Hvordan måler man en biomarkør?

Del 2 af 4 i forløbet: Biomarkører

I sidste afsnit lærte du om fire forskellige slags biomarkører: Molekylære, radiografiske, histologiske og fysiologiske biomarkører. Inden for hver kategori findes der forskellige undertyper af biomarkører. For eksempel består de molekylære biomarkører af DNA, proteiner, fedtstoffer og mange andre molekyler. Med så stor diversitet i biomarkørerne medfølger der naturligvis også en helt masse forskellige målemetoder. Nogle af målemetoderne kræver avanceret og dyrt udstyr, mens andre af målemetoderne er simple og kan udføres derhjemme. I dette afsnit lærer du om nogle af teknikkerne til at måle på forskellige biomarkører, og til sidst går vi i dybden med de molekylære biomarkører: DNA og proteiner.

Radiografiske biomarkører

De radiografiske biomarkører er parametre, som kan ses på et billede. Der findes mange forskellige apparater, som kan tage billeder af kroppen. Apparaterne kan visualisere forskellige dele af kroppen, alt efter hvad lægerne er interesserede i at undersøge. Et røntgenapparat kan tage billeder af kroppens knogler, men det kan også bruges til kræftundersøgelser f.eks. i lungerne. En CT-scanner virker lidt som et røntgenapparat, men den danner en helt masse tværsnit af kroppen for at få et mere detaljeret og tredimensionelt billede. Der findes også MR scannere, som kan lave billeder af kroppen ved brug af et kraftigt magnetfelt. De bruges ofte i forbindelse med sygdomme i hjernen. Derudover er der ultralydsscannere, som giver direkte transmitterede billeder af, hvad der sker i kroppen lige nu. De bruges for eksempel i forbindelse med graviditet og undersøgelse af fosteret.

Figur 1: Radiografiske biomarkører. De radiografiske biomarkører kan ses på et billede. De kan for eksempel måles med et røntgenapparat, en MR-scanner eller en ultralydsscanner.

Histologiske biomarkører

De histologiske biomarkører er parametre, som kan ses igennem et mikroskop. Det kan være udseendet eller strukturen af celler og væv – også kaldet morfologi. Inden prøverne kan undersøges med et mikroskop, skal de behandles. Det er helt essentielt at farve prøverne, så forskerne tydeligere kan se de strukturer og molekyler, som de leder efter. Prøverne skal også konserveres, så de ikke bliver nedbrudt, men stadig ser ud præcis, som da de blev taget, når de undersøges i mikroskopet. Derudover kan de indkapsles i hård voks, så de kan skæres i meget tynde skiver. Når prøverne er klar til at blive undersøgt, findes der mange typer mikroskoper at vælge imellem. Vi vil ikke komme nærmere ind på de forskellige typer mikroskoper, men hvis du er nysgerrig, kan du lære mere om dem på Biostriben.

Figur 2: Histologiske biomarkører. De histologiske biomarkører ses igennem et mikroskop.

Fysiologiske biomarkører

De fysiologiske biomarkører er parametre, som kan måles uden at skulle tage en prøve ud af kroppen. Mange af de fysiologiske biomarkører kan du selv måle derhjemme. Med et termometer kan du måle din kropstemperatur, og med en blodtryksmåler kan du måle dit blodtryk. Du kan også selv måle din puls ved at holde fingrene på en stor blodåre, der ligger tæt på huden, for eksempel på siden af din hals.

Figur 3: Fysiologiske biomarkører. De fysiologiske biomarkører kan for eksempel måles med et termometer eller en blodtryksmåler. Nogle smart-watches har endda en indbygget pulsmåler, som kan bruges til at måle ens puls.

Molekylære biomarkører

De molekylære biomarkører er parametre, som kan måles i en biologisk prøve. Molekyler er så små, at der skal nogle helt særlige teknikker til at måle dem. I løbet af de seneste årtier er der sket store fremskridt inden for udviklingen af metoder til at måle på DNA, proteiner og andre molekyler. Det har betydet, at forskere og læger i dag kan finde ud af meget mere om de enkelte molekyler i vores krop. I dag er det for eksempel muligt at sekventere DNA hurtigt og billigt. Det har gjort DNA-sekventering meget mere tilgængelig, og det er derfor lettere for lægerne at bruge, når de undersøger patienter for sygdomme.

De molekylære biomarkører kan måles med forskellige metoder, alt efter hvilken type molekyle det er. Til at undersøge DNA kan forskerne for eksempel bruge PCR, DNA-sekventering og elektroforese. Til at undersøge proteiner kan de også bruge elektroforese og derudover en masse andre metoder som enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), massespektrometri eller forskellige kromatografi-teknikker. I det næste afsnit vil du lære om nogle af teknikkerne til at undersøge DNA og proteiner.

