Denne øvelse arbejder med Virtual Ribosome, UniProt, PDB og Pymol.

Denne øvelse arbejder med UniProt, PDB, Pymol og FigTree. 

I. UniProt

Formålet med denne øvelse er at lære at søge efter og gøre sig bekendt med proteiner ud fra den information, der er tilgængelig gennem UniProt. Dette gøres ved at benyttefritekstsøgekriterier eller accession-numre og derefter undersøge UniProt-siderne for de proteiner, der blev fundet.

a)

Benyt den generelle guide til søgning i UniProt til at søge efter de ønskede proteiner. Du kan vælge enten at have to UniProt-sider åbne i hver sit vindue og foretage de to søgninger samtidig, eller du kan lave del 2.A.a og del 2.A.b for først myostatin og derefter gentage dem for follistatin.

Du skal søge efter:

1. Myostatin, der skal komme fra mennesker.
2. Follistatin, der skal komme fra mennesker.

NB! Husk at proteiner ofte har både et populært navn (f.eks. myostatin) og et videnskabeligt navn (f.eks. GFD8 for myostatin).
Du kan gå til UniProt-databasen ved at klikke her. Husk eventuelt at åbne to vinduer, da du skal lave to søgninger.

1. Hvad er accession-nummeret for de to proteiner?

b)

Gå til de to proteiners UniProt-side og svar på nedenstående spørgsmål. Dette skal du gøre for at få et overblik over UniProt-siderne samt for at finde ud af, hvilke informationer man kan få om proteiner gennem UniProt.
De to første spørgsmål kan besvares ved at se øverst på proteinernes UniProt-side.

2. Hvad er proteinernes anbefalede navn (eng. recommended name) og deres gennavn (navnet på det gen der koder for proteinet)? 
3. Hvor lange er sekvenserne i aminosyrer (fork. AA)?
4. Gå til afsnittet “General annotation (Comments)”.
   Hvad er deres funktion og subcellulære lokationer? Follistatin har et bindingsdomæne specifikt for proteiner fra TGF. Hvilken proteinfamilie tilhører myostatin? Peger dette i retning af interaktion mellem follistatin myostatin?
5. Hvad ville der ske, hvis der kun var myostatin i kroppen? Hvad vil der ske, hvis der både er myostatin og follistatin?
6. Gå til afsnittet “Sequence annotation (Features)”.
   Follistatin binder som nævnt til proteiner fra TGF-β-familien. Hvad hedder det bindende domæne på proteinsekvensen for follistatin, og på hvilke positioner kan det findes?
   NB! Se afsnittet Molecule processing under Sequence Annotation.

II. PDB

Formålet med denne øvelse er at lære at finde relevant information om et protein gennem dets PDB-side, så de relevante dele kan observeres gennem tredimensionel visualisering i PyMol.

a)

Gå til PDB databasen og søg efter PDB-siden med id 3HH2.

1. Hvilke molekyler kan man se i PDB-id’et?
2. Hvor mange kæder indeholder id’et, og hvor mange af disse er identiske? Hvad er navnet på dem (A, B, C…)? Hvad koder de for (myostatin, follistatin…)?
   NB! Dette kan findes under Sequence-fanen.
3. Hvor mange aminosyrer indeholder hver af kæderne, og hvilken på position i kæden findes henholdsvis den første og den sidste aminosyre? Stemmer dette overens med længden af de færdige proteiner, som du fandt i 2.A.6 (109AA for myostatin og 315AA for follistatin)?
   NB! Dette kan også ses vises gennem Sequence-fanen.

Viden omkring hvilke kæder PDB-id’et indeholder, hvad disse koder for og hvilke dele af selve aminosyresekvensen id’et indeholder, kan benyttes i PyMol. Denne viden kan bruges til at undersøge proteinerne tredimensionelt, markere kæderne og interessante aminosyrer eller observere interaktioner, når PDB id’et indeholder mere end et protein.

III. PyMol

Formålet med øvelsen er at lære at benytte PyMol til tredimensionel visualisering af proteiner samt at markere relevante kæder og dermed præsentere proteiner på en overskuelig måde.

a)

Åben PyMol og hent aktin-DNAase I-komplekset med PDB-id 1ATN. Benyt herefter den generelle guide til PyMol og kommandosiden for at lære PyMol og relevante kommandoer at kende så du kan gøre følgende:

