Differentiering af stamceller

I denne artikel beskrives, hvilke forskellige typer stamceller der findes, og hvilke egenskaber de har. Det beskrives herefter, hvordan forskerne bruger gensplejsning, virus og selvlysende mus, til at finde frem til de signalproteiner, der kan lave stamceller om til forskellige terapeutiske celler. Til sidst forklares, hvordan forskerne dyrker stamceller og forsøger at differentiere stamceller til terapeutiske celler i laboratoriet.

Forskellige typer stamceller

Stamceller er uspecialiserede celler, der har evnen til at udvikle sig til mange andre celler. Ud over embryonale stamceller, der blev beskrevet i den foregående artikel, findes der voksne stamceller. Hvor embryonale stamceller kan udvikle sig til alle kroppens celler, kan voksne stamceller kun udvikle sig til nogle få nært beslægtede celletyper.

Nedenfor er en beskrivelse af forskellige typer stamceller, opdelt efter hvor stort et antal nye celletyper de har mulighed for at udvikle sig til.

Hvordan virker en stamcelle?

Når en stamcelle deler sig, kan det ske på flere måder. Ved en symmetrisk celledeling deles stamcellen til to nye stamceller. Dette kan gøres i laboratoriet, og det er derfor muligt at lave så mange stamceller, som der ønskes.

Ved en asymmetrisk celledeling dannes både en ny celletype og en stamcelle. Dvs. at en enkel stamcelle har mulighed for at lave uendelig mange nye celler, og stadig selv være bevaret. Den nye celletype, der dannes ved en asymmetrisk celledeling, kan udvikle sig til en fuldt differentieret celle, se figur 18..

Voksne stamceller

Voksne stamceller er multipotente stamceller, der findes i kroppen hos voksne mennesker. Voksne stamceller kan ikke blive til alle kroppens celletyper, men et begrænset antal celletyper. Således kan blodstamceller i knoglemarven differentiere sig til alle typer blodceller, men de kan eksempelvis ikke blive til hjerneceller. Stamcellerne deler sig asymmetrisk, således at stamcellerne bevares, mens der bl.a. dannes nye røde og hvide blodceller. I de fleste organer findes stamceller der sørger for at danne nye celler, når det er nødvendigt.

For at mindske risikoen for kræft, er det vigtigt, at der findes så få stamceller som muligt i kroppen. Derfor er det smart, at det kun er voksne stamceller, og ikke alle celler, der kan danne nye celler til de fleste organer.

Udviklingen bestemmes af hvilke transkriptionsfaktorer, der er aktive

Som beskrevet i den foregående artikel, forsøger forskere, at finde frem til hvilke signalproteiner embryonale stamcelle skal udsættes for, så de kan blive til fuldt differentierede celler, der kan anvendes terapeutisk (f.eks. en betacelle). Man forsøger at udvikle en protokol, dvs. en opskrift på præcis hvor og hvornår bestemte signalproteiner skal tilsættes til stamcellekulturen, for at få dannet de terapeutiske celler. De terapeutiske celler kan herefter bruges til at erstatte de døde eller syge celler i patienter, der dermed bliver helbredt.

Figur 17. Stamceller inddeles efter deres evne til at differentiere sig.

Figur 18. Stamcelledeling. På figuren er illustreret, hvordan en stamcelle kan dele sig symmetrisk og asymmetrisk, samt hvordan cellerne bliver mindre potente (kan blive til færre celler) hver gang, der sker en asymmetrisk deling.

Det første skridt,er at finde ud af hvilke transkriptionsfaktorer, der bliver udtrykt i de umodne celler, som dannes på vejen fra en stamcelle, til den terapeutiske celle. Når disse transkriptionsfaktorer er kendte, kan en masse forskellige signalproteiner ”afprøves” på stamcellerne. Hvis den kendte transkriptionsfaktor udtrykkes, har man fundet det rigtige signalprotein. I det følgende beskrives, hvordan gensplejsning bruges til at afsløre hvilke transkriptionsfaktorer, der findes i cellerne på bestemte stadier i udviklingen.

Ved hjælp af kemiske metoder kan det undersøges, hvilke proteiner og stoffer der er til stede i bestemte celler. Dette kan give en idé om, hvilke transkriptionsfaktorer der er vigtige for differentieringen af cellerne. Da transkriptionsfaktorer er proteiner og dermed laves ud fra mRNA-strenge, kan det også undersøges, hvilke mRNA strenge der findes i en bestemt celle. Derved kan der spores ind på, hvilke transkriptionsfaktorer der kan være vigtige for de rette fosterudvikling. Problemet er, at der findes utrolig mange proteiner og kemiske stoffer i en celle. Kun de allerfærreste proteiner og stoffer har noget med differentieringen at gøre, så det er et meget stort arbejde.

Når det er lykkedes at finde et stof, som forskerne formoder kan være vigtigt for celledifferentieringen, kan der laves en såkaldt knockout-mus. I knockout-musen har man fjernet (knockout’et) det gen, der koder for den formodede transkriptionsfaktor. Herved dannes denne transkriptionsfaktor ikke. Ved at lade det genmodificerede musefoster udvikle sig, kan forskerne se, om der er forskel på et normalt foster og et foster uden det gen, der undersøges. F.eks. vil en mus, som har fået slettet det gen, der koder for transkriptionsfaktoren Neurogenin 3, ikke danne nogen af de hormonproducerende celler, der findes i bugspytkirtlen. På den måde kan det konstateres, at en Neurogenin 3-positiv celle er en umoden celle, der findes på vejen til dannelsen af bl.a. en betacelle.

Figur 19. Signalproteiner og transkriptionsfaktorers virkningsmekanisme. (1) Signalproteiner uden for cellen, reagerer med receptorproteiner på overfladen af bestemte celler. (2) Receptorproteinet bliver herved i stand til at aktivere bestemte transkriptionsfaktorer i cellen. (3) De aktiverede transkriptionsfaktorer kan nu binde til DNAet foran bestemte gener og sørge for, at de bliver aktiveret. (4) Genet transkripteres (5) og translateres til et færdigt protein. Det færdige protein kan f.eks. være enzymer, hormoner (f.eks. insulin) eller nye signalproteiner.

Selvlysende regnbuemus

Metoden med knockout-mus er anvendelig til at konstatere om en bestemt transkriptionsfaktor udtrykkes i en umoden celle. Men det er også vigtigt at vide, hvornår i fosterets udvikling transkriptionsfaktoren dannes. Dette kan også undersøges ved hjælp af genmodificerede mus. I genteknologien bruges ofte et såkaldt grønt fluorescerende protein (GFP) som findes i en bestemt slags vandmand. Dette protein lyser grønt, når det bestråles med UV-lys.

Ved hjælp af gensplejsning er det muligt at indsætte genet for GFP i en stamcelle, på en måde så GFP-proteinet kun bliver dannet samtidig med en bestemt transkriptionsfaktor, f.eks. Neurogenin 3. Når Neurogenin 3 bliver udtrykt i den genmodificerede celle, bliver der derfor også produceret GFP. Ved at bestråle et udviklende muse-embryo med UV-lys, kan det derfor nemt ses, om Neurogenin 3 transkriptionsfaktoren er til stede i cellerne: Cellerne lyser grønt! På den måde kan det konstateres, hvilke celler der udtrykker Neurogenin 3, og på hvilket tidspunkt i udviklingen de gør det.

Figur 20. Udviklende bugspytkirtel i et musefoster. (1) er 9 dage efter ægget er blevet befrugtet, og (4) er 12 dage efter. Transkriptionsfaktoren Neurogenin 3 vises som den røde farve, mens transkriptionsfaktoren Pdx1 vises som den grønne farve. Bemærk, at Neurogenin3 er aktiv i små celleklumper, der bliver til de Langerhanske øer, hvor alle de hormonproducerende celler sidder. Kilde: Jorgensen et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews 28, 685–705 (2007).

Der findes mange forskellige farver fluorescerende proteiner, og de kan alle gensplejses ind i en mus, så musen lyser, når bestemte gener udtrykkes. En mus, der indeholder mange af disse genmodifikationer, kaldes en regnbuemus. Den vil udtrykke flere forskellige farver i cellerne gennem udviklingen af fosteret. På den måde kan det ses, hvilke transkriptionsfaktorer der udtrykkes hvornår. Således opnås en øget forståelse af hvad der sker i fosterudviklingen på bestemte tidspunkter.

Det er, som forklaret tidligere, ved hjælp af disse og andre teknikker lykkedes forskere at finde de transkriptionsfaktorer, der specifikt udtrykkes i umodne forstadier til betaceller (Foxa2, pdx1 og Neurogenin 3).

Figur 23. Bestemte transkriptionsfaktorer karakteriserer forstadier til betaceller. De umodne celler, der findes mellem en stamcelle og en betacelle, er vist. Disse celler kan identificeres efter hvilke transkriptionsfaktorer, der udtrykkes i dem. Den vigtigste og mest markante transkriptionsfaktor der karakteriserer disse celler, er angivet.

Figur 22. GFP bruges meget i forskningen. Billeder af et transgent regnbuemusefoster. Musefosteret udtrykker GFP (grønt) i moderkagen og navlestrengen, mens RFP (rødt) udtrykkes i resten af musen. Totipotente stamceller kan danne både den grønne og den røde del, mens embryonale stamceller kun kan danne den røde del. Billedet er venligst stillet til rådighed af Gloria Kwon.

Hvordan findes signalproteinerne?

Med en detaljeret viden om, hvilke transkriptionsfaktorer der udtrykkes hvornår i udviklingen fra stamcelle til en bestemt fuldt differentieret celle, der kan anvendes terapeutisk, har forskerne nu et meget vigtigt redskab til den videre forskning. Ved f.eks. at gensplejse en stamcelle, så den udtrykker GFP samtidig med transkriptionsfaktoren Foxa2 (der udtrykkes i endodermale celler, se ovenstående figur), kan det hurtigt afgøres, om cellerne udvikler sig i den rigtige retning. Den simpleste, men også mest tidskrævende metode, benytter sig af en såkaldt shotgun screening, hvilket betyder at utrolig mange stoffer testes efter hinanden, uden at forskerne aner, om de virker. En stamcellekultur i laboratoriet tilsættes et væld af forskellige signalproteiner, og i et mikroskop undersøges, om nogle af cellerne lyser grønt, hvilket betyder, at Foxa2 bliver udtrykt, og at der er dermed dannet endodermale celler.

Når et stof bliver identificeret som det rigtige signalprotein, der kan aktivere en vigtig transkriptionsfaktor, er forskerne et skridt videre i arbejdet. De kan nu tilsætte det rigtige første signalprotein og få udtrykt Foxa2. Derefter screenes for nye signalproteiner, der kan aktivere den næste vigtige transkriptionsfaktor, som indikerer at cellen udvikler sig i en bestemt retning. Det er en meget lang proces, og i realiteten er det kun muligt, hvis forskerne har nogle kvalificerede gæt om hvilke stoffer, der kan spille en rolle. Ellers er der mange tusinde stoffer, der forgæves må undersøges. Heldigvis har forskerne metoder til at indsnævre søgefeltet.

En metode til at identificere vigtige signalproteiner er at undersøge de stoffer der er til stede uden for cellen, afsendt af andre celler. Forskerne prøver derfor at finde ud af, hvilke stoffer, som findes uden for netop de umodne celler, som senere differentieres til bestemte terapeutiske celler. Forskerne undersøger også hvilke stoffer, der udskilles af andre celletyper, som ligger i nærheden af de udviklende terapeutiske celler. På den måde får forskerne reduceret antallet af mulige signalproteiner, som de derefter kan teste ved ovenstående metode.

Figur 24. Screening efter signalproteiner. (1) En stamcelle gensplejses, så den udtrykker GFP samtidig med en bestemt transkriptionsfaktor (f.eks. Foxa2) nøjagtig som i animationen ovenfor. (2) De gensplejsede stamceller deler sig symmetrisk, så flere millioner celler kan gemmes i en reagenskolbe. (3) Et muligt signalprotein sættes til nogle af de gensplejsede celler. I langt de fleste tilfælde vil det tilsatte stof ikke føre til, at Foxa2 bliver udtrykt, og dermed kan det ikke være det rigtige signalprotein. Forsøget gentages (4) derfor, indtil et tilsat signalprotein gør, at Foxa2 bliver udtrykt i cellen (5). Når dette sker, dannes der også GFP. Cellerne vil lyse grønt, og signalproteinet kan derved identificeres.

Kan transkriptionsfaktorerne ikke bare tilsættes direkte?

Hele pointen med at tilsætte bestemte signalmolekyler, er at få aktiveret de transkriptionsfaktorer, der udvikler stamcellen til en bestemt terapeutisk celle. Men hvorfor tilsættes disse transkriptionsfaktorer ikke bare direkte til cellerne? Det skyldes, at transkriptionsfaktorer kun virker inde i cellen. Hvis de befinder sig uden for cellen, er der ikke nogen receptor eller mulighed for at komme ind i cellen. Selv hvis det alligevel lykkes transkriptionsfaktoren at komme ind i cellen, er sandsynligheden utrolig lille for, at den finder vej til DNAet i cellekernen.

Flere forskere prøver derfor at finde en metode, så de kan binde transkriptionsfaktorerne til bestemte transportstoffer, der sørger for at transportere dem ind i cellekernen. Det er ikke lykkedes endnu, men hvis det gør, vil det give utrolige muligheder for stamcelleforskningen og mange andre forskningsområder. Med denne teknik til rådighed vil det være muligt at aktivere de rigtige gener med transkriptionsfaktorer, uden at behøve at kende noget til signalproteiner.

Inden for udviklingsbiologien forskes meget i at få kendskab til de signalproteiner, der aktiverer bestemte transkriptionsfaktorer i et udviklende foster. Hvis denne viden overføres til laboratoriet, kan stamceller omdannes til bestemte terapeutiske celler, der kan helbrede patienter for mange forskellige sygdomme.

Figur 21. Grønt Fluorescerende Protein. Et musefoster og en voksen mus, gensplejset med GFP. Gensplejsningen er lavet, så GFP udtrykkes i alle musens celler. Det øverste billede er venligst stillet til rådighed af Dr Tom Pratt og er fra artiklen Pratt et al., Developmental Biology vol. 228, p 19-28 (2000) og det nederste billede er venligst stillet til rådighed af Kat Hadjantonakis.