Et gen knock-out ved destruktion af en gensekvens i en metabolisk pathway til undersøgelse af fænotypen.
Den filamentøse svamp Aspergillus aculeatinus har en overflade bestående af mange sporer, som kan falde af, flyve væk og blive til nye svampe. Disse sporer indeholder et pigment, der giver svampen sin mørke farve. Dette pigment produceres ved en metabolisk pathway af flere enzymer, kaldet polyketid-syntaser. Et af disse enzymer i pathwayen kodes af albA-genet, hvormed et knock-out af dette gen med en destruktion af sekvensen burde stoppe produktionen af det færdige pigment. I så fald må svampen miste sin mørke farve.
For at undersøge dette, blev der fundet en PAM-sekvens og en tilhørende 20 nukleotider lang sekvens i albA-genet til genkendelse med Cas9 og sgRNA. Herudfra blev der designet sgRNA, som sammen med Cas9-genet blev indsat i et plasmid designet til svampe. Dette plasmid blev indført i A. aculeatinus ved en midlertidig nedbrydning af deres cellemembran.
En oversigt over forsøgsresultaterne kan ses på figur 12. I figuren kan det tydeligt ses, at der er en fænotypisk forskel på vildtypesvampen og den genmodificerede mutantsvamp. Vildtypen indeholder det mørke pigment, mens mutanten mangler pigmentet, hvormed den er hvid. Tages et nærmere kig på svampenes sporer under et mikroskop, kan det ses at mutanten ikke producerer det sorte pigment i sporerne længere. Sekventering af DNA-sekvenserne for området som Cas9 ramte, viser at der er sket en deletion af 8 basepar i mutanten, hvilket er ensbetydende med en frame-shift mutation. Dette må være grundet en mutationel NHEJ-reparation af det dobbeltstrengsbrud, som Cas9 har forårsaget. Mutationen er en loss-of-function mutation, der har medført et dysfunktionelt enzym, hvilket har stoppet produktionen af mørk pigment. Denne implementering af CRISPR/Cas9 i A. aculeatinus blev udført på DTU Bioengineering, Danmarks Tekniske Universitet.
Figur 12. Et gen knock-out i Aspergillus aculeatinus til undersøgelse af ekspressionen af albA-genet, der udtrykker et enzym, der indgår i en metabolisk pathway, som producerer mørkt pigment. Vildtypen angiver den normale svamp, mens mutanten er blevet udsat for genmodifikation med Cas9. Bemærk farveskiftet, som er resulteret af destruktionen af DNA-sekvensen for albA-genet. Sekventering afslører, at det er en deletion på 8 basepar.
Et gen knock-in ved erstatning af en sekvens, der ændrer proteinfunktion og danner resistente risplanter.
Figur 13. Risplanter sprøjtet med ukrudtsmiddel. Til venstre ses den resistente genmodificerede risplante, og til højre ses vildtype risplanten.
Kilde: “Engineering Herbicide-Resistant Rice Plants through CRISPR/Cas9-Mediated Homologous Recombination of Acetolactate Synthase”, Y. Sun, X. Zhang, C. Wu, Y. He, Y. Ma, H. Hou, X. Guo, W. Du, Y. Zhao, L. Xia, Molecular Plant, 9(4):628-631 (2016).
Planter producerer et enzym kaldet acetolactat-syntase (ALS), der katalyserer det første trin i produktionen af de livsnødvendige aminosyrer valin, leucin, og isoleucin, der bruges til opbygningen af andre proteiner. Ved at inhiberer enzymet, kan man stoppe produktionen, hvilket vil dræbe planten. Dette kan man gøre med en række forskellige ukrudtsfjernere, som binder til enzymet og forhindrer dets funktion. Spreder man disse ukrudtsfjernere over en rismark, vil man dræbe alt ukrudt, men også risplanterne. Dermed ville det være meget brugbart at lave risplanter, der var resistente overfor ukrudtsfjerneren.
Det lykkedes for et kinesisk forskerhold at lave genmodificerede resistente risplanter, ved brug af CRISPR/Cas9 og HDR til at lave et gen knock-in i ALS-genet ved en erstatning af en del af sekvensen. Risplanterne blev tilført et plasmid indeholdende Cas9-genet, en DNA-skabelon, samt to stykker sgRNA. De to stykker sgRNA blev anvendt til at udskære en sekvens midt i ALS-genet, og denne DNA-sekvens blev erstattet med DNA-skabelonen ved HDR. Denne DNA-skabelon var næsten ens med vildtypens sekvens, bortset fra at den indeholdte nogle specifikke mutationer. Disse mutationer medførte, at det producerede acetolactat-syntase ikke var modtageligt for binding af ukrudtsfjerneren, hvormed der ikke kunne ske en inhibering af produktionen af de essentielle aminosyrer. Dermed er der tale om en gain-of-function mutation grundet et gen knock-in.
Denne genmodificering gav levedygtige resistente risplanter, men der blev også set fejlmutationer grundet uhensigtsmæssig reparation af NHEJ. Ved anvendelse af de risplanter der blev modificeret korrekt, ville man kunne plante en rismark af resistente planter. På denne rismark vil man kunne fjerne alt ukrudt med ukrudtsfjerneren, men lade risplanterne trives. På figur 13 kan forsøgsresultaterne ses, hvor det er tydeligt at kun den genmodificerede plante trives trods tilstedeværelsen af ukrudtsfjerner.