1. Vis alle molekylerne i tegningstruktur.
   NB! Det anbefales først at gemme (hide) alt og derefter benytte vis (show).
2. Farv de fire forskellige kæder med hver deres farve (kæde A+B en nuance f.eks blålige og kæde C+D en anden f.eks. rødlige). 
3. Visualiser TB-domænet (TGF-β-familiens bindingsdomæne) på follistatin-molekylet (kæde C og D). Det skal vises med både sidekæde og separat farve. Via deløvelse 2.a fandt du ud af, hvor TB-bindingsdomænet på follistatin-molekylet sidder. Hvis ikke denne øvelse er udført, så udgør dette domæne aminosyrerne i intevallet 30-103 på det ikke-færdige protein og dermed aminosyrerne 1-74 på det færdige.
   NB! Vælg først aminosyrerne, vis sidekæder og farv dem til slut.
4. Visualiser kun én myostatin- og én follistatin-kæde, fx kæde A og C. Med en generel viden om proteininteraktioner, vil du så antage, at det er det korrekte domæne, der på follistatininteragerer med myostatin?
   NB! Vurderingen kan foretages ved at benytte hide og derefter den kæde man ikke vil se.
5. Udforsk selv PyMol og de forskellige måder, som molekylerne kan vises på. Eksempelvis kan baggrundsfarven ændres, skyggerne kan justeres, måderne og meget andet.

IV. FigTree

Formålet med øvelsen er at blive bekendt med FigTree og at kunne benytte programmet til at visualisere et evolutionært slægtskab mellem forskellige organismer.

a)

Hent filen myostatin_alignment.ph her. Filen, der er lavet ved sekvensalignments (læs mere her) i programmet ClustalX, og det er en træ-fil af formaten Newick. Newick formatet bruges til træ-filer, og i formatet bliver det evolutionære slægtskab mellem træets arter angivet som distancen mellem arterne.

Marker hele teksten i myostatin_alignment.ph og kopier den over i en teksteditor som f.eks. Notepad på Windows computere eller TextEdit på Apple computere. Gem filen som en almindelig tekstfil som myostatin_alignment.ph. Det er vigtigt, at filen ender på .ph, da dette specificerer, at filen er i et format kaldet phylip. Denne type fil bruges som input i programmet FigTree.

Åbn FigTree og åbn derefter myostatin_alignment.ph i programmet. Svar herefter på følgende spørgsmål:

1. Er der en overordnet tendens til en gruppering (dannelse af clades) af de forskellige organismer?
2. Hvilken organisme adskiller sig mest fra de andre. Se her både på grenlængden, og på hvilken der intuitivt set (på baggrund af din viden om organismerne) adskiller sig mest?

b)

For at kunne danne sig et overblik over et kronologisk slægtskab kan man lave en rod på træet. Roden laves ved at specificere ydergruppen (eng. outgroup), som er den organisme, der først divergerede væk fra de andre arter, som samlet kan betegnes som ingroup. Således kan der dannes en evolutionær tidshorisont.

3. Hvilken organisme vil du vælge som ydergruppe og hvorfor?

Lav nu træet med rod, dvs. lav en rod således at ydergruppen kommer tættest på roden og dermed længst væk fra de andre arter. Benyt den generelle guide til FigTree for at se, hvorledes det gøres.

4. Er der sket nogle ændringer i de observerede grupperinger fra spørgsmål 1? Hvorfor/hvorfor ikke? 
5. Stemmer grupperingerne overens med din logiske viden omkring arterne og det slægtskab omkring dem, som du kender til?
   NB! Benyt eventuelt funktionen Rotate til at vende grenene. Det ændrer ikke på selve slægtskabet, men kun på visualiseringen af træet.

Hvis der er tid, kan træet sammenlignes med et træ lavet fra den taxonomiske database hos NCBI. Hent først listen med de arter, der indgår i træet her. Gem den i en tekstfil på din computer som myostatin_arter. Gå herefter til den taxoniske database ved at klikke her.

Benyt filen myostatin_arter i choose file og vælg derefter choose subset. Boksen animals tjekkes af, og choose vælges for at visualisere træet. Arter med fed skrift er dem, der indgår i træet. De latinske navne for arterne skal kendes for at forstå træet. Disse kan ses her.

Denne øvelse arbejder med BLAST, PDB og Pymol.

I. BLAST

Formålet med øvelsen er at blive bekendt og lære om BLAST, at kunne benytte BLAST til at bestemme hvilken superfamilie forskellige makromolekyler hører til, finde ud af hvor mange andre proteiner der ligner din sekvens, samt finde PDB-siden for en given proteinsekvens.

a)

Sekvensen for en tunge kæde fra et IgG-antistof kan hentes her. Marker og kopier proteinsekvensen og gå derefter til BLAST-hjemmesiden. Her skal du benytte proteinsekvensen til at lave en protein-BLAST (BLASTp) mod PDB-databasen (denne vælges under Choose search set). Efterfølgende skal du besvare nedenstående spørgsmål. Som hjælp til udførelslen af BLAST samt fortolkning af resultatet, kan du anvende den generelle guide for BLAST.

