• Fra Darwin til bioteknologi

    Velkommen til projektet Fra Darwin til Bioteknologi.

    Projektet er sponsoreret af Novozymes A/S og Institut for Systembiologi. Juliane C. Thøgersen har udarbejdet projektet og det tilhørende materiale, mens Jesper I. Foldager har opdateret materialet. Formålet med dette undervisningsmateriale er at give en forståelse af hvad evolution og diversitet er. Herudover kan man se og høre foredraget ”The Evolution of Biological Complexity” af den anerkendte evolutionsbiolog Paul Rainey. Foredraget er på engelsk og optaget og redigeret af Biotech Academy. Undervisningsmaterialet består af fem teoretiske artikler samt en eksperimentel del med 2 forsøg der knytter sig til teorien.

    Der tages udgangspunkt i industriens gavn af naturens diversitet, og ud fra dette vil der blive gennemgået teori der ligger til grund for evolution. Dette inkluderer mutationer og genetisk rekombination samt selektion. Der vil også være en gennemgang af nogle af de bioteknologiske værktøjer der er tilgængelige i dag.

    Bioteknologien kan give et billede af evolutionsforløbet, idet det er blevet muligt at sekventere organismers DNA og dermed se, hvor nært beslægtede de er ved at opbygge fylogenetiske træer.

    Forsøget “Isolering af cellulaseproducerende bakterier” udføres med samme slags moderne bioteknologisk udstyr, som benyttes i industrien. Udstyret sponsoreres af Novozymes, der med en million-donation har sikret, at der kan sendes udstyr ud til alle danske gymnasier og HTX’er.

    For at navigere rundt i projektet bruges menuen til venstre eller oversigten herunder.

    Projektoversigt

    Teori

        • Introduktion
        • Darwin og naturlig selektion
        • Evolution blandt bakterier
        • Bioteknologiske metoder
        • Diversitet i dag
        • Evolutionsforedrag af Paul Rainey

    Øvelser

        • Isolering af cellulaseproducerende bakterier
        • Evolutionseksperiment

    Artikler

      • Artikler fra Ingeniøren
      • Artikler fra Aktuel Naturvidenskab
    • Ordliste

    God fornøjelse med projektet!

  • Teori

    For at læse artiklerne skal du bare bruge menuen ude til venstre. En oversigt over de forskellige teoriafsnit ses herunder:

    • Introduktion
    • Darwin og naturlig selektion
    • Evolution blandt bakterier
    • Bioteknologiske metoder
    • Diversitet i dag

    God fornøjelse med den teoretiske del af materialet!

    Enzymets vej fra naturen til brug i den moderne bioteknologi-industri

    Novozymes er verdens største producent af industrielle enzymer der benyttes i alt fra vaskepulver til energiproduktion. At finde nye industrielle enzymer kræver blandt andet held, hårdt arbejde og forskning inden for biodiversitet. Ved denne forskning kan man finde organismer som producerer enzymer med de egenskaber man søger.

    På grund af de mange forskellige anvendelsesmuligheder for enzymer er det nødvendigt også at finde enzymer med forskellige egenskaber. Derfor isolerer Novozymes enzymer fra bakterier og svampe der lever under vidt forskellige forhold som på bunden af havet, i vulkaner og i ørkner. Alle disse steder er ekstremt forskellige, og derfor har naturen ved hjælp af evolution, gennem mutationer og naturlig selektion, skabt en stor biologisk diversitet.

     

    1.1 Bioethanol

    Bioethanol kan bruges som brændstof i biler og er derfor et alternativ til fossile brændstoffer. Bioethanol deles op i 1. og 2. generation.

    Figur 1. Forskellige forhold i naturen er hjemsted forvidt forskellige mikroorganismer [Foto: Colourbox].

    1. generations bioethanol produceres ud fra sukker og stivelse fra blandt andet majs og korn. Dette har været en meget omdiskuteret metode, da produktionen af bioethanol bruger nyttige fødevarer og derved får prisen på majs og brød til at stige, hvilket er et problem for især udviklingslandene.

    Man forsøger derfor at skabe 2. generations bioethanol som produceres ud fra cellulose i f.eks. halm og træflis. Herved bliver prisen på fødevarer ikke direkte påvirket.

    Cellulose er en lang kæde af glukosemolekyler bundet sammen af såkaldte b-1,4-glycosidbindinger. Cellulose udgør hovedbestanddelen af cellevæggen i planter. Mennesker og de fleste dyr kan ikke nedbryde cellulose, da det kræver cellulosenedbrydende enzymer, cellulaser,  i fordøjelsessystemet. Cellulaser kan bryde bindingerne mellem glukoseenhederne i cellulose og dermed nedbryde cellulosen til glukose. Glukose kan bruges direkte af de mikroorganismer som producerer ethanolen.

    I forbindelse med produktion af 2. generations bioethanol er der altså brug for cellulaser der kan nedbryde cellulosen. Novozymes forsøger at finde mere effektive cellulaser ved at søge efter cellulaseproducerende mikroorganismer i naturen.

     

    1.2 Opdagelse af nyt enzym

    Opdagelsen af nye enzymer starter med at forskere går ud i naturen og indsamler prøver, hvorfra der isoleres mikroorganismer. Det giver mange forskellige isolater med bakterier som har forskellige fysiologiske egenskaber. Organismernes optimale levevilkår afhænger bl.a. af pH og temperatur. Forud for forskernes søgen efter bestemte organismer vil de gøre sig overvejelser omkring hvor de søgte mikroorganismer kunne tænkes at leve. For eksempel vil cellulosenedbrydende bakterier formentlig befinde sig i nicher hvor der regelmæssigt er cellulose til stede. For at få fat i mange bakterier kan det dog være en fordel at tage prøver fra steder hvor der er rigtig mange bakterier. For at bakterier kan leve, skal de have en vis mængde fugt og næring. Det kan de få mange forskellige steder, men for eksempel er der op til 2 milliarder levende bakterier i et helt almindeligt gram jord.