DNA

En organismes komplette sæt DNA kaldes for et genom. Menneskets genom består af omkring 3 milliarder basepar, hvor der samlet findes cirka 20.000 gener. Alle baser i et menneskes DNA kan blive muterede, men langt de fleste mutationer bliver hurtigt reparerede igen. Nogle mutationer bliver dog ikke opdaget af cellens DNA reparations-apparat og får lov til at blive i cellens DNA. De bliver så ført videre, når cellen deler sig. Hvis mutationen opstår i et gen, kan den føre til et muteret protein og potentielt sygdom. Hver enkelt mutation i et gen kan kaldes en biomarkør, hvis den påvirker en biologisk proces.

I store patientstudier har forskere identificeret mutationer, der er involverede i en lang række sygdomme. I studierne har de undersøgt en masse raske personer og en masse syge personer og sammenlignet deres gener. Ved at kigge på hvilke mutationer der er overrepræsenterede blandt de syge, har forskerne identificeret mutationer, som er relaterede til forskellige sygdomme. På figur 4 kan du se fire eksempler på DNA som biomarkør. Nogle sygdomme er genetiske og direkte forårsaget af mutationer i gener, som koder for essentielle proteiner. Disse mutationer er biomarkører, der kan bruges til at diagnosticere sygdomme. Der findes også mutationer, som kan have indflydelse på, hvordan en person bliver påvirket af bestemte lægemidler. Det kan for eksempel være en mutation, som fører til overproduktion af et enzym, der nedbryder lægemidlet. Det kan påvirke, hvilken dosis patienten skal have, og mutationen kan derfor være en respons-biomarkør.

Figur 4: DNA-mutationer som molekylære biomarkører. Mutationer i DNA kan være molekylære biomarkører, hvis de påvirker en biologisk proces. Mutationerne kan for eksempel medføre, at et protein bliver ødelagt. Det kan direkte forårsage sygdom og bruges til diagnosticering, eller øge risikoen for sygdom og bruges til at vurdere disponering. Mutationerne kan også medføre en øget produktion af et enzym involveret i nedbrydningen af et lægemiddel eller helt ødelægge enzymet. Den slags mutationer kan bruges til at vurdere respons og tilpasse medicindosis eller forudsigelse for at vælge behandlingen.

PCR

For at kunne bruge DNA som en biomarkør, skal forskerne eller lægerne sekventere det. Der findes forskellige teknikker til at sekventere DNA, men det første skridt er altid at sikre sig, at der er nok DNA til at analysere det. Til det bruger forskerne en metode, der hedder PCR, som står for Polymerase Chain Reaction. PCR er en metode til at opformere DNA, dvs. at lave en helt masse DNA-kopier ud fra en enkelt DNA-sekvens. Ud over at danne en masse DNA-kopier, kan forskerne vælge præcis hvilken del af DNA’et, de vil kopiere. Det gør de ved at designe specifikke primere til deres PCR. Primere er små DNA-sekvenser, der er komplementære til det DNA, som skal kopieres. Ligesom når DNA-polymerasen kopierer DNA’et inde i en celle, skal DNA-polymerasen i PCR bruge primere for at gå i gang. Med specifikke primere kan forskerne vælge at kopiere et bestemt gen, som de vil undersøge for mutationer. Du kan læse mere om PCR her.

DNA-sekventering

Når forskerne har sikret, at der er nok DNA til at lave DNA-sekventering, har de forskellige sekventeringsmetoder at vælge imellem. Den ældste metode hedder: ”Sanger sekventering”, og den bliver stadig brugt i dag flere steder. Du kan læse om Sanger sekventering i et af vores andre undervisningsmaterialer eller se en video om det på biostriben her og her. Der er dog også kommet nyere og smartere metoder til, kaldet Next Generation Sequencing (NGS), hvor forskerne kan sekventere mange stykker DNA på én gang. Du kan læse om en NGS-metode her.

DNA-sekventering af BRCA-generne

Du har tidligere læst om BRCA-generne, der er molekylære biomarkører for en øget risiko for brystkræft og kræft i æggestokkene. Mutationer i BRCA-generne kan måles med DNA-sekventering. På figur 5 kan du se workflowet for DNA-sekventering af BRCA-generne. Når lægerne skal finde ud af, om en patient har en skadelig mutation i et af BRCA-generne, starter de med at tage en blodprøve (trin 1). Fra de hvide blodlegemer i blodprøven oprenser de patientens DNA, som de skal bruge til deres analyse (trin 2). Når de har oprenset DNA’et, skal de opformere det med PCR (trin 3). I deres PCR vælger de primere, som baseparrer med en DNA-sekvens på hver sin side af BRCA-generne. På den måde opformerer de kun BRCA-generne (trin 4) og ikke en helt masse irrelevant DNA. Det næste skridt er at lave DNA-sekventering af BRCA-generne (trin 5). Det giver lægerne DNA-sekvensen af patientens BRCA-gener (trin 6), som de kan undersøge for mutationer. I store patientstudier har forskere identificeret mange forskellige skadelige mutationer i BRCA-generne. Det er alle disse mutationer, som lægerne leder efter i patientens DNA, når de skal finde ud af, om patienten er disponeret for kræft (trin 7). Til sidst kan lægerne konkludere, om patienten er disponeret for kræft, og om de skal lave nogle forebyggende tiltag for at mindske risikoen for sygdom (trin 8).

Figur 5: Workflowet for DNA-sekventering af BRCA-generne. I trin 1 tager lægen en blodprøve fra patienten, og i trin 2 bliver DNA’et oprenset fra blodprøven. I trin 3 til 4 bliver der lavet millioner af DNA-kopier af BRCA-generne med Polymerase Chain Reaction (PCR), så der er nok DNA til analysen. I trin 5 bliver DNA’et sekventeret, så DNA-sekvensen af patientens BRCA-gener kan identificeres i trin 6. Hver farvet top i DNA-sekvensen svarer til ét af de fire nukleotider i DNA: Adenin, thymin, guanin eller cytosin. I trin 7 bliver patientens BRCA-sekvens undersøgt for kendte mutationer. Til sidst finder patienten ud af, om vedkommende har en skadelig mutation i et af sine BRCA-gener, og om der skal tages nogle forebyggende tiltag i konsultation med lægen.

Proteiner

Proteiner er opbygget af 20 forskellige aminosyrer. Rækkefølgen af aminosyrer i et protein kaldes en proteinsekvens. Alle generne i menneskets DNA koder for proteiner. DNA-sekvenserne oversættes til proteiner i en proces kaldet proteinsyntesen eller det centrale dogme.

Proteinsyntesen kan reguleres på alle trin i produktionen af et protein. Både transskriptionen af DNA til mRNA og translationen af mRNA til protein kan reguleres. Derudover kan selve proteinerne reguleres ved at sætte små kemiske grupper fast på dem, som ændrer deres funktion eller øger nedbrydningen af dem. I mange sygdomme er de processer, som regulerer proteinsyntesen, påvirkede. Det kan betyde, at koncentrationen af proteinet er forskellig i raske og syge mennesker. Forskere og læger kan måle på koncentrationen af bestemte proteiner for at diagnosticere sygdomme, vurdere sikkerheden af et lægemiddel eller med mange andre formål.

Gelelektroforese

For at måle koncentrationen af et bestemt protein i en biologisk prøve er det første skridt at adskille det fra alle de andre proteiner i prøven. Det kan forskerne gøre ved hjælp af mange forskellige metoder. Én af de metoder er gelelektroforese, som er en teknik, der bruger strøm til at adskille proteiner i en prøve. Gelelektroforese kan bruges til at adskille proteiner efter deres længde. Metoden er ikke så god til at bestemme koncentrationen af et protein. Den er bedre til at se, om proteinet er til stede i prøven eller ej. Det er muligt at oprense proteinet fra gelen, når det er adskilt fra alle de andre proteiner, men det er en lidt langsommelig proces.

Kromatografi

En anden metode til at adskille proteiner, eller andre molekyler, er kromatografi. En overordnet form for kromatografi er søjlekromatografi, hvor en opløsning med en prøve tilføres en søjle. På figur 6 kan du se en tegning af, hvordan søjlekromatografi fungerer. Opløsningen kaldes den mobile fase, og søjlens materiale kaldes den stationære fase. Molekylerne i prøven vil binde sig med forskellig styrke til den stationære fase, alt efter hvilke molekyler det er, og hvilket materiale søjlen er lavet af. En ny opløsning, som kaldes en eluent, tilføres søjlen og eluerer (vasker) molekylerne ud af søjlen. De molekyler, som binder svagest til den stationære fase, eluerer først, og dem, som binder stærkest til den stationære fase, eluerer til sidst. Ved at opsamle den eluerede væske på bestemte tidspunkter kan forskere isolere det protein, som de er interesseret i. De kan også sammenkoble søjlen direkte med en detektor og måle proteinerne, efterhånden som de eluerer.

Figur 6: Søjlekromatografi. Søjlekromatografi er en metode til at adskille molekyler i en prøve, alt efter hvor godt de binder sig til søjlen. Metoden kan for eksempel bruges til at adskille proteiner. Søjlematerialet kaldes den stationære fase, og opløsningen med proteinerne kaldes den mobile fase. Når en eluent tilføres til søjlen, kan proteinerne elueres (vaskes ud). De proteiner, som binder sig svagest til søjlen, eluerer først (protein A), og de proteiner, som binder sig stærkest til søjlen, eluerer til sidst (protein B).

HPLC

I almindelig søjlekromatografi er det tyngdekraften, som trækker opløsningerne igennem søjlen. Det er dog ikke altid nok. I nogle former for søjlekromatografi er søjlematerialet pakket så tæt sammen, at tyngdekraften ikke er stærk nok til at trække opløsningerne igennem søjlen. I det tilfælde kan det være nødvendigt at bruge en pumpe til at presse opløsningerne igennem. I High Performance Liquid Chromatography (HPLC) bruges en pumpe til at skabe et højt tryk, som skubber opløsningen igennem søjlen. I HPLC består søjlematerialet af meget små og tætpakkede partikler. De små partikler i søjlen medfører, at teknikken er meget bedre til at adskille molekyler sammenlignet med almindelig søjlekromatografi. Det er særligt brugbart, hvis molekylerne i en prøve minder meget om hinanden. På figur 7 kan du se en tegning af, hvordan HPLC fungerer.

Figur 7: High Performance Liquid Chromatography (HPLC). En prøve med forskellige molekyler sættes ind i HPLC-maskinen. Molekylerne binder sig til HPLC-søjlen, den stationære fase, med forskellig styrke. En eluent pumpes igennem søjlen under højt tryk for at eluere (vaske) molekylerne ud. De molekyler, som binder svagest til søjlen, eluerer først (gul), mens de molekyler, som binder stærkest til søjlen, eluerer til sidst (rød). En detektor er sammenkoblet med HPLC-søjlen og måler molekylerne, efterhånden som de eluerer. Ud fra målingerne danner computeren et HPLC-kromatogram. Et kromatogram er et plot, hvor mængden af molekyler vises som funktion af tiden. På HPLC-kromatogrammet ses molekylerne i prøven som separate toppe.

Hæmoglobin A1c

Du har tidligere læst om hæmoglobin A1c, der er en biomarkør, som kan bruges til at diagnosticere diabetes. Koncentrationen af hæmoglobin A1c kan måles med forskellige metoder, hvor en af dem er HPLC. På figur 8 kan du se workflowet for måling af hæmoglobin A1c med HPLC. Når lægerne har mistanke om, at en patient har diabetes, tager de først en blodprøve fra patienten (trin 1). I dag findes der så avancerede HPLC-maskiner, at lægerne kan sætte blodprøven direkte ind i maskinen, som analyserer prøven automatisk (trin 2). HPLC-maskinen danner et kromatogram, hvor de forskellige typer hæmoglobin ses som hver sin top (trin 3). Arealet under hver top repræsenterer koncentrationen af hver enkelt type hæmoglobin i prøven. Ud fra de to arealer kan lægerne regne forholdet mellem koncentrationen af hæmoglobin A1c og almindeligt hæmoglobin A ud: . Hvis forholdet mellem de to typer hæmoglobin er større end 48 mmol/mol, kan patienten diagnosticeres med diabetes.

Figur 8: Workflowet for måling af hæmoglobin A1c med High Performance Liquid Chromatography (HPLC). I trin 1 tager lægen en blodprøve fra patienten, som i trin 2 indsættes i HPLC-maskinen. I trin 3 danner maskinen et kromatogram, hvor forskellige typer hæmoglobin ses som hver sin top. Forholdet mellem koncentrationen af hæmoglobin A1c (HbA1c) og hæmoglobin A (HbA) i blodet, , er en indikation på, om en patient har diabetes. Koncentrationen af hæmoglobin A1c kan aflæses ud fra arealet under HbA1c-toppen på kromatogrammet (blå). Koncentrationen af hæmoglobin A kan ligeledes aflæses ud fra arealet under HbA-toppen på kromatogrammet (lyserød). Hvis forholdet mellem de to typer hæmoglobin er større end 48 mmol/mol, kan patienten diagnosticeres med diabetes i trin 4.

SARS-CoV-2 antigener

En tredje molekylær biomarkør, som du nok har hørt om, er antigener fra SARS-CoV-2, der er virussen bag Covid-19. Under Covid-19 pandemien er der blevet brugt over 50 millioner kviktests i Danmark. Alle disse kviktests måler på proteiner, også kaldet antigener, fra SARS-CoV-2. Antigenerne er diagnostiske molekylære biomarkører, der kan bruges til at diagnosticere Covid-19 med en kviktest. Kviktests er baserede på en særlig form for enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). ELISA-metoden består i at lave en slags molekylær sandwich, hvor antistoffer er brødet, og antigenet er pålægget i midten. I ELISA er der bundet et enzym til det øverste antistof i sandwichen. Dét enzym kan katalysere en farvereaktion. Ved at måle på farvereaktionen kan forskerne bestemme koncentrationen af protein i prøven.

Covid-19 kviktest

I en Covid-19 kviktest er der ikke bundet noget enzym til antistoffet, men en farvemarkør i stedet for. Det er farvemarkøren, som danner den røde linje på kviktesten. På figur 9 kan du se, hvordan en Covid-19 kviktest fungerer. Først tilsættes en prøve til prøvebrønden (trin 1), og væsken bliver trukket igennem testkassetten ved hjælp af kapillæreffekten. Hvis patienten har Covid-19, indeholder prøven antigener fra SARS-CoV-2. Når væsken bliver trukket igennem testkassetten, vil antigenerne i prøven støde på forskellige antistoffer fra testkassetten. Først støder antigener fra prøven på antistoffer i bindingsfeltet (trin 2). I bindingsfeltet er der to slags antistoffer: Kontrol-antistoffer og anti-SARS-CoV-2 antistoffer, som binder specifikt til antigener fra SARS-CoV-2. Når antistofferne binder til antigenerne, danner de et kompleks. Kontrol-antistofferne og antistof-antigen komplekset bliver trukket videre i testkassetten sammen med væsken.

Efter lidt tid når væsken til testlinjen, hvor der er bundet nogle flere anti-SARS-CoV-2 antistoffer fast (trin 3). Antistof-antigen komplekset kan binde sig til antistofferne i testlinjen og danne den ”sandwich”, som ELISA er baseret på. Farvemarkøren fra anti-SARS-CoV-2 antistofferne danner en rød streg i testlinjen og giver et positivt resultat. Væsken med kontrol-antistoffer bliver trukket videre i testkassetten og når til sidst til kontrollinjen (trin 4). I kontrollinjen er der bundet nogle flere kontrol-antistoffer, som kan binde til de andre kontrol-antistoffer, der er blevet trukket med af væsken. Hermed dannes der også en rød streg i kontrollinjen.

Hvis Covid-19 testen er negativ, bliver der ikke dannet noget antistof-antigen kompleks i bindingsfeltet. Anti-SARS-CoV-2 antistofferne vil derfor bevæge sig videre over testlinjen uden at binde sig fast. Det er derfor, der kun er én rød streg på en negativ Covid-19 kviktest.

Figur 9: Covid-19 kviktest. En Covid-19 kviktest er en særlig form for ELISA, hvor specifikke antistoffer binder sig til antigener fra SARS-CoV-2. For at undersøge om en person har Covid-19 tages en prøve, fx ved podning af næsen, som tilføres til prøvebrønden (trin 1). Antistoffer med farvemarkører blander sig med antigener fra prøven i bindingsfeltet (trin 2). Væsken bliver derefter trukket igennem resten af testkassetten. Væsken når først testlinjen, hvor antistof-antigen komplekset med SARS-CoV-2 antigener binder sig fast (trin 3). Herved dannes en rød streg i testlinjen. Derefter når væsken kontrollinjen, hvor kontrol-antistofferne binder sig fast (trin 4). Herved dannes endnu en rød streg.

Video – De sjældne genetiske sygdomme

I anden video fortæller professor og overlæge Allan Lund om den sjældne genetiske sygdom MCADD, som er en af de sygdomme, der undersøges for i screeningsprogrammet af nyfødte. Vi møder også Sofie, der lider af MCADD, men lever et normalt lav, fordi sygdommen blev opdaget tidligt. Derudover gør lektor Rikke Jentoft Olsen og Ph.d. Signe Mosegaard Nielsen os klogere på, hvordan lægerne finder frem til patienterne og prøver at forstå, hvad der forårsager sygdommene. Til det undersøger de både metabolitter og DNA med teknikker som for eksempel massespektrometri og exon-sekventering.

Quiz

Opgaver

Brug hvad du har lært i opgaverne her.