1. Hvilken superfamilie hører sekvensen til? 
   NB! Se på Specific Hits og Query sequence.
2. Hvor mange sekvenser er næsten 100 % identiske (har ubrudte røde linjer) med den anvendte IgG-sekvens?

b)

Gå ned til området Descriptions og find de to resultatsekvenser, som du antager, er de bedste match til din IgG sekvens. Du skal tage højde for de elementer, der ifølge BLAST guiden er vigtige for et godt match.

3. Hvad er de to resultatsekvensers accession-nummer, max score, query coverage og e-værdi?
4. Hvorfor valgte du disse to sekevenser som de bedste? Argumenter for dit valg.

Ved at blaste din sekvens har du undersøgt databasen Protein Databankfor proteinsekvenser, der er identiske med den proteinsekvens, du havde til at starte med. Ud fra antallet af resultatsekvenser kunne du se, at der var mange sekvenser, der til en vis grad lignede din sekvens, men ved at se på e-værdier og antal sekvenser med ubrudte røde linjer blev det klart, at kun få sekvenser egentlig matchede din sekvens.
Du skal nu videre til databasen Protein Databank og undersøge en af de to resultatsekvenser, du har fundet gennem BLAST.

II. PDB

Formålet med øvelsen er at lære at finde relevante informationer om et protein gennem dets PDB-side. Målet er at finde information, som kan hjælpe til en optimal visualisering af proteinets tredimensionelle struktur. Den tredimensionelle struktur vil kunne visualiseres i programmet PyMol.

a)

Gå til PDB-databasen og søg efter PDB-siden for det bedste hit fra 3.a. Hvis denne del ikke er lavet, søg da efter siden med PDB id 1IGY (se infoboks til højre). Som hjælp til søgning samt guide til opbygning af proteiners PDB-side kan du bruge den generelle guide til PDB i denne øvelse. Guiden findes her.

1. Hvilken type immunoglobulin koder PDB-id’et for (IgA, IgG etc.), og er det en bestemt subtype (1, 2, 3 etc.)?
   NB! Dette kan findes ved at se på PDB-id’ets navn.
2. Hvor mange kæder har antistoffet, hvor mange af disse er identiske, hvad er navnet på dem (A, B, C …), og hvilken type kæder er det (tunge, lette eller …)? 
   NB! Dette kan findes under Sequence-fanen.
3. Hvor mange aminosyrer indeholder hver af kæderne, og hvilke domæner er de delt op i (konstante, variable eller …)?
   NB! For hver kæde skal domæne og den aminosyrerpositioner de dækker noteres, eksempelvis:
   Kæde A: position 1-100 er det variable domæne på den lette kæde, position 101-200 er det konstant domæne på den lette kæde.

Hvis der kigges på længden af den tunge kæde (434 aminosyrer) kan det ses, at længden ikke er den samme som den faktiske længde af kæden (474 aminosyre). Der mangler faktisk 40 aminosyrer. Manglen på aminosyrer kan skyldes fejlkilder forbundet med den eksperimentelle strukturbestemmelse. Fejlen er derfor ikke ensbetydende med, at de 40 aminosyrer mangler i kædens rigtige form. Man skal dog huske, at aminosyrerne mangler, hvis man skal arbejde videre med proteinet i f.eks. PyMol, da man ikke vil kunne visualisere de dele af strukturen, der mangler.

III. PyMol

Formålet med øvelsen er at lære at benytte PyMol til tredimensionel visualisering af proteiner samt markere interessante kæder og dermed præsentere proteiner på en overskuelig måde.

a)

Åbn PyMol og hent strukturen med PDB-id 1IGY. Benyt herefter den generelle guide til PyMol og kommandosiden for at lære PyMol og relevante kommandoer at kende, så du kan gøre følgende:

1. Vis alle molekylerne i tegningsstruktur.
   NB! Det anbefales først at gemme (hide) alt og derefter benytte vis (show) til at vise tegningsstrukturen.
2. Farv de fire forskellige kæder hver deres farve (kæde A + C en nuance f.eks. blålige og kæde B + D en anden f.eks. rødlige).
3. Har antistoffet den rette ”Y”-formede struktur og stemmer placeringen af de tunge og lette kæder overens med den forventede form? 
   NB! Benyt eventuelt figur 1 for at se den ”Y”-formede opbygning af et antistof.
4. I øvelse 3.A.1 blev de to bedste resultater fra BLAST-søgningen fundet. Det ene var det, der visualiseres i PyMol. Antistoffet fra det andet resultat skal hentes ind i det åbne PyMol-vindue (hvis ikke 3.A.1 er lavet, hent da antistoffet med PDB-id 1IGT). Antistoffet hentes til PyMol på samme måde som tidligere, nemlig ved brug af fetch.
   Rediger nu i det nyhentede antistof så det også kun bliver vist i tegningsstruktur.
   NB! Det anbefales at de to antistoffer farves med hver sin farve, dvs. alle kæderne i et antistof farves med den samme farve.
5. Prøv nu at sammenligne (eng. align) de to antistoffer med hinanden, og undersøg hvordan sammenligningen ser ud. Er de to antistoffer af samme type, f.eks. begge IgM? Hvis ja, tilhører de samme subklasse?
6. Udforsk selv PyMol og de forskellige måder antistofferne kan fremstilles på. Eksempelvis kan antistoffernes farve ændres, baggrundsfarven i PyMol-vinduet kan skiftes, skyggerne kan justeres, måderne den sekundærstruktur bliver vist kan ændres og meget andet.

Denne øvelse arbejder med BLAST, UniProt, PDB og Pymol.

I. BLAST

Formålet med øvelsen er at blive bekendt med BLAST og at kunne benytte denne metode til at bestemme en ukendt proteinsekvens, samt bestemme hvilken organisme sekevensen stammer fra.

a)

Hent den ukendte sekvens her. Marker og kopier sekvensen og gå derefter til BLAST-siden. Benyt nu funktionen protein BLAST (BLASTp) til at bestemme, hvilke proteiner der ikke findes i raske dyr. Da både organisme og funktion er ukendte, anbefales det at lave en bred BLAST, dvs. mod alle genomer og mod standarddatabasen for BLAST (dette kaldes non-redundant protein sequences). Du skal derfor ikke ændre noget i opsætningen, men blot kopiere sekvensen ind og starte BLAST-søgningen.

Benyt den generelle guide for BLAST som hjælp til udførelsen samt til fortolkningen af outputtet.

1. Hvilke to superfamilier tilhører proteinsekvensen?
   Er der tale om, at den tilhører én eller flere superfamilier?
2. Hvor lange (ca.) er de to proteiner?
   NB! Tjek dette under Superfamilies i Graphic Summary domænet.
3. Vil du på baggrund af e-værdien (der skal være så lav som mulig) og sekvensdækningen (eng. query coverage, skal være så høj som muligt) antage, at BLAST har fundet de korrekte proteiner, der normalt ikke er til stede i raske dyr? Argumenter for din konklusion.
   NB! Se under Descriptions-afsnittet. De to nederste resultatsekvenser matcher det protein, der er kodet i første del af proteinsekvensen. Resten af resultatsekvenserne giver information om proteinet, der er kodet i den sidste del af proteinsekvensen.

Ved at blaste aminosyresekvensen har du undersøgt alle protein-databaser for at finde ud af, om de indeholder en proteinsekvens, der er identisk med den ukendte sekvens (OBS: en aminosyresekvens er det samme som en proteinsekvens). Bestemmelse af hvilken superfamilie, som sekvensen tilhører, giver en indikation af funktionen af det ukendte protein. Faktisk fandt du ud af, at sekvensen tilhørte to superfamilier, dvs. at den faktisk koder for to forskellige proteiner. Ved at se på e-værdien og sekvensdækningen kunne du desuden  bestemme om BLAST fandt proteinsekvenser, der er identiske med den ukendte sekvens.

Du skal nu videre til databasen UniProt, hvor du kan undersøge de proteinsekvenser, som blev fundet gennem BLAST.

II. UniProt

Formålet med denne øvelse er at lære at søge efter og gøre sig bekendt med proteiner ud fra den information, der er tilgængelig gennem UniProt. Dette gøres ved at benytte almene fritekstsøgekriterier eller accession-numre og derefter undersøge UniProt-siderne for de proteiner, der findes.

a)

I øvelse 4.A analyserede du en ukendt proteinsekvens gennem BLAST, og du fandt to proteiner, som matchede den ukendte sekvens: GFP og P53.
Benyt ny UniProt til at tilegne dig information omkring disse to proteiner. Du kan bruge den generelle guide til søgning i UniProt som hjælp.

Søg først på Green Fluorescent Protein (GFP er en forkortelse for dette) og tryk på det første resultat’s accession-nummer. Herved kommer du ind på proteinets UniProt-side. Besvar nu følgende spørgsmål. Her kan svarene til de tre første spørgsmål findes øverst på UniProt-siden:

1. Hvad er accession-nummeret for det protein, du undersøger?
2. Hvad er gennavnet, og hvilken organisme kommer dette GFP fra?
3. Hvor lang er sekvensen angivet i aminosyrer (fork. AA)?
4. Under sektionen General annotation (Comments) kan man læse, at proteinet lyser grønt lys, når det bliver udsat for ultraviolet lys.
   Hvordan tror du, at man kan udnytte denne evne i et biologisk regi, når man f.eks. laver gensplejsning og dermed mutanter?
5. Læs afsnittet Biotechnological use. Stemmer dette overens med dit svar fra spørgsmål 4?

b)

Gå tilbage til søgesiden i UniProt. Søg nu på P53 og tryk ligesom før på det første resultat’s accession-nummer, så du kommer ind på proteinets UniProt-side. Besvar følgende spørgsmål:

6. Hvad er accession-nummeret for det protein, du undersøger?
7. Hvad er gennavnet, og hvilken organisme kommer dette P53 fra?
8. Hvor lang er sekvensen angivet i AA?
9. Hvad er proteinets funktion? 
   NB! Se under sektionen General annotation (Comments).
10. Hvilke sygdomme tror du, at P53 kan være forbundet med?

III. PDB

Formålet med denne øvelse er, at lære at finde relevant information om et protein gennem dets PDB-side, så de rette dele kan visualiseres  i PyMol.

a)

Gå til Protein Databank (PDB) databasen og søg efter siden med PDB-id 3Q05. Se eventuelt den generelle guide til PDB.

1. Hvilke molekyler kan man se i PDB-komplekset?
2. Hvor mange kæder (subunits) indeholder id’et, og hvor mange af disse er identiske? Hvad er navnet på kæderne (A, B, C osv.), hvilke proteiner/molekyler er de forskellige kæder (f.eks. kæde A er P53, kæde B er DNA …)?
   NB! Dette kan findes under Sequence-fanen.
3. Hvor mange aminosyrer indeholder hver af de kæder, der koder for P53? Stemmer dette overens med længden af de færdige proteiner, som du fandt i 4.B.8 (393AA)?
4. En metal-ion, nærmere betegnet en zink-ion, er bundet til P53 proteinet.
   Ved hvilke fire positioner og aminosyrer er zinkionen bundet til?

En zink-ion, der erbundet til et protein, betegnes også en zink finger (eng.zinc finger, se infoboks). Man kan finde zink fingre i en række DNA-bindende-proteiner, da zink ionen er med til at stabilisere interaktionen mellem DNA og protein.

Viden om de kæder PDB id’et indeholder, hvad disse koder for og hvilke dele af selve aminosyresekvensen id’et reelt set indeholder, kan benyttes i PyMol. Kendskabet kan anvendes til at undersøge proteinerne tredimensionelt, markere kæderne, markere interessante aminosyrer eller observere interaktioner når id’et indeholder mere end ét protein.

IV. PyMol

Formålet med øvelsen er at lære at benytte PyMol til 3D visualisering af proteiner samt markere relevante kæder og dermed præsentere proteiner på en overskuelig måde.

a)

Åbn PyMol og hent P53 i DNA interaktion med PDB-id 3Q05. Benyt herefter den generelle guide til PyMol og kommandosiden for at lære PyMol  og relevante kommandoer at kende, så du kan gøre følgende:

1. Vis alle molekylerne i tegningsstruktur.
   NB! Det anbefales først at gemme (hide) alt og derefter benytte vis (show)
2. Farv de seks forskellige kæder hver deres farve (kæde A, B, C og D én nuance fx rødlige, lad DNA strengene (kæde K og L) være som de er).
3. Visualiser zinkfinger-domænerne på hver af de fire kæder (A, B, C og D). Herved vil du tydeligt kunne se, at der er plads til en ion. Domænerne skal vises med både sidekæde, separat farve og aminosyremærkat. Hvis øvelse 4.c ikke er lavet, er disse positioner 176, 179, 248 og 242.
   NB! Vælg først aminosyrerne, vis sidekæder, farv dem og sæt et mærkat på. Herefter kan der zoomes ind på interaktionen.
4. Hvor på proteinet findes zinkfingeren (ydersiden, indersiden, tæt på DNA-strengen)? Er dette hvad du ville forvente, når du ved, at zinkfingeren er med til at stabilisere protein-DNA interaktionen?
5. Udforsk selv PyMol og de forskellige måder, som molekylerne kan fremstilles på. Eksempelvis kan baggrundsfarven ændres, skyggerne kan justeres, måderne den sekundære struktur bliver vist på kan ændres og meget andet.