    I laboratoriet screenes isolaterne først for den ønskede enzymaktivitet. Hvis der ledes efter cellulaseaktivitet, kan det ske ved at dyrke de forskellige mikroorganismer på specielle screeningsagarplader. Pladerne indeholder blå korn som består af et azofarvestof som er kovalent bundet til modificeret cellulose. Kornene opløses af cellulaser og den blå farve diffunderer ud i agaren. Hvis mikroorganismerne producerer cellulaser, vil der opstå en blå zone rundt om disse kolonier. Efter screeningen vil de mikroorganismer der viser cellulaseaktivitet blive nærmere undersøgt.

    De mikroorganismer der ikke viser cellulaseaktivitet, vil alle blive gemt i et stammebibliotek. Forskerne kan senere teste dem for andre egenskaber i forsøget på at finde nye enzymer der kan bruges i andre sammenhænge.

     

    1.3 Moderne genteknologi

    Ud over at lede efter nye enzymer, anvender man i dag også genteknologi for at forbedre allerede kendte enzymer. Det kan være en cellulase som man forsøger at effektivisere ved at ændre nogle af aminosyrerne i proteinsekvensen.

    Fordelen ved at finde nye enzymer i eksisterende bakterier, er at man kan udnytte det arbejde som naturen, gennem evolution i milliarder af år, har gjort for en. Evolutionen har skabt stor diversitet og selekteret for optimale enzymer i den sammenhæng de bruges i. Alt det arbejde er svært bare lige at efterligne i laboratoriet.

    Læs mere:

    Om enzymer

    Biologiske katalysatorer forbedrer brødet
    Et link til et Biotech Academy-projekt, som handler om enzymer

    Om bioethanol

    Fra halm til bioethanol, en bioteknologisk udfordring
    Et link til et Biotech Academy projekt, som handler om bioethanol

    Darwins evolutionsteori blev beskrevet i hans værk Arternes oprindelse som udkom i 1859. De grundlæggende principper for Darwins teorier forudsættes kendt, men kan kort opsummeres i følgende punkter:

    • Forskellige egenskaber er arvelige
    • Der er naturligt variation i en population
    • Kun en del af en generation formår at overleve og formere sig
      (berømt citat: “survival of the fittest”)
    • Det medfører at gavnlige egenskaber vil favoriseres over generationer

    Dette er grundlaget  for al senere evolutionsteori. Darwin vidste ikke at arveligheden bunder i gener, eller at variationen er opstået gennem forskellige former for mutationer. Alligevel var det muligt for ham at udlede en teori som stadig er yderst relevant den dag i dag.

     

    2.1 Selektion i laboratoriet

    Selektion bruges som det engelske ord selection, og kan løst oversættes med udvælgelse. I evolution sker selektion ved at kun den del af en population som formår at overleve og formere sig bliver udvalgt. Der kan være forskellige grader af selektionspres, alt efter hvor kraftig denne udvælgelse er.

    I laboratoriet benyttes selektion til at isolere bakterier med én bestemt fænotype, ved at udnytte at det kun er bakterier med den ønskede fænotype der kan gro under bestemte betingelser. Det er desværre ikke alle fænotyper som kan selekteres for, og det kræver nogle gange meget opfindsomhed at lave en forsøgsopstilling hvor det kan lade sig gøre.

    I laboratorier bruges antibiotikaresistens ofte som selektionsmarkør. Ved tilsætning af antibiotika til det medium som bakterierne vokser på eller i, vil kun antibiotikaresistente bakterier overleve. Det bruges ofte når en bakteries gener skal manipuleres. Forskeren sørger for at introducere den ønskede ændring sammen med et gen som giver antibiotikaresistens.  Forskeren kan efterfølgende finde alle de bakterier hvor ændringen er lykkedes ved at tilsætte antibiotika. Bakterierne udsættes for et meget højt selektionspres hvor kun dem der har antibiotikaresistens overlever. Det står i kontrast til de fleste tilfælde af naturlige selektion hvor selektionspresset er meget lavere. Her dør bakterier med andre fænotyper ikke nødvendigvis, men bestemte fænotyper favoriseres blot.

    Hvis man vil selektere for cellulaseproducerende bakterier, kan man dyrke bakterierne på et medie der kun indeholder cellulose som kulstofkilde. For at bakterierne kan vokse er det nødvendigt for dem at nedbryde cellulosen. Bakterierne kræver kulhydrat som energikilde, og derfor vil kun cellulaseproducerende bakterier kunne vokse på dette medie. Problemet med denne metode er at man ikke finder alle de bakterier der kan nedbryde cellulose, da det ikke er sikkert de kan klare sig med cellulose som den eneste kulstofkilde.

     

    2.2 Screening

    Det er ikke altid muligt eller praktisk at benytte selektion i laboratoriet. Nogle gange benytter man forskellige former for screening. Ved selektion kommer der kun det frem som man leder efter. Ved  screening undersøger man i stedet hver enkelt bakterie for den ønskede egenskab. Når man screener bakterier for cellulaseaktivitet på de nævnte agarplader, undersøger man hver enkelt koloni for en zone af blåfarvning rundt om den. Deraf konkluderes at bakterien har cellulaseaktivitet. Hvis man lavede en selektion ville det kun være bakterier med cellulaseaktivitet der voksede op til kolonier. Grunden til at selektion generelt foretrækkes er at det ofte er mere simpelt at finde de bakterier man er interesseret i. Især hvis de bakterier man ønsker gemmer sig som en nål i en høstak. Med screening må hvert et strå undersøges, ved selektion vil hele høstakken forsvinde, og kun nålen være tilbage.

    2.3 Antibiotikaresistens

    Der foregår en konstant kamp mellem mikroorganismer. Det gælder om at få fat i næringsstoffer så man kan formere sig og bringe sine gener videre. Der findes mange forskellige strategier til at opnå dette, nogle gange er der nærmest tale om kemisk krigsførelse. Nogle bakterier prøver at vinde i den evige kamp ved at vokse hurtigt. Andre forsøger at holde andre bakterier væk ved selv at udskille antibiotika. Derfor kommer rigtig mange af de kendte antibiotika netop fra mikroorganismer. Det betyder også at antibiotika er en del af naturen og at der gennem evolution er opstået mikroorganismer der er resistente overfor forskellige former for antibiotika. Antibiotikaresistens er altså ikke en ny ting, men det er et problem når patogene (sygdomsfremkaldende) bakterier får antibiotikaresistens.

    Antibiotika er blevet brugt til at bekæmpe bakterier siden opdagelsen af penicillin i 1928. Når antibiotikum anvendes skabes et meget stort selektionspres, og kun antibiotikaresistente bakterier overlever. I en population af bakterier er der en genetisk variation som er opstået gennem mutationer. Nogle mutationer kan gøre en bakterie i stand til at overleve en antibiotikakur. På den måde kan antibiotikaresistens fremmes som følge af selektionspres. Derfor er brugen af antibiotika med til at fremme resistensen mod de brugte antibiotika. Hvis blot en enkelt bakterie bliver antibiotikaresistent, så vil en antibiotikakur sørge for at denne bakterie udvikler sig til en hel population af antibiotikaresistente bakterier. Heldigvis findes der mange forskellige antibiotika, men det kan stadige være et problem, især når bakterier bliver multiresistente og kan modstå mange forskellige antibiotika.

    2.4 Fitness

    Ved en organismes fitness menes dens evne til at reproducere i et miljø. Fitness er et relativt begreb, og en organismes fitness måles derfor som regel kun i forhold til andre organismers fitness. Når man siger at én organisme har højere fitness end en anden, vil det sige at denne organisme er bedre tilpasset til det pågældende miljø. Konsekvensen af øget fitness er evnen til at udkonkurrere andre.

    Da fitness afgøres af en organismes evne til at reproducere, kan fitness måles ved at se på den aktuelle væksthastighed i et givent miljø. Det er altså ikke nødvendigvis sådan at den organisme der har den højeste maksimale væksthastighed har størst fitness. Der er andre faktorer der er mindst lige så afgørende. Et eksempel kunne være to forskellige bakteriestammer hvor kun én af dem producerer cellulaser. Hvis stammerne befinder sig i et miljø hvor der er masser af cellulose, men ellers begrænsede kulstofkilder, vil den cellulaseproducerende bakterie udvise størst fitness. I denne niche vil den have den højeste væksthastighed og langsomt udkonkurrere den anden bakterie. Fitness afhænger i høj grad af det omkringliggende miljø, og fitness i én niche kan derfor godt være meget forskellig fra fitness i en anden niche. Hvis én organisme har bedre fitness end en anden i en bestemt niche, vil denne organisme langsomt blive mere dominerende.

    2.5 Forskellige typer selektion

    Naturlig selektion kan føre til at en ny genetisk variation favoriseres, og der sker evolution. Naturlig selektion er også med til at fastholde den genetik en organisme har. Langt de fleste mutationer har en negativ effekt, og den naturlige selektion vil sørge for at disse varianter langsomt uddør.

    Et eksempel på dette kan være en cellulaseproducerende bakterie der lever i en niche med et højt indhold af cellulose. Hvis der opstår nye varianter der har dårligere cellulaseaktivitet, vil de med tiden uddø da den oprindelige bakterie vil have en overlevelsesmæssig fordel. Den vil med andre ord udvise større fitness da den kan udnytte cellulose.

    Denne form for selektion kaldes ”stabilizing selection”, da den oprindelige fænotype favoriseres frem for variationer med dårligere cellulaseaktivitet. Selektionen bevirker altså en stabilisering af cellulaseaktiviteten.

    Der er tre forskellige former for selektion. De kaldes ”stabilizing selection”, “directional selection” og ”disruptive selection”.

    ”Directional selection” blev illustreret i eksemplet med antibiotikaresistens, hvor en ydre påvirkning fører til at en bakteriekultur udvikler sig i én retning. I dette tilfælde mod antibiotikaresistente bakterier. Det er vigtigt at bemærke at den antibiotikaresistente mutant er opstået tilfældigt, men det er selektionstrykket fra antibiotikummet, der gør at denne mutant viser størst fitness.

    ”Disruptive selection” finder sted, når der selekteres for alle fænotyper der afviger fra den oprindelige. Denne form for selektion så Darwin da han observerede de forskellige finker på Galapagosøerne, hvor form og størrelse af deres næb varierede fra ø til ø. Her viste det sig, at et større og bredere næb samt et mindre og spidsere næb blev favoriseret frem for det oprindelige. Dette skyldes at finken med det store brede næb kan spise hårde frø, mens fuglen med det lille spidse næb kan spise bløde kerner. Der selekteres dermed både for det ene yderpunkt, et stort bredt næb, og det andet yderpunkt, et lille spidst næb, hvis miljøet kræver disse næbtyper.

    Figur 1. Illustration af tre forskellige klassificeringer indenfor selektion. Den øverste del af figuren illustrerer “directional selection”, hvor en mutant udviser større fitness end den oprindelige fænotype. I midten ses “disruptive selection”, hvor mutanter i både den ene og den anden retning har større fitness. Nedest ses “stabilizing selection”, hvor den oprindelige fænotype udviser størst fitness.

    Læs mere:

    Sygdomme driver menneskets evolution
    Naturlig selektion og sygdomme har haft langt større betydning for menneskets udvikling end hidtil antaget. En artikel fra Ingeniøren, september 2007.

    Forskere intensiverer jagten på ukendt liv under Østersøens havbund
    Undersøgelse af livet under havbunden fører til spørgsmålet, om livet kan være opstået under havbunden. En artikel fra Ingeniøren, august 2007.

    Evolutionslæren
    En artikel fra Aktuel Naturvidenskab om Darwin, evolutionsteori og livets opståen.

    De fleste af de mekanismer der gennemgås i det følgende er fælles for alt liv. Det vil sige for såvel bakterier som eukaryoter og archaea. Kun afsnittet om gen-overførsel, afsnit 3.4, gælder specifikt for bakterier.

    3.1 DNA og gener

    DNA er det genetiske arvemateriale. DNA er en lang kæde af nukleotider. Skelettet består af sukker og phosphatgrupper. Til hver sukkerenhed er der bundet en af baserne A (adenin), T (thymin), G (guanin) eller C (cytosin). DNA eksisterer normalt ikke som et enkeltstrenget molekyle, men som en dobbelthelix bestående af to antiparallelle DNA-strenge. Baserne fra hver af strengene sidder altid i bestemte par, så A parrer med T og G parrer med C. Kun de dele af DNA-molekylet som indeholder genetisk information kaldes gener. Generne kan oversættes til proteiner som bestemmer en organismes funktionelle egenskaber. DNA’et danner således grundlaget for hvordan en organisme ser ud og fungerer.

    3.2 Det centrale dogme

    Informationsoverførslen fra DNA til protein sker ved hjælp af to processer kaldet transkription og translation. Den første proces, transskription, består af at DNA omskrives til messenger RNA (mRNA). RNA ligner DNA i opbygning. Blot er sukkerenheden en anden, og basen T er erstattet af basen U (uracil). Den næste proces, translation, er en oversættelse af mRNA til protein. Proteiner består af kæder af aminosyrer. Tre nabostillede baser i mRNA oversættes til én aminosyre. Sekvensen af tre baser kaldes en triplet eller et kodon, og koder hver især for én bestemt aminosyre. Da der er 64 forskellige tripletter til at kode for 20 aminosyrer koder nogle af tripletterne for samme aminosyre. Desuden er tre af de 64 kodons stopkodons som ikke koder for en aminosyre, men stopper translationen.

    Dette sammenfattes i det centrale dogme, som siger at informationsflowet går fra DNA, hvis information skrives over på mRNA, og videre til protein, ved at mRNA koder for produktion af proteiner.

    Figur 1. DNA’s opbygning. Øverst ses DNA som en dobbeltstrenget alfa-helix. Den nederste del af figuren viser hvordan nukleotidbaserne parrer sig to og to.

    Dette er illustreret på i figuren nedenfor. Pilen som peger tilbage på DNA illustrerer processen replikation, hvor et DNA-molekyle fordobles til to ens DNA-molekyler. Denne proces sker altid inden en celle deler sig, så begge celler får en kopi af arvematerialet. I enkelte tilfælde er der afvigelser fra det centrale dogme. I retrovirus, som HIV, koder RNA for DNA. Dog koder protein aldrig tilbage til RNA eller DNA.

     

    3.3 Mutationer

    Når bakterier reproducerer sker det ved at cellen vokser i størrelse, DNA’et replikeres, og til sidst deler cellen sig i to nye bakterieceller. Derved får dattercellerne hver sin kopi af kromosomet. De to datterceller er således kloner af den oprindelige. Man kan undre sig over hvordan der sker evolution af bakterier, når der ved reproduktion i bakterier blot dannes to kloner af den oprindelige celle. Variationen introduceres ved mutationer og horisontal genoverførsel som beskrives i det følgende.

    Hvis der sker ændringer i basesekvensen for et gen, kan det føre til en ændring af det resulterende proteins funktion. Det introducerer variation i populationen og er med til at drive evolutionen.

    Mutationer er ændringer i basesekvensen i DNA, som f.eks. kan forekomme ved fejl i DNA-replikationen. Under replikationen deles DNA-molekylet op i to enkelte strenge som hver fungerer som skabelon for et nyt DNA-molekyle. Enzymet DNA-polymerase indsætter nukleotider som baseparrer med DNA-skabelonen. Mutationerne kan opstå hvis der indsættes et forkert nukleotid.

    Figur 2. Den genetiske kode

     

    Figur 3. Det centrale dogme. Pilene illustrerer informationsoverførsel.

    3.2.1 Punktmutationer

    En punktmutation er en substitution af ét basepar, og kan ske ved at der indsættes et forkert basepar i DNA-sekvensen under replikation. Alt efter konteksten kan dette føre til at en anden aminosyre indsættes når det ændrede mRNA translateres til protein. Mutationer kan også forekomme på områder der ikke translateres.

    Når punktmutationen ikke fører til en ændring af den pågældende aminosyre, betegnes mutationen som ”silent” eller synonym. En ”silent” punktmutation kan finde sted da der er flere kodons der koder for samme aminosyre. For eksempel koder UAU og UAC begge for aminosyren tyrosin.

    Når punktmutationen derimod fører til en ændring af en aminosyre, betegnes mutationen som ”missense” da kodonet får en ny betydning, og en anden aminosyre indsættes. På dansk kaldes det også en nonsynonym mutation. Nonsynonyme mutationer kan ødelægge funktionen af et protein og dermed give alvorlige konsekvenser, men ofte reducerer mutationerne blot proteinets effektivitet. Nonsynonyme mutationer kan endda føre til forbedring af proteinets funktion og effektivitet.

    Figur 4. De forskellige punktmutationer

    En anden form for punktmutationer er en ”nonsense” mutationer. Ved sådan en mutation bliver et kodende kodon forandret til et stopkodon, og derved stoppes translationen for tidligt. Mutationen betegnes nonsense, da kodonet ikke længere har en betydning, i og med det ikke længere koder for en aminosyre. Translationen stopper for tidligt og giver dermed et forkortet protein. Med mindre mutationen sker meget tæt på enden af genet, vil det resultere i et fuldstændigt inaktivt protein.

    3.3.2 Frame-shift mutationer

    Mutationer kan også forekomme når der indsættes eller fjernes en eller flere baser. Det kaldes henholdsvis  ”insertion” og ”deletion”. Begge situationer kan føre til en ”frame-shift” mutation.

    Figur 5. Illustration af de tre forskellige læserammer på en DNA-enkeltstreng

    Da den genetiske information bliver læst i blokke af tre basepar, er der tre måder hvorpå man kan læse en enkelt DNA-streng. Disse måder kaldes læserammer. Når man først har valgt det første kodon, så giver resten af læserammen sig selv. I en given DNA-sekvens kan man starte med at læse de første tre baser sekvensen som første kodon. Det vil det give en bestemt læseramme, der vil resultere i én peptidkæde. Hvis man derimod starter med anden eller tredje base, vil det give to helt anderledes peptidkæder. En start ved fjerde base vil give samme peptidkæde som den første læseramme, blot mangler den første aminosyre. I alt er der seks forskellige læserammer på et dobbeltstrenget DNA-molekyle – tre på hver streng.

    Som navnet siger vil en frame-shift mutation føre til en ny læseramme. Dette fører altid til at proteinet mister sin funktion, medmindre mutationen sker i slutningen af genet, og enden af peptidkæden ikke har så stor betydning.

    En frame-shift mutation vil føre til en ny læseramme (deraf navnet) og dette fører næsten altid til ikke-funktionelle proteiner.

     

    3.3.3 Hvordan der sker mutationer

    Mutationerne kan ske spontant. Her sker ændringerne i det genetiske materiale uden ydre påvirkning og mutationerne skyldes udelukkende at der naturligt sker fejl i cellens processer. Et eksempel herpå er, som beskrevet, punktmutationer der indføres under replikationen når DNA-polymerasen laver fejl.

    Mutationerne kan også være forårsaget af ydre faktorer hvilket kaldes mutagener. Dette kan være kemikalier som ændrer nukleobaserne. For eksempel findes der i cigaretrøg et kemikalie som tilføjer en stor kemisk gruppe til nukleobasen G og dermed gør den utilgængelig for baseparring. Når DNA-polymerasen møder denne modificerede G, indsætter den en tilfældig af de fire forskellige baser, og dermed kan der opstå en punktmutation. Mutagener øger frekvensen af mutationer, men det er stadig tilfældigt hvor de opstår.

    Mange af mutationerne når dog ikke at få betydning fordi cellerne besidder tre forskellige DNA-reparationsmekanismer. Den første er korrekturlæsning som følger DNA-polymerasen og reparerer de fleste af de fejl som DNA-polymerasen laver. Den anden mekanisme er ”mismatch repair” som tjekker om alle baserne passer sammen. Dette kunne f.eks. være hvis A var blevet parret med C i stedet for T. Til sidst er der ”excision repair” som er en mekanisme der fjerner abnorme baser som er blevet dannet på grund af kemikalier.

    3.4 Mekanismer for Gen-overførsel

    Ind til videre er det blevet diskuteret hvordan en enkelt celle kan ændre sig ved hjælp af mutationer. Nu betragtes hvordan to forskellige bakterier kan udveksle genetisk information. Dvs. hvordan en egenskab hos én bakterie kan overføres til en anden. Denne udveksling kaldes horisontal gen-overførsel eller krydset evolution. Krydset evolution er en vigtig del af evolutionen, da vigtige egenskaber som f.eks. antibiotika-resistens kan overføres mellem bakterier.

    Når mennesket formerer sig sker det seksuelt. Det vil sige at to mennesker parrer sig og danner nyt afkom med et genom der er en kombination af de to oprindelige genomer. Genomet for et afkom kan altså både ændre sig ved hjælp af mutationer og genetisk rekombination. I mennesker og andre organismer der bruger kønnet formering, sker denne rekombination inden for arten. I bakterier overføres der af og til gener fra andre bakterier som slet ikke er samme art.

    Når bakterier formerer sig dannes en klon af bakterien. Bakteriecellen danner en kopi af sit eget DNA ved replikation og deler sig derefter i to nye celler. Det er tidligere beskrevet hvordan mutationer kan føre til ændringer i genomet, men det forklarer ikke hvordan der kan ske krydset evolution blandt bakterier. I næste afsnit beskrives hvordan horisontal gen-overførsel sker i bakterier.

     

    3.4.1 Gen-overførsel i bakterier

    Der er tre mekanismer hvorved der kan ske gen-overførsel mellem bakterier. Én mekanisme er transformation hvor en bakterie optager frit DNA fra det omkringliggende miljø. DNA’et kan stamme fra en anden bakterie som er gået i stykker. En anden mekanisme er transduktion hvor der overføres DNA fra én bakterie til en anden bakterie via en bakteriofag, vira der angriber bakterier. Mekanismerne bag transformation og transduktion er illustreret i figur 6 og 7.

    Figur 6. Transformation. En død bakterie frigiver DNA-fragmenter. Et af DNA-fragmenterne optages af en levende bakterie og bliver sat ind på denne bakteries kromosom.

    Til sidst er der konjugation som er overførsel af genmateriale ved hjælp af plasmider. Overførslen sker ved at to celler kommer helt tæt på hinanden, og deres membraner delvist smelter sammen. Ved denne proces kopieres plasmider fra den ene bakterie til den anden.

    Plasmider er genelementer som eksisterer frit inde i bakterieceller, typisk er de små og cirkulære. Plasmider adskiller sig fra kromosomer idet de kun bærer på ikke-essentielle gener. Dvs. cellerne godt kan overleve uden de gener der bliver udtrykt fra plasmidet, men generne er ofte meget nyttige for bakterien. Plasmiderne bærer alle på gener der sørger for selvreplikation, så plasmiderne uafhængigt af resten af cellen kan lave kopier af sig selv. De plasmider der kan føre til konjugation bærer desuden på en række gener der betegnes tra-regionen. Tra-regionen gør det muligt for plasmiderne at transportere en kopi af sig selv ind i en anden celle. Mange af generne i tra-regionen er involveret i syntese af sexpilus som er en overfladestruktur der trækker de to konjugerende celler sammen.

    Ud over gener der koder for selvreplikation og transport, kan plasmider indeholde gener som udtrykker specielle egenskaber hos en bakterie. Dette kan for eksempel være gener der udtrykker antibiotikaresistens. Nogle af de mest kendte plasmider er netop plasmider der bærer på resistensgener. Disse plasmider betegnes R-plasmider.

    Det er ikke alle bakterier som kan udføre transformation, transduktion og konjugation. Transformation kræver et bestemt protein til at transportere frit DNA hen over cellemembranen, og konjugation kræver at cellerne indeholder plasmider med en tra-region.

    3.5 Betydning af mutationer og horisontal gen-overførsel

    Mutationer er vigtige for bakteriernes evolution da de kan indføre variation ved at ændre proteiners funktion, hvilket er grundlaget for at der kan forekomme en naturlig selektion. En punktmutation kan for eksempel føre til ødelæggelse af et proteins funktion. Hvis dette protein var et transportprotein som også kunne transportere antibiotika ind i cellen, vil en sådan mutation føre til antibiotikaresistens.

    Ud over mutationer spiller horisontal genoverførsel en vigtig rolle i evolutionen da denne proces kan overføres hele gener, som kan give vigtige egenskaber hos recipienten.

    Figur 7. Transduktion. En viruspartikel frigiver sit DNA i en bakteriecelle, hvorefter viruspartiklens DNA kopieres. Efter kopiering af virus-DNA og produktion af andre nødvendige viruskomponenter pakkes virus-DNA. Ved en fejl pakkes også noget bakterie-DNA som herefter kan overføres til en ny bakteriecelle.

    Figur 7. Transduktion. En viruspartikel frigiver sit DNA i en bakteriecelle, hvorefter viruspartiklens DNA kopieres. Efter kopiering af virus-DNA og produktion af andre nødvendige viruskomponenter pakkes virus-DNA. Ved en fejl pakkes også noget bakterie-DNA som herefter kan overføres til en ny bakteriecelle.

    4.1 Fylogeni

    Fylogeni er en beskrivelse af evolutionshistorien og slægtsforholdene mellem forskellige organismer. Et fylogenetisk træ illustrerer disse forhold i et diagram hvor hvert forgreningspunkt i træet angiver en teoretisk fælles ”forfader” for enhederne længere ude af grenen.

    Protein- eller DNA/RNA-sekvenser er særdeles velegnede til at opstille de evolutionære forhold, idet man ved sammenligning af sådanne sekvenser kan se, hvor nært beslægtede organismer er. Jo længere tid organismerne har udviklet sig hver for sig, jo mere forskellige er de. I figur 1 ses et eksempel på et fylogenetisk træ.

    Figur 1. Skitse af et fylogenetisk træ. 

    Inden man kan sammenligne gener eller proteiner mellem forskellige organismer, er det nødvendigt at kunne identificere dele af molekylerne som oprindeligt har været ens. Dette stiller krav til det gen eller protein der anvendes. Med udgangspunkt i genet skal det først og fremmes være til stede og have samme funktion i alle organismer der undersøges. Det skal sikre at dele af genet er konserveret dvs. uændret på tværs af de forskellige organismer. Derudover er det også nødvendigt at der er dele af genet som er stærkt varieret mellem forskellige organismer, således at der kan kendes forskel på to nært beslægtede arter. Kravene til anvendelse af gener i evolutionære studier er opsummeret i det følgende:

     

    Krav til gener for anvendelse i evolutionære studier

      • Genet skal være til stede og have samme funktion i alle organismer da en sammenligning ellers ikke er mulig. Det vil sige at dele af genet skal være konserveret.
      • Dele af genets sekvens skal være forskellig fra art til art.
      • Der skal være områder på genet som er stærkt varieret, således at der kan kendes forskel på to nært beslægtede arter.
      • Der må ikke være sket overførsel af genet mellem forskellige arter.

     

    4.1.1 Ribosomalt RNA

    Gensekvensen for Ribosomalt RNA (rRNA) er den hyppigst anvendte DNA-sekvens til konstruktion af fylogenetiske træer, da genet opfylder de beskrevne krav (se ovenfor).

     

    Ribosomalt RNA, rRNA

      • rRNA findes i alle levende organismer.
      • rRNA har samme funktion i translation for alle organismer.
      • rRNA har udviklet sig langsomt nok, til at der er konserverede sekvenser i genet.

    rRNA er hovedelementet i ribosomer og har derfor en stor rolle i proteinsyntesen. Alle levende organismer indeholder rRNA. rRNA findes i store mængder i cellerne da det sikrer at organismerne kan have mange ribosomer og opretholde en hurtig dannelse af proteiner. Ribosomet består af fire rRNA subunits samt en masse proteiner. For prokaryoter analyseres især 16S rRNA (i eukaryoter 18S rRNA) som er RNA-delen af den lille subunit til ribosomet. Dette gen har været anvendt da det har en passende størrelse. Det er relativt hurtig at sekventere og langt nok (ca. 1550 nukleotider) til at give en pålidelig fylogenetisk analyse.

    Strukturen af et 16S ribosomalt RNA er meget specifik og dannes ved hjælp af baseparringinverted repeat og loops. Man kan sammenligne forskellige sekvenser af 16S rRNA ved hjælp af bioinformatik-programmer. I eukaryoter findes en lignende subunit, som kan sekventeres og analyseres. Denne er dog lidt større og betegnes 18S rRNA.

    Før man kan sammenligne sekvenser af 16S rRNA fra forskellige organismer, er det naturligvis nødvendigt at sekventere genet. Inden sekventering er det nødvendigt at opformere genet, som gøres ved hjælp af en teknik der hedder PCR (beskrives senere).

    Ved at sammenligne 16S rRNA sekvenser kan man adskille organismer på artsniveau og opefter. Det er således ikke muligt at se forskel på to individer inden for samme art ved at analysere de to 16S rRNA sekvenser.

     

    4.1.2 Taxonomi

    Før man benyttede fylogeni, som dannes ud fra kendte gensekvenser, var taxonomi en metode, hvormed man kunne klassificere organismer. Taxonomien bygger på sammenhænge mellem organismers karaktertræk, dvs. organismernes fænotype, mens fylogenien bygger på genotype. Der vil i mange tilfælde være sammenhæng mellem taxonomi og fylogeni, men det er ikke altid sikkert at de følges ad. To organismer der i lang tid har været gennem forskellige evolutionsforløb vil være placeret langt fra hinanden i det fylogenetiske træ. De samme to organismer kan godt have fælles karaktertræk og blive placeret tæt på hinanden i taxonomien. For eksempel mente man tidligere at svovlbakterier og cyanobakterier var nært beslægtede da de begge har fotosyntese. Efter at have sekventeret deres 16S rRNA og opstillet dem i et fylogenetisk træ, er det imidlertid vist at de to bakterier befinder sig meget langt fra hinanden i evolutionsforløbet.

    4.2 PCR – Polymerase-kædereaktion

    PCR er en forkortelse af det engelske navn “Polymerase chain reaction” og som navnet indikerer, er der tale om en kædereaktion.

    PCR er en metode der blandt andet bruges til at opformere dele af DNA-sekvenser in vitro (latin for “i glas”. Dvs. ikke i kroppen. Normalt i PCR-rør). Gennem gentagne runder af replikation som man kan bestemme hvordan foregår. Ved hjælp af specifikke primere og en termostabil DNA-polymerase dannes store mængder af specifikke gener.

    PCR består af mange cykler hvor en række trin gentages. Hvert trin har en specifik temperatur i et vist tidsrum. Hver cyklus svarer til en DNA-replikation, hvilket vil sige at mængden af DNA fordobles.

    Første trin i PCR-maskinen består i opvarmning af DNA. Opvarmningen ødelægger hydrogenbindinger og van der Waals kræfter, hvilket forårsager at DNA denaturerer. Ved denaturering forstås at DNA mister sin sekundære struktur og bliver til to enkeltstrenge i stedet for en dobbeltstrenget α-helix.

    Derefter binder to primere sig til hver sin DNA-streng efter baseparringsprincippet. En primer er en kort DNA-streng som er komplementær til DNA-skabelonen. Denne del er nødvendig for at DNA kan replikeres da DNA-polymerasen skal bruge et stykke DNA at starte på og ikke en nøgen streng. Primerne er tilsat PCR-blandingen inden start.

    Primerne binder ved at PCR-blandingen nedkøles. Hydrogenbindinger og van der Waals-kræfter bliver aktive igen. Der er tilsat et stort overskud af primere i blandingen for at sikre at DNA-strengene binder til primere og ikke til hinanden. DNA-polymerasen syntetiserer DNA når blandingen varmes en anelse mere op igen. DNA-polymerasen benytte DNA-strengene som skabelon og syntetiserer den komplementære streng. Nukleotiderne dATP, dTTP, dGTP og dCTP fungerer som byggesten og skal derfor også være til stede i PCR-blandingen. Efter én cyklus er antallet af den specifikke DNA-sekvens fordoblet. Nu kan proceduren gentages gang på gang. Normalt udføres 30-40 cykler i en PCR-maskine. Ved 30 cykler fordobles DNA’et 30 gange, og der opstår derved 2^30 kopier af det oprindelige stykke DNA.

    Opvarmningen i PCR-maskinen er nødvendig for at denaturere DNA. Det er derfor vigtigt at DNA-polymerasen ikke ødelægges ved høje temperaturer. Det er løst ved at isolere DNA polymerasen fra bakterien Thermus aquaticus der lever under varme forhold. Denne polymerase kaldes Taq polymerase og er stabil op til 95 °C.

    Dette er et klassisk eksempel på hvordan forskere i områder med ekstreme forhold har fundet enzymer med ønskede egenskaber.

    Figur 2. Illustration af PCR. Den øverste del af figuren viser de første 3 cykler i en PCR-reaktion. Den nederste del viser detaljerne bag en cyklus. Først denatureres DNA ved opvarmning. Herefter følger en nedkøling hvor primere binder til hver sin DNA-streng. Derefter kopiers DNA-strengene.

    4.3 Sekventering

    Når man laver en sekventering, ønsker man at finde rækkefølgen af baserne i et stykke ukendt DNA. En DNA-sekvens er netop rækkefølgen af baserne for et bestemt stykke DNA.

    Ved DNA-sekventering benyttes også en PCR-reaktion, og princippet er det samme som ved opformering af DNA.  Der tilsættes DNA-polymerase, primer (kun én primer) og nukleotider (dNTP, hvor N står for en nukleobase, dvs. enten A, T, C eller G) samt nogle modificerede nukleotider, som stopper replikationen. Disse stop-nukleotider er di-deoxynukleotider (ddNTP) som er mærket med hver sit fluorescerende stof der kan detekteres. Når PCR-reaktionen er løbet til ende, vil der pga. stopnukleotiderne være opstået DNA-fragmenter med forskellig størrelse. Alle fragmenterne starter det samme sted, nemlig med den primer man har anvendt i reaktionen. Fragmenterne stopper med et ddNTP. der fluorescerer i en farve. Farven angiver hvilket nukleotid der er på den pågældende position. DNA-fragmenterne kan adskilles efter størrelse. Enten ved hjælp af en elektroforese-gel eller ved kapillar elektroforese som er det mest benyttede i dag. Det bagvedliggende Princip er det samme. Fragmenterne vil trænge igennem gelen med forskellig hastighed – de små hurtigst og de store langsomst. Nu kan sekvensen af DNA aflæses, ved at se hvilken farve de enkelte bånd fluorescerer. Det afslører hvilket stopnukleotid der er tale om. I figur 3 vil det DNA-fragment der trænger hurtigst gennem gelen være mærket med en blå fluorescens, som svarer til basen A, og det kan derfor konkluderes at det første bogstav i sekvensen er A.

    Figur 3. Princippet bag sekventering

    Det er ofte robotter der udfører DNA-sekventering. Detektionen fungerer ved at der sendes laserstråler mod DNA-fragmenterne, hvilket giver et bestemt udslag af fluorescens. Signalet af fluorescens hørende til et bestemt DNA-fragments stopnukleotid opsamles i et datasæt på en computer.

    Et eksempel på et udsnit af sådan datasæt ses i figur 4. De forskellige toppe viser hvilket nukleotid der er blevet detekteret i den givne position. Nogle steder kan der opstå tvivl om hvilken base der er korrekt. Det ses ved at der fremkommer overlappende toppe. Grunden til at der fremkommer to toppe oven i hinanden er at teknikken ikke er perfekt. Det kan f.eks. være svært at adskille meget små fragmenter fra hinanden, og de kan derved blive detekteret samtidigt.

    Figur 4. Eksempel på datasæt for DNA-sekventering. Hver base giver et bestemt flourescens-udslag.  

    Højden af toppene indikerer hvor stærkt detektionssignalet er. Når der kun er en top til stede, vil det ikke spille nogen rolle. Hvis der derimod fremkommer to toppe, hvor den ene er lav, og den anden er høj, vil computeren indsætte basen for den højeste top på denne position. Computeren vil i dette tilfælde markere positionen med en gul streg, så det er muligt at se at der er to muligheder for den givne position.

    4.4 Bioinformatik og sequence alignment

    Når DNA er sekventeret, er det muligt at sammenligne med andre DNA-sekvenser ved at sammenholde sekvenserne base for base. Denne sekvenssammenligning kaldes på engelsk for sequence alignment.

    Hvis sekvenserne ikke er lige lange, eller når der er brug for det, indsættes gaps som forlænger et stykke af sekvensen. Hvis de ikke blev indsat, ville to relativt ens molekyler se ud til at være vidt forskellige. Indsættelsen af gaps er illustreret i figur 5 nedenfor. I figur 6 er vist hvordan et sequence alignment output i praksis kan se ud.

    Når man har at gøre med små DNA-stykker, vil man godt kunne udføre denne sammenligning ved selv at kigge på sekvenserne, men som regel er DNA-sekvenserne så lange at det er nødvendigt at bruge en computer. For eksempel er DNA-sekvensen for 16S rRNA ca. 1550 nukleotider lang.

    Der er udviklet computerprogrammer til at lave disse sekvenssammenligninger, og de kan godt sammenligne mange sekvenser på en gang. Ud over at indsætte gaps er programmerne lavet til at genkende de vigtigste områder på sekvenserne. Disse dele kaldes ankerpositioner. Når sekvenssammenligningerne er gennemført, er det muligt at se hvor meget sekvenserne hver især ligner hinanden, og derudfra opstille fylogenetiske træer. Hvis to sekvenser er meget ens, skal de ligge tæt ved hinanden på træet.

     

    Læs mere:

    Livet skal sættes på stregkode
    Et internationalt forskningsprojekt skal forsøge at få styr på alverdens levende organismer ved hjælp af små ”DNA-stregkoder”. En artikel fra Aktuel Naturvidenskab.

    Jagten på generne
    En artikel fra Aktuel Naturvidenskab, der belyser, hvordan bioinformatikken bliver benyttet til daglig på Center for Biologisk Sekvensanalyse, DTU.

    Figur 5. Sequence alignment med indsættelse af gaps. Et-tallerne viser når der er overensstemmelse mellem de to sekvenser, mens 0’erne viser at der ikke er overensstemmelse. Det ses at efter indsættelse af gaps viser de to sekvenser ret stor lighed.

    Figur 6. Sequence alignment output. Stregerne angiver hvor der er sammenhæng mellem de to sekvenser.

     

    Diversitet er forskelligheden mellem organismer. Der findes tre domæner, som er de tre hovedklasser, alt liv deles op i. Disse domæner er Eukaryoter, Bakterier og Archaea. Planteriget og dyreriget er eksempler på underinddelinger inden for domænet Eukaryoter. Disse underinddelinger kan yderligere deles op i slægter og derefter arter. Enhver organisme er navngivet, således at fornavnet angiver, hvilken slægt organismen tilhører, og efternavnet angiver, hvilken art der er tale om inden for denne slægt. Bacillus subtilis tilhører således slægten Bacillus og arten subtilis.

    Figur 1. Illustration af livets træ med de tre domæner; Bakterier, Archaea og Eukaryoter.

    5.1 Diversitet mellem de tre domæner

    Der er store forskelle mellem de tre domæner. Prokaryoterne, som udgøres af domænerne bakterier og archaea, har f.eks. ikke nogen cellekerne eller membranafgrænsede organeller, og kromosomerne er som regel cirkulære. I modsætning hertil har de eukaryotiske celler organeller og en membranafgrænset cellekerne, hvor DNA-arvematerialet er ordnet i flere komplekse kromosomer.

    Der er også store forskelle mellem de to prokaryotiske domæner. Membranlipiderne i archaea er f.eks. forgrenede i modsætning til de uforgrenede membranlipider i bakterier. RNA-polymerasen hos Archaea minder desuden mere om RNA-polymerasen fundet i eukaryoter end den i bakterier. Overordnet har archaea mere til fælles med eukaryoter end med bakterier, og archaea deler derfor et forgreningspunkt med eukaryoter ud over de tre domæners fælles forgreningspunkt.

    De tre domæner har også fælles træk, og stammer alle fra en fælles stamfader. Lighederne mellem de tre domæner inkluderer glykolysen, DNA-arvematerialet som koder for proteiner, DNA-replikation, og de har alle rigeligt med plasmamembraner og ribosomer. Disse træk er altså fælles for alt liv på jorden.

     

    5.1.1 Archaea

    Archaea er kendt for, at kunne leve under ekstreme forhold, såsom høj saltkoncentration, høj temperatur, lavt oxygenindhold eller høj eller lav pH-værdi, men der er dog også mange archaea, der ikke lever under ekstreme forhold. Archaea kan deles op i fire underklasser.

    Der vides endnu ikke særlig meget om archaea, men to karakteristika, som gælder for alle archaea, og som adskiller dem fra bakterier og eukaryoter, er den manglende peptidoglykan i cellevæggen og tilstedeværelsen af forgrenede lipider i cellemembranen.

     

    5.1.2 Bakterier

    De fleste forbinder bakterier med sygdomme, men kun en lille gruppe af bakterier er patogene, dvs. sygdomsfremkaldende hos en værtsorganisme. Forskellige egenskaber er nødvendige for at en bakterie kan betegnes patogen. Det er først og fremmest nødvendigt for bakterien at komme ind i værtsorganismen. