Mikrochipteknologi

Hvad er en DNA-mikrochip og hvordan er den opbygget?

En DNA-mikrochip er et lille stykke firkantet materiale, som kan være lavet af glas, plastik eller silicium. På en DNA-mikrochip er der plads til hundredtusindvis af spots/felter, som er dækket af en masse syntetisk fremstillet, enkeltstrenget DNA. Chippen kan sammenlignes med en lille kvadratisk græsplæne, hvor jorden er platformen, og alle de mange tusinde græsstrå er DNA strenge, som betegnes DNA-prober.  Disse DNA-prober er designet således, at de kan binde til en komplementær basesekvens, der er specifik for kun ét gen. I den prøve, man ønsker at undersøge, findes DNA-strenge for alle de gener, der er aktive. Prøverne varmebehandles, således at det dobbeltstrengede DNA omdannes til enkeltstrenget DNA. De enkeltstrengede DNA-strenge har mulighed for at binde til deres komplementære streng, der er repræsenteret på DNA-platformen. Det er på den måde muligt at bestemme hvilke gener, der er aktive i en given celle. Den biologiske prøve sammenlignes da med en reference eller en standard.

Forskellige typer af DNA mikrochips

I takt med at mikrochipteknologien har udviklet sig, og flere laboratorier bruger DNA-mikrochips som en standardmetode, er der også kommet flere forskellige typer af DNA-mikrochipplatforme, der bruges til gen-ekspressionsanalyser. Nogle mikrochips kan man designe selv. Her skal man foretage en udvælgelse af hvilke gener, man ønsker at undersøge. Andre mikrochips har hele det humane genom på chippen med over hundredtusind forskellige spots/felter. På mikrochippen vil der være flere probe-spots pr. gen, så man har muligheden for at kvantificere, hvor meget gen og derved protein, der er produceret.

Figur 17. Opbygningen af en DNA-mikrochip. På chippen er forskellige DNA-prober bundet til overfladen. Disse prober vil binde sig til fragmenter af DNA, når en prøve placeres på chippen. Der kan være flere tusind prober på en DNA-mikrochip.

Hvordan mærker man den biologiske prøve?

Der er forskellige måder at mærke sit materiale. Radioaktivitet og fluorokromer er eksempler på dette. Fluorokromer er molekyler, der udsender lys, dvs. fluorescerer, når man lyser på dem med UV-lys.  Fluorescens er en proces, hvor energi absorberes (ved excitation) fra lys af én bestemt bølgelængde, og energien afgives (emitteres) ved en anden længere bølgelængde. Fluorokromerne har en del aromatiske ringe, som har dobbeltbindinger mellem C-atomerne. Disse bindinger kaldes konjugerede bindinger. De konjugerede bindinger indeholder elektroner, som absorberer lys fra et område af lysspektret (som ikke behøver være synligt lys) og emitterer lys i det synlige område. Bølgelængdeskiftet fra exitation til emittation kaldes Stokes skift. Jo større Stokes skift er, jo nemmere er det at adskille det fluorescerende lys fra det lys, fluorokromet belyses med (fx UV-lys). Der findes forskellige fluorokromer, som absorberer og emitterer lys ved forskellige bølgelængder, og dette udnyttes i mikrochipteknologien. De fleste fluorokromer, der bruges i mikrochipteknologien, har et Stokes skift på 20-60 nm. Forbinder man kemisk et fluorokrom til DNA, vil DNA’et også lyse op, hvorved DNA kan identificeres.

Figur 18. Stokes skift er forskellen i bølgelængde mellem absorptionstoppen og emissionstoppen.

Det første led i at mærke den biologiske prøve er at isolere mRNA – en teknik der uddybes senere i artiklen. Derefter omdannes mRNA til komplementært, enkeltstrenget cDNA vha. enzymet DNA Revers Transkriptase.

Der er to primære trin i reverse transkriptase processen, som illustreres i figur 19:

1. Genkendelse af mRNA i total RNA poolen
2. Syntese af cDNA fra mRNA

Følgende punkter beskriver processen for dannelsen af det cDNA, som skal bruges i ens mikrochipeksperiment.

• mRNA kendetegnes ved dets poly(A)-hale. Derfor tilsættes Oligo (dT) primers (TTTTTTT…), som genkender mRNA-transkripter ved at binde til mRNA poly(A)-halen.
• Enzymet DNA revers transkriptase tilsættes for at katalysere dannelsen af cDNA-strengen, der er komplementær til mRNA. Byggestenene til syntese af cDNA er dATP, dGTP, dCTP og dTTP, som samlet kaldes dNTP (deoxyribonucleosidtriphoshate).

• dNTP’erne tilsættes i overskud så de er tilgengængelige til at syntetisere cDNA.

• Når dNTP-enheden er inkorporeret i cDNA-strengen, bliver den til et nukleotid. Hvis fx dATP bliver inkorporeret, vil den resulterende cDNA-streng indeholde et nukleotid med basen A.
• mRNA nedbrydes efterfølgende med NaOH, og tilbage er kun enkeltstrenget cDNA (som et stabilt over for basisk hydrolyse med NaOH). cDNA vil indeholde den samme information som DNA, men hvor intronsekvenserne er splejset væk. Introns er den ikke-kodende del af DNA/RNA.

Figur 19. Revers transkription. mRNA fra RNA-poolen genkendes ved poly(A)-halen. Oligo (dT) primers bindes til poly(A)-halen ved komplementær binding. Her kan primeren og enzymet revers transkriptase begynde syntesen af DNA-strengen med de tilgængelige dNTPs (base-byggesten). Efter at DNA er syntetiseret, nedbrydes resterende RNA med NaOH.

Mærkning til DNA-mikrochip

I nogle typer af DNA-mikrochips blandes både reference cDNA og test cDNA sammen og loades på DNA-mikrochippen. For at kunne skelne mellem referenceprøven og testprøven bruges to forskellige slags fluorokromer. Typisk anvendes det grønne cyanin fluorokrom Cy3 og det røde cyanin fluorokrom Cy5.

Ved direkte mærkning inkorporeres Cy3 mærket-dNTP under syntesen af den første cDNA-streng fra reference mRNA. Reference cDNA’et vil derfor være grønt. Tilsvarende inkorporeres Cy5 mærket dNTP i test RNA. Test cDNA’et vil derfor være rødt. Efter at Cy3 og Cy5 er inkorporeret i cDNA, bliver alt overskydende mRNA nedbrudt med NaOH. Det inkorporerede Cy3- og Cy5-mærkede cDNA oprenses for at fjerne ikke-inkorporeret C3- og Cy5-mærket dNTP, salte og enzymer. Binding af RNA/DNA til den komplementære streng er en proces, der kaldes hybridisering. Efter oprensningen blandes Cy3-mærkede og Cy5-mærkede prøver sammen og hybridiseres til DNA-mikrochippen. Efter hybridiseringen vaskes chippen for at fjerne ikke-bundet fluorescensmærket cDNA og bufferopløsninger. Figur 20 skitserer hele den direkte mærkning med Cy3 og Cy5 under revers transkription til cDNA.

Opsummering

Det fundamentale princip bag DNA-mikrochipteknologien er hybridiserings-processen mellem mRNA/DNA-strenge og komplementær DNA. Metoden består af kendte oligoneukleotidsekvenser og en ukendt mærket RNA-prøve, som kan identificeres gennem fotoluminiscens. cDNA mikrochip anvender fluorescensmærkning, hvor mRNA under revers transkription eller ved in vitro transkription inkorporerer et fluorokrom, der gør det muligt at detektere transkriberede gener. Det mærkede RNA/DNA vil hybridisere til de komplementære oligonukleotider, som vil resultere i et positivt signal, når pladen belyses af en laser og registreres af en lysscanner. Dette giver mulighed for at kunne se hybridiseringen. Dette kombineret med viden om sekvensen og lokaliseringen på chippen kan transformeres til et datasæt, der giver en værdi for hvert gen. Ud fra dette datasæt skal der efterfølgende udføres en statistisk analyse, som skal danne grundlag for biologiske vurderinger og konklusioner.

Figur 20. cDNA-mikrochip fluorescensmærkning. Reference- og testprøven tilsættes på samme chip.To forskellige farver er påkrævede for at kunne skelne mellem prøverne. Cy3 og Cy5 inkorporeres under revers transkription og blandes derefter sammen på chippen. Et grønt signal vil betyde, at genet i kontrollen er højere udtrykt end genet i testprøven, mens et rødt signal vil betyde det omvendte. Et gul signal indikerer, at genet er udtrykt i lige store mængder for både reference og test.

Figur 21. DNA mikrochip.

Figur 22. Et scanningsbillede af en DNA mikrochip.