidler, der anvendes til behandlingen af bl.a. diabetes. Denne case indledes med en gennemgang af diabetes, og hvordan sygdommen behandles med insulin, der er produceret i gensplejsede gærceller. Herefter beskrives det, hvordan forskerne ved hjælp af genteknologi og kreativ tænkning, har udviklet en ny type insulin, samt hvilke udfordringer, de mødte undervejs.

    Insulin til behandling af diabetes

    Diabetes er en udbredt folkesygdom, hvor kroppens egen produktion af insulin er nedsat eller helt ophørt. Insulin binder sig til kroppens celler, hvilket gør det muligt, at de kan optage glukose, som er cellernes primære energikilde. Mangel på insulin betyder, at den glukose, der cirkulerer rundt i blodet, ikke kan optages af cellerne, og derfor stiger glukosekoncentrationen. En langvarig forhøjet blodsukkerkoncentration kan forårsage sen-komplikationer, der vil blive beskrevet nedenfor i afsnittet om følgerne af diabetes. På verdensplan lider 5 % af alle voksne af diabetes. Antallet af mennesker med diabetes er globalt set voldsomt stigende. Læs meget mere om diabetes her.

    Heldigvis har man gennem lang tid kunnet behandle diabetes med indsprøjtninger af insulin. Behandling med humant insulin gør sygdommen meget mindre generende og farlig, fordi patienterne løbende kan sikre brændstof til kroppens celler og sænke koncentrationen af glukose i blodet til det rigtige niveau, hvilket nedsætter risikoen for at udvikle sen-komplikationerne. Behandlingen med insulin kan dog ikke præcist efterligne den naturlige,  løbende insulin-frigivelse hos en rask person, bl.a. fordi virkningen først indtræder lidt tid efter indsprøjtningen. Ved hjælp af genteknologi har Novo Nordisks forskere derfor udviklet både hurtig og langsomt virkende insulin (insulin-varianter), der kan kombineres og give et næsten normalt blodsukkerniveau gennem dagen, og derved reducere symptomer og forebygge sen-komplikationer af diabetes.

     

    Følgerne af diabetes (sen-komplikationer)

    Diabetespatienter, der lever med et bare lidt forhøjet blodsukker i mange år, risikerer bl.a. at blive ramt af blindhed, dårlig sårheling og blodpropper. Samtidig kan et for lavt blodsukker som følge af for høje doser insulin fører til besvimelse og i værste fald dødsfald. Diabetes en derfor en sygdom, som kræver omhyggelig behandling.

    Både diabetes type 1 og type 2 kan behandles med indsprøjtning af insulin. Ved type 1 dannes stort set intet insulin i kroppen, mens kroppens celler ved type 2 ikke længere reagerer tilstrækkeligt på insulin. Livsstilsændringer såsom kostomlægning og øget motion kan hjælpe behandlingen af type 2 diabetes.  

     

    Insulin på et molekylært niveau

    Insulin er et protein, der virker som hormon i kroppen. Det frigives til blodet, når blodsukkerkoncentrationen er høj, hvilket især er tilfældet efter måltider, fordi maden bliver nedbrudt til bl.a. glukose.

    Hvert insulin-protein består af to aminosyre-kæder, der holdes sammen af disulfidbroer. Insulin dannes i bugspytkirtlen ved samme mekanisme som alle andre proteiner: transskription af insulin-genet fra DNA til mRNA og efterfølgende ved translation af mRNA’et til proteinet.

    Cellefabrikker producerer humant insulin i store mængder

    Insulin er et af de første proteiner, der blev fremstillet af en cellefabrik ved at indsætte insulin-genet. Dette gennembrud gjorde, at både gær (S. cerevisiae) og bakterien E. coli siden 1980’erne har været brugt som cellefabrikker til produktion af humant insulin til behandling af diabetes. Fordi det humane insulin-gen er blevet indsat i cellefabrikken, er insulinen identisk med den insulin, der dannes i menneskets bugspytkirtel. Indtil midtfirserne blev insulin til medicinsk brug udvundet fra bugspytkirtler fra køer og svin, men dyrenes insulin er ikke er helt identisk med menneskelig insulin: enkelte aminosyrer er skiftet ud.

    Udover at mindske risikoen for allergiske reaktioner ved at bruge humant insulin frem for insulin fra dyr, undgår patienterne nu også den teoretiske risiko for overførsel af sygdomme fra dyrene. Hvis verdens nuværende behov for insulin-lægemidler skulle dækkes via bugspytkirtler fra svin, skulle man bruge 500 mio. svin. Så produktionen i cellefabrikker løser også en stor praktisk udfordring.

    I store fermenteringsanlæg i bl.a. Kalundborg dyrkes gærceller for at producere insulin-lægemidler til store dele af verden, da Novo Nordisk i dag er en af de førende udbydere af behandling til diabetes.

    Forskernes udfordring: Hurtigtvirkende insulin

    Når en diabetiker skal spise, er det vigtigt at holde blodsukkeret tilpas lavt efter måltidet, f.eks. ved indsprøjtning af insulin. Men humant insulin, der indsprøjtes i underhuden, absorberes langsomt til blodet, og derfor skal et måltid planlægges i god tid for at undgå farlige situationer. Denne udfordring i patienternes hverdag ønskede et udviklingsteam i Novo Nordisk at afhjælpe ved at designe en ny, hurtigtvirkende insulin-variant.

     

    Forbedring af insulins virkningshastighed

    Insulin skal indsprøjtes i underhuden og bliver langsomt absorberet i blodet, fordi de enkelte insulin-molekyler binder til hinanden to og to i såkaldt dimere (figur 1). Ved de høje koncentrationer, som findes i indsprøjtningsvæsken, samler tre dimere sig endda gerne omkring et zink-atom til en hexamer. Disse hexamere er for store til at passere igennem blodåremembranen, så først når hexamererne langsomt med tiden skilles i enkelte molekyler igen, kan de optages i blodet og komme til at regulere blodsukkeret.

    Udviklingsteamet på Novo Nordisk arbejdede derfor med den idé at gøre det sværere for dimererne overhovedet at samle sig til hexamere, så de hurtigere kunne optages i blodet.

    Undersøgelser af den kemiske tiltrækning mellem de enkelte insulin-molekyler viste, at der er nogle særligt tiltrækkende aminosyrer i insulins to kæder (B9, B12, B13, B16 og B23-28, se figur 2).

    Figur 1. Insulin (rød og grøn) samler sig to og to i dimere. Tre dimere samler sig til en hexamer, som er for store til at blive optaget til blodåremembranen efter en indsprøjtning under huden.

    Figur 2. Menneskeligt insulin består af en A- og B-kæde med henholdsvis 21 og 30 aminosyrer. Disulfidbroer mellem cysteiner holder kæderne sammen. De vigtige aminosyrer for insulins binding med andre insulin-molekyler er fremhævet.

    Udviklerne satsede derfor på, at absorptionen ville blive speedet op, hvis nogle af de kemisk tiltrækkende aminosyrer blev udskiftet med aminosyrer, der kunne frastøde hinanden. Omvendt, skulle selve insulinets virkning naturligvis ikke ødelægges af det; der er ingen gavn af et hurtigt absorberet protein, som ikke længere har nogen effekt på kroppen. Da insulin som nævnt virker ved at binde til cellernes overflade-membran, kiggede udviklerne på insulins kontakt med disse såkaldte celle-receptorer i cellemembraner, fordi netop denne kontakt skulle bevares. Det var tidligere opdaget, at insulin faktisk binder til receptoren ved aminosyrerne B12, B16 og B23-25, så disse skulle naturligvis helst ikke ændres.

    Den første hurtigtvirkende insulin-kandidat, som udviklingsteamet producerede tilbage i begyndelsen af 1990’erne, havde udskiftet aminosyren B10 for at forhindre dannelse af insulin-hexameren, og det lod til at være en meget effektiv ændring.

    Figur 3. De to aminosyre-kæder i insulin aspart, hvor insulins naturlige aminosyre ved B28 prolin (Pro) udskiftes med asparaginsyre (Asp).

    Man producerede derfor forventningsfuldt X10 til kemiske forsøg på cellekulturer, hvilket gav positive resultater. Men som det ofte sker med potentielle lægemidler i udvikling, måtte projektet afbrydes, da forsøg med rotter viste dårlige resultater. Forsøget viste en forhøjet risiko for mælkekirtelkræft hos de rotter, som fik X10 ift. rotter som til sammenligning kun fik indsprøjtet saltvand.

    Vejen fra idé til færdigt, godkendt lægemiddel er lang og meget dyr. I den allersidste udviklingsfase af alle nye lægemidler skal stofferne testes i mennesker igennem en række kliniske forsøg, der bl.a. skal skaffe viden om lægemidlets funktion og sikkerhed. I denne flerårige periode opdages og stoppes lægemidler, hvis de viser sig at have uønskede bivirkninger.

    Ideen skulle nu udføres i praksis, og gærceller blev derfor gensplejset med en ekspressionsvektor, der indeholdt genet for den nye variant kaldet insulin aspart. Den eneste forskel i genet var altså codonet for B28, der nu kodede for asparaginsyre. Da gærcellernes ny-producerede insulin aspart var oprenset, kunne forskerne spændt undersøge resultatet.

     

    Test af insulin aspart

    Insulin aspart skulle naturligvis også igennem en lang undersøgelsesprocedure for at sikre kendskab til virkningen og sikkerheden ved det. Til stor glæde for udviklerne, viste stoffet efter mange forsøg sig sikkert at bruge, og absorptionen af insulin aspart i blodet var dobbelt så hurtig som for humant insulin. Insulin aspart kunne stadig binde sig til receptoren på cellerne, og det havde altså ikke tabt sin virkning i forbindelse med den opnåede nye virkningshastighed.

    Insulin asparts hurtige absorption efter indsprøjtning, minder mere om raske menneskers udskillelse af insulin til blodet i forbindelse med måltider Derfor var insulin aspart en interessant forbedring af diabetes-behandlingen for mange patienter.

    I 1999 fik insulin aspart godkendelse til salg i EU med navnet NovoRapid og året efter i USA med navnet NovoLog.

    Den hurtigtvirkende insulin, NovoRapid er et eksempel på, hvordan genteknologi ikke kun kan bruges til at producere lægemidler identiske med naturens, men også mere avancerede varianter, hvor dele af genet er ændret. Som nævnt er genteknologi også udnyttet til at udvikle langsomt virkende insulin, som hjælper med at fastholde insulin-niveauet over længere tid.

    I dag arbejder Novo Nordisks forskere videre med at forbedre behandlingen af diabetes ved hjælp af genteknologi. En af de store satsninger er stamceller (se Biotech Academy-materiale), der måske vil kunne kurere diabetes, men som al medicinsk forskning rummer udviklingen mange udfordringer. De forbedrede insulin-varianter såsom insulin aspart forventes derfor også at være en stor hjælp i diabetes-behandlingen mange år frem endnu.

  • VLab

    Til dette projekt er der tilknyttet to laboratorieøvelser i Det Virtuelle Laboratorium 2.0: “Enzymer til vaskemiddel” og “Produktion af insulin”. Her kan du prøve kræfter med eksperimentel genteknologi i et laboratorium, der er bygget op ligesom et professionelt bioteknologisk laboratorium.

    Arbejde i klassificerede laboratorier

    Når der arbejdes i genteknologiske laboratorier er der en række regler der skal overholdes, for at sikre at genmodificerede organismer ikke kommer ud af laboratoriet. Bl.a. skal man altid bære kittel, bortskaffe affald i særlige affaldsspande og borde og materiale skal desinficeres efter brug. Samtidig er det meget vigtigt at de forsøg der udføres ikke bliver ødelagt ved at DNA eller de bakterier man har på fingrene og tøjet ikke blandes ned reagensglassene.

    Arbejde med gær/bakterier foregår ofte i sterilskab, men især ved brug af antibiotika er det fint på bordet. Når man arbejder med vækstmedium er det vigtigt at sørge for at omgivelserne er sterile, f.eks. ved at bruge et sterilskab. De bakterier man selv har på hænderne, i tøjet og alle andre steder gror lige så godt i vækstmedie og på agarplader som de bakterier eller gærceller man gerne vil dyrke i laboratoriet, og kan derfor nemt komme til at forurene kulturen. Hvis man tilsætter antibiotika til vækstmediet og agarpladerne, kan man slå alle de organismer ihjel som ikke er resistente over for netop dét antibiotika. På den måde sørger man for at kun de gensplejsede bakterier eller gærceller vokser på mediet, og det er ikke så vigtigt at bruge et sterilskab.

     

    Dyrkning af bakterier og gærceller
    For at undgå at få genmodificerede bakterier, som er resistente over for en eller flere former for antibiotika, spredt til resten af laboratoriet, holder man ofte bakterierne i et rum for sig selv.  Se arbejdstilsynets regler (LINK Se under “Arbejde med GMO’er”).

     

    Antibiotika i agarpladen
    De fleste antibiotika-typer støbes ind i agarpladen for at opnå ensartet koncentration i hele pladen. Enkelte andre spredes ud oven på den færdige plade og tørrer ind før man tilsætter bakterier eller gærceller. Man tilsætter aldrig celler og antibiotika samtidig – det er kun her og kun for at illustrere at der skal tilsættes antibiotika.

     

    UV-lampe
    Normalt holder man ultraviolet (UV) lys bag beskyttende plexiglas. UV lys er lys med en bølgelængde som er kortere end for synligt lys, men længere end for røntgenstråling, dvs. 10-400 nm. Selvom det ikke er synligt kender de fleste det fra sollys, hvor det kan forbrænde ens hud hvis man opholder sig for længe i solen uden solcreme eller dækkende tøj. Øjnene kan også tage skade. Det gælder også i laboratoriet, og det er derfor vigtigt kun at tænde UV lampen i kort tid og at beskytte hud og øjne imens den er tændt.

     

    Varmeskab versus rysteinkubator
    Når man opformerer bakterier eller gær i flydende medium, skal man sørge for at der kan komme luft til hele opløsningen. Derfor bruger stiller man normalt en lille maskine der kan ryste reagensglasset ind i varmeskabet, så opløsningen bliver iltet.

     

    Der er IKKE genmodificerede organismer i vaskepulver og insulin
    Selvom der anvendes genmodificerede organisme til at producere proteiner såsom insulin og vaskeenzymer, er der ingen genmodificerede organismer i det færdige produkt. Under proteinoprensningen fjernes alt andet end det ønskede protein fra opløsningen, og renheden af produktet testes meget grundigt. Se Arbejdstilsynets regler (LINK– se under ”Hvad er GMO?”)

     

    GMO-affald
    GMO-affald må ikke lægges i den almindelige skraldespand, men skal opsamles i særlige beholdere mærket så man kan se at der er GMO i. Både flydende og fast affald skal desinficeres eller autoklaveres, dvs. varmes op til mindst 121°C under højt tryk, før det må behandles som almindeligt affald, hvilket normalt sker på specielle anlæg. Se arbejdstilsynets regler (LINK) – se under ”Affald og spild”.

     

    Musebur i laboratoriet
    Det er bedst at holde alle forsøgsdyr i separate lokaler/dyrestalde, så man ikke risikerer at udvikle forsøgsdyrsallergi. Dyrene holdes derfor normalt ikke i de laboratorier, hvor man udfører andre slags forsøg.

     

    Test af lægemidler i dyr

    Når der produceres lægemidler til mennesker, er man nødt til at være helt sikker på at de ikke har uventede bivirkninger, og hvor meget af lægemidlet der er nødvendigt for at få den ønskede effekt. Man kan ikke få svar på dette ved kun at teste stoffet i cellekulturer. Derfor er det nødvendigt at teste al ny medicin i dyr, før det prøves på mennesker. For at kunne arbejde med dyr skal man leve op til lovens krav om uddannelse (https://www.retsinformation.dk/Forms/R0710.aspx?id=1138 og  https://www.retsinformation.dk/Forms/R0710.aspx?id=2629) og have tilladelse til det hos Dyreforsøgstilsynet, som hører under justitsministeriet. Samtidig skal loven om dyreforsøg overholdes (https://www.retsinformation.dk/forms/r0710.aspx?id=2862), der bl.a. skal sikrer at dyrene ikke har smerter eller er angste undervejs, og at forsøget ikke lige så godt kunne udføres i cellekulturer.

    Der er også specifikke lovkrav for at arbejde med eller fremstille genetisk modificerede dyr (https://www.retsinformation.dk/Forms/R0710.aspx?id=2116).

     

    Vaskemaskine

    Normalt ville man sætte vaskemaskinen i et andet rum for at undgå at den kommer i kontakt med genmodificerede organismer (GMO). Det færdige proteinprodukt indeholder som beskrevet ingen genmodificerede organismer, og det er derfor ikke nødvendigt at have en genteknologisk klassificeret laboratorium til at teste produktet. Se Arbejdstilsynets regler (LINK– se under ”Hvad er GMO?”).

  • Studerende-info

    Velkommen til dette undervisningsprojekt om moderne genteknologi!

    Projektet, du skal til at bruge, er et web-baseret forløb udviklet af to bioteknologistuderende på Danmarks Tekniske Universitet (DTU).

     

    Hvorfor genteknologi?

    Genteknologi har haft en stor betydning for den biologiske forskning, fordi den gør det muligt at ændre i generne, så deres virkning kan afsløres og måske forbedres.

    Det er nu over ti år siden, det første får blev klonet, og genetisk modificerede planter er i dag virkelighed på større dele af verdens marker. Laboratorier har frembragt mus og fisk, der kan lyse grønt og bakterier med bananlugt i den kreative syntetiske biologi!

    Nogle anvendelser af genteknologi rejser etiske spørgsmål, der skal besvares, men til trods for det er genteknologien kommet for at blive, og dens mange muligheder er i stadig udvikling.

    I dette materiale skal vi beskæftige os særligt med mikroorganismer, som er udviklet til blive hele cellefabrikker. Her udnyttes det til fx medicinsk eller miljømæssig fordel, at biologiens egne celler er de ubestridte eksperter i at producere proteiner og andre stoffer, som vi ved at indsætte de rette gener får dem til lave i store mængder.

    Disse gensplejsninger får du selv mulighed for at prøve kræfter med i det særlige virtuelle laboratorium, som hører til materialet. Her får du til opgave at designe din egen celle genteknologisk, og gennemgår de realistiske trin fra design af generne på computeren med de nødvendige sekvenser, og videre i laboratoriet for at gensplejse dem. Og hvis det gik godt, prøver du til sidst at dyrke cellerne i en fermentor og teste om et evt. oprenset produkt virker efter hensigten!

    Materialet er bygget op, så du først får et solidt indblik i DNA og gener, samt design af cellefabrikker og den i industrien så vigtige optimering, der bygger på at forstå cellernes genregulering. Hvad genteknologien kan, vil du lære imens. Undervejs henvises der til uddybende beskrivelse af de genteknologiske værktøjer, så det samtidig giver mening, hvor man skal kunne dem.

    Hvis du virkelig vil have en smag på, hvordan genteknologien bruges i den virkelige verden, skal du læse de tilhørende cases.

    Vi håber, I vil få glæde af materialet

    N.B. Figurerne i materialet er i øjeblikket kun skitser, da vi først sætter en grafiker på opgaven, når vi ved præcis hvilke figurer er lærerige for jer! Bær derfor venligst over med de nogle gange lidt grimme figurer.

  • Lærerinfo

    Materialet er opbygget med en teoretisk indføring i gener og genteknologi med fokus på rekombinant produktion i cellefabrikker. Cellefabrikker kan inspirere og fascinere eleverne på grund af deres store nytteværdi for medicin og grøn produktion – et anvendelsesfelt hvor danske virksomheder er særlig godt med.

    Særligt motiverende for eleverne er det virtuelle laboratorium og muligheden for selv at gennemføre hele designforløbet af en cellefabrik, efter teorien er forstået. Fokusset gør det endvidere muligt at introducere principperne i genregulering ud fra en stammeoptimerings-synsvinkel i artiklen Genetisk tuning.

     

    Arbejdet med materialet

    Arbejdet i undervisningen kan stykkes sammen på mange måder, men grundlæggende er de tre første teori-artikler. Artikel 1 kan dog springes over, hvis DNA og gener er godt kendt.
    Alle de relevante genteknologiske værktøjer er beskrevet i en særlig sektion, hvortil der henvises direkte, når metoden bruges i det øvrige materiale.

    Til materialet er desuden udviklet fem case stories om konkret anvendelse af teori og metoder introduceret i materialet, og de indeholder også arbejdsspørgsmål. Materialet har således stor mulighed for at blive brugt på kryds og tværs efter klassens niveau og mål. De to cases om genteknologi til udvikling af hhv. enzymer og hurtigtvirkende insulin er oplagte til afsæt i det virtuelle laboratorium, hvor teorien om cellefabrikker kan afprøves i praksis af eleverne.

    Artiklerne om Syntetisk biologi og Etik og lovgivning kan fx bruges til perspektiv.
    Sproget er holdt i en tone, som taler i hovedhøjde til gymnasieeleverne uden at give afkald på præcision og vigtige faglige udtryk. En filosofi for materialet er, at de studerende værdsætter viden, som de kan se og forstå også finder en praktisk anvendelse.

    Vi håber, at I vil få glæde af materialet.

     

    Bag om det skriftlige materiale

    Det skriftlige materiale er skrevet af Peter Rugbjerg, civilingeniørstuderende ved DTU Systembiologi. Projektet er udarbejdet i perioden januar 2010 til juli 2011.Grafik for materialet er udviklet af Sandra Myrtue Hansen, hvor andet ikke er nævnt.

    En række gymnasielærere skal have stor tak for at hjælpe med test af materialet undervejs. Tak til Anne-Mette Vire (Risskov Gym.), Camilla Voigt Zacho (Roskilde Gym.), Jane Sørensen Brenøe (Sorø Akademi) og Peter Teglhøj (Svendborg Gym.) for engageret hjælp med dette!

    Materialet er støttet økonomisk som en del af Det Virtuelle Laboratorium.

  • Referenceliste

    Nedenfor fremgår de væsentligste bøger og øvrige publikationer, som dette materiale er baseret på og som kan inspirere videre.

     

    Væsentlige referencer for teori-materialet og inspiration til videre læsning

    Bemærk, at de fleste materialer er på engelsk og som udgangspunkt ikke frit tilgængelige på internettet.

    1. Hvad er DNA og gener?

    Grundlæggende lærebøger i molekylær biologi:

    • Life: The Science of Biology. 2006. Sadava, D; Heller, HC; Orians, GH; Purves, WK; Hillis, DM. 8. udgave. W. H. Freeman
    • Molecular Cell Biology. 2007. Lodish, H; Berk, A; Kaiser, CA; Krieger, M; Scott, MP; Bretscher, A; Ploegh, H; Matsudaira, P. 6. udgave. W. H. Freeman
    • Molecular Genetics of Bacteria. 2007. Snyder, L; Champness, W. 3. udgave. ASM Press

    2. Cellefabrikker – Den bioteknologiske rute fra DNA til protein

    Grundlæggende lærebøger som før, samt specifikt:

    • Principles of Fermentation Technology. 1999. Stanbury, PF; Hall, S; Whitaker, 2. udgave. A. Butterworth-Heinemann. Forklaring af fermentering og oprensing.
    • Wurm, FM. 2004. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nature biotechnology, vol:22,iss:11.pp 1393-1398.
    • Nielsen, J. 2001. Metabolic engineering. Applied microbiology and biotechnology. vol:55, iss:3,pp:263-283. Introduktion til forbedringsmulighederne af celler med metabolic engineering. 
    • Life: The Science of Biology. 2006. Sadava, D; Heller, HC; Orians, GH; Purves, WK; Hillis, DM. 8. udgave. W. H. Freeman. Chapter 14?
    • Man tager et gen…, 1994. Novo Nordisk.
    • Beekwilder, et al. 2006. Production of resveratrol in recombinant microorganisms. Applied and environmental microbiology, vol:72,iss:8,pp:5670-5672.
    • Cleetham, JC et al. 1998. NMR structure of human erythropoietin and a comparison with its receptor bound conformation. Nature structural biology. Vol:5,iss:10,pp:861-866.

    3. Genetisk tuning af cellefabrikker

    • Hannig, G; Makrides, S. 1998. Strategies for optimizing heterologous protein expression in Escherichia coli. Trends in biotechnology. vol:16,iss:2,pp:54-60.
    • Sørensen, HP; Mortensen, KK. 2005. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. Journal of biotechnology. vol:115,iss:2,pp:113-128.
    • Hengen, PN. 1995. Purification of His-Tag fusion proteins from Escherichia coli. Trends in biochemical sciences. vol:20,iss:7,pp:285-286.

    4. Genteknologiske værktøjer

    Grundlæggende lærebog for genteknologiske værktøjer:

    • Molecular Biotechnology – Principles and Applications of Recombinant DNA. 2002. Glick, BR; Pasternak, JJ. 3. udgave. ASM Press
    • Molecular Biotechnology – Principles and Applications of Recombinant DNA. 2009. Glick, BR; Pasternak, JJ; Patten, CL. 4. udgave. ASM Press

    DNA-sekventering:

    • Metzker, ML. 2010. Sequencing technologies – the next generation. Nature reviews genetics, vol:11,iss:1,pp:31-46.

    Syntetisk biologi:

    • Panke, Sven. 2008. Synthetic Biology – Engineering in Biotechnology, ETH Zürich. Særligt anbefalesværdig.
    • Alper, J. 2009. Biotech in the basement. Nature Biotechnology. vol:27,iss:12,pp:1077-1078
    • Focus issue, dec 2009. Synthetic Biology. Nature Biotechnology, vol:27, iss:12, Særligt pp:1091-1111. Link.
    • What Is Life?: Investigating the Nature of Life in the Age of Synthetic Biology. 2008. Regis, Ed. 1. udgave. Farrar, Straus and Giroux. 

    Etik og lovgivning i genteknologi

    • Phillips, T. 2008. Genetically modified organisms (GMOs): Transgenic crops and recombinant DNA technology. Nature Education vol:1,iss:1
    • Uddannelses- og Forskningsministeriet. 2003. Genmodificerede og klonede dyr. Kapitel 3. Version 1.0 Link.
    • Ministeriet for Fødevarer, Landbrug og Fiskeri. 02-10-2014. Website om Genetisk Modificerede Organismer (GMO). Link.

    Cases:

    Insekttolerant bomuld

    • Subramanian, A et al. 2010. GM crops and gender issues. Nature biotechnology, vol:28,iss:5,pp:404-406.
    • Damgaard, C et al. 2005. Genmodificerede planter. Danmarks Miljøundersøgelser og forlaget Hovedland. 2. udgave. Link
    • Lu, Y et al. 2010. Mirid Bug Outbreaks in Multiple Crops Correlated with Wide-Scale Adoption of Bt Cotton in China. Science, vol:328,iss:5982,pp:1151-1154
    • Sharma, DC. 2010. Bt cotton has failed admits Monsanto. India Today. Link

    Gylden ris 2.0

    • Paine, JA et al. 2005. Improving the nutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A content. Nature biotechnology, vol:23,iss:4,pp:482-487.
    • Potrykus, I. 2010. Regulation must be revolutionized. Nature, vol:466,iss:7306,pp:561.
    • Meyer, G. 2001. Gylden ris har lang rejse foran sig. Nyt fra Center for bioetik og risikovurdering, KVL. 2. årgang, 3. nr. Link.

    Geden som en moderne medicinfabrik

    • Edmunds, T et al. 1998. Transgenically Produced Human Antithrombin: Structural and Functional Comparison to Human Plasma-Derived Antithrombin. Blood, vol:91,iss:12,pp:4561-4571.
    • Nielsen, RH. 2006. Vejen er banet for nye billige lægemidler produceret af dyr. Ingeniøren, Link
    • Choi, C. 2009. ATryn, on Old MacDonald’s Pharm. Scientific American. Link
  • Ordforklaring

    Liste over vigtige begreber og forklaring af hvad, de betyder.

    Aktiveringsenergi  
    Aktiveringsenergi er et kemisk udtryk for der beskriver hvor hurtigt en reaktion kan forløbe i forhold til bl.a. temperaturen. Jo mindre aktiveringsenergi, jo hurtigere reaktion. Enzymer kan ofte sænke en reaktions aktiveringsenergi.

    Allel  
    En allel af et gen er en bestemt udgave af genet. Mange organismer har to alleler af hvert gen.

    Aminosyre 
    En aminosyre er en særlig kemisk gruppe af stoffer. De 20 biologiske aminosyrer indgår i forskellig kombination i de lange kæder, der udgør et protein. Alle aminosyrer indeholder en amin-gruppe (-NH3) og carboxy-gruppe (-COO-).

    Antibiotikum 
    Et antibiotikum er et stof der virker imod bestemte mikroorganismer, som enten dræbes eller hæmmes i vækst.

    Baseparring 
    Baseparring er den kemiske tiltrækning, der gør, at to DNA-strenge vil parres, hvis der overfor A sidder T, og overfor C sidder G.

    Cellefabrik
    En cellefabrik er en celle der producerer et værdifuldt produkt, oftest som følge af gensplejsning.

    Codon
    Et codon er tre af hinanden følgende nukleotider i et gen. Hvert af de 64 mulige codons koder for en aminosyre, som bliver en del af det protein, som codonets gen koder for. Codons kaldes også tripletter.

    Den genetiske kode 
    Den genetiske kode er oversættelsen af hvilke aminosyrer, som de 64 mulige codons fører til. Se figur 1.3 i 1 Hvad er DNA og gener?

    DNA
    DNA lagrer alle cellers arvemateriale (generne) i lange dobbeltstrenge af nukleotiderne A,T,C og G. Det er rækkefølgen af disse der afgør hvilket protein, genet koder for.

    DNA polymerase
    En enzymtype, der kan kopiere DNA i en proces kaldet replikation.

    Ekspression      
    I biologi er ekspression, når et gen aktiveres og derfor fører til dannelse af mRNA og sidenhen protein.

    Ekspressionsvektor
    En ekspressions-vektor er DNA, der indeholder de hjælpende DNA-elementer (promoter, terminator etc) der skal til for at udtrykke genet i en organisme. Læs meget mere i 3 Genetisk tuning.

    Enzym  
    Enzymer er proteiner, der katalyserer bestemte biokemiske reaktioner og processer, dvs. sørger for at de foregår.

    Fermentering   
    Fermentering er dyrkningen af mikroorganismer i beholdere (fermentorer). Læs mere.

    Gelelektroforese
    Gelelektroforese er en teknik til at adskille forskellig DNA eller protein i en prøve. Læs her.

    Genom
    Et genom er en organismes totale mængde af DNA-sekvens, dvs. alle gener og genregulerende områder m.m.

    Glykosylering
    Proteiner kan blive glykosyleret af cellerne, hvilket er en påhæftning af forskellige slags sukre. Glykosylering kan have betydning for halveringstiden af et medicinsk stof i blodet eller fx give bestemte signaler om proteinet til cellen.

    Halveringstid 
    Halveringstiden er den tid, der skal gå, før koncentrationen af et stof er halveret. Bruges gerne om medicin i blodet.

    Heterozygot     
    En heterozygot organisme har to forskellige alleler af et gen, og den dominante form vil kunne ses af fænotypen (hvordan organismen bliver).

    Homozygot
    En homozygot organisme har to ens alleler af det gen, man taler om. Hvis allelerne er den recessive (vigende) form, vil de ligesom den dominante form kunne ses af fænotypen (hvordan organismen bliver).

    Katalyse  
    Katalyse af en reaktion vil sige at øge dens mulighed for at forløbe (gerne markant). Katalysen foretages af en katalysator (fx et enzym) som ikke forbruges i reaktionen selv.

    Komplementære nukleotider   
    Nukleotider der passer sammen ved baseparring. Dvs. A-T og C-G.

    Kromosom 
    Kromosomer er lange DNA-strenge. Ved almindelig (mitotisk) celledeling overføres en kopi af hvert kromosom til den nye celle.

    mRNA  
    mRNA (messenger RNA) er en RNA-type. Den dannes ved transkription af de gener, der er aktive, og bruges i translationen til at danne protein.

    Mutation  
    En mutation er en ændring i DNA-sekvensen, som kan opstå til gavn eller ulempe for cellen, fx ved UV-belysning. Celler, der er genetisk forandrede, kaldes mutanter.

    Nukleotid 
    Den kemiske struktur, som DNA- og RNA-strengene bygges op af. Der eksisterer A, T, C og G. I RNA erstattes T af nukleotidet U.

    Protein
    Et protein er kemisk set en lang kæde af aminosyrer, som foldes på en bestemt måde og dermed får en funktion i cellen.

    Rekombinant produktion
    Produktion med gensplejsede organismer.

    Replikation   
    Replikation er en cellebiologisk proces, hvor en DNA-streng kopieres i to. En DNA-dobbeltstreng skilles undervejs i to enkeltstrenge, som hver får påsat de komplementære nukleotider. Resultatet er dermed to dobbeltstrenge.

    Restriktionsenzym         
    Et restriktionsenzym (eller restriktionsendonuklease) er i stand til at skære en DNA-dobbeltstreng over ved en bestemt sekvens.

    Screening 
    Screening er en metode, der kan bruges til at kende særlige genetiske varianter fra de andre.

    Selektion
    Selektion er en metode, hvor man etablerer nogle forhold for organismerne, som gør at de interessante overlever og dermed udvælges. Læs mere.

    Southern blot 
    Southern blotting bruges til at søge efter tilstedeværelsen af en specifik DNA-sekvens i en DNA-prøve ved hjælp af baseparring med en probe. Læs mere.

    Transgen organisme  
    En organisme, der indeholder gener fra en fremmed organisme.

    Transkription 
    Transkription er en proces, hvor aktive gener afskrives fra DNA’et til mRNA, som kan bruges i cellen til translation.

    Translation 
    Translation er en proces, hvor mRNA oversættes til protein i et ribosom. Hver codon (tre nukleotider) oversættes til en aminosyre efter den genetiske kode.

    Udtryk
    Se ekspression