RNA Isolering

Denne artikel vil gennemgå RNA-isolering, der er et altafgørende trin, for kvaliteten af en mikrochipanalyse.

 

Hvorfor isoleres RNA og ikke DNA?

Den store forskel mellem fx en kræftcelle og en almindelig celle ligger ikke i genernes DNA, men derimod i hvilke gener, der transskriberes eller ikke transskriberes – og i hvor ofte de transskriberes. Ved at analysere de mRNA-molekyler, en celle indeholder, kan det afgøres, hvilke gener der bliver transskriberet,  og i hvor stort omfang det sker. Når man skal skaffe sig mRNA, vil man oftest benytte celler fra blodet eller celler fra et specifikt væv, hvorfra man udtrækker mRNA vha. specielle teknikker. For at få et vellykket mikrochipeksperiment er det meget vigtigt, at kvaliteten af RNA er god. Med god kvalitet menes, at RNA’et ikke er nedbrudt under isoleringen. Nedbrudt RNA vil i forsøgsresultaterne give et meget højt baggrundssignal og lave værdier af intakt RNA, hvilket helt kan ødelægge den efterfølgende dataanalyse.

Hvordan isoleres RNA?

Kroppens RNA findes inde i cellen. For at få isoleret RNA til eksperimenter skal cellevæggene og plasmamembranen ødelægges, så RNA’et kan komme ud. Her bruger man ofte både en enzymatisk og mekanisk fremgangsmåde. Enzymerne går ind og nedbryder proteinstrukturerne i cellerne ved at nedbryde forskellige bindinger i cellens strukturelle proteiner. Den mekaniske fremgangsmåde kan være sonikering (ødelæggelse vha. lyd), centrifugering, homogenisering med en dounce (kan sammenlignes med en morter) eller ved brug af kanyler. I takt med at cellen ødelægges, frigives ribonucleaser (RNaser), som er enzymer, der nedbryder RNA. Hvis man arbejder hurtigt og samtidigt med den enzymatiske og mekaniske metode, sikrer man sig, at cellevæggene bliver nedbrudt, så enzymet kan komme ind og virke, og man mindsker derved  RNA-nedbrydningen.

Ud over cellens frigivelse af RNase, frigiver vi naturligt RNase fra olien på vores hænder, ansigt, hår osv. Desuden kan overflader og støvpartikler indeholde bakterier og virus, som også har RNaser. Det er derfor vigtig, at man arbejder sterilt med specielle RNase-fri handsker, -eppendorf-rør og -pipette-spidser. Holdes prøverne på is vil man med stor sandsynlighed inaktivere RNasen, da enzymet er inaktivt ved dinne temperatur. Der findes også stoffer, som kan inaktivere RNAser, men de er ikke nødvendige, hvis man blot sørger for et sterilt RNase-frit miljø.

Når cellen er smadret, kan RNA’et udfældes af opløsningen. Det kan gøres med ethanol eller isopropanol. Da DNA ligner RNA i struktur, kan DNA også udfælde ved denne metode. En måde at undgå dette er at tilsætte DNAse (enzymer der nedbryder DNA) til prøven, efter cellen er blevet ødelagt. Alternativt kan man bruge LiCl til fældning, da man vha. dette salt ikke får DNA med under udfældningen. Det færdigisolerede RNA opbevares i RNase frit vand og fryses ved -80 grader for at undgå nedbrydning. I dag findes mange forskellige kits, der gør RNA-oprensningen lettere. En meget brugt metode er til oprensning af mRNA er specielle mRNA-søjler, som tilbageholder mRNA fra den homogeniserede blanding, mens alt andet (inklusiv DNA) vaskes væk. I disse søjler udnyttes, at mRNA som den eneste type RNA indeholder poly(A)-haler. I søjlerne er der nemlig små kugler med poly(T)-haler, som parrer sig med mRNA’et poly(A)-haler, når prøven hældes over i søjlen. Mens mRNA’et er bundet til kuglerne, vil alt andet cellemateriale og andet RNA løbe igennem søjlen. Til sidst frigives RNA fra søjlen ved at tilsætte en buffer, der får poly(A)-halerne til at give slip på poly(T)-halerne, og det frigivede mRNA opløses i RNase-frit vand.

Det næste trin er at undersøge kvaliteten af ens RNA, da ødelagt/nedbrudt RNA ikke kan bruges i de efterfølgende genanalyser. En almindelig metode er at køre en lille prøve af det isolerede RNA på en agarose-gel. I en menneskecelle vil der være en vedvarende aktivering af to gener 18S og 28S. Disse to gener bruges til at undersøge, hvor god kvalitet, dvs. hvor intakt det isolerede RNA, er. Intakt RNA vil have to meget distinkte bånd (18S og 28S rRNA-bånd), hvorimod nedbrudt RNA har et større ”smear” hen over hele brønden jf. figur 1.

Figur 1. Et billede af en gel taget i en UV-transilluminator. Fra venstre: RNA-standard,  nedbrudt RNA og intakt RNA med distinkte S18 og S28 bånd.

Opsummering

I mikrochipteknologien måles der på mRNA for at få information om, hvilke gener der er aktive, og i hvilke mængder genet udtrykkes. RNA kan isoleres fra f.eks blod og væv. For at få RNA ud af cellen, skal cellemembramen ødelægges. Dette skal gøres hurtigt og prøven skal ofte på is for at undgå, at cellens RNaser kommer i kontakt med RNA, hvilket vil resultere i, at RNA’et nedbrydes. RNA skal derpå oprenses og isoleres fra DNA og proteiner. Dette kan gøres ved forskellige metoder, hvor specielle RNA-søjler, der tilbageholder RNA’et er en populær metode. RNA’ets kvalitet undersøges ved at køre en lille prøve af det isolerede RNA på en gel. Meget klare og skarpe bånd af de to gener 18S og 28S er en indikation af god RNA-kvalitet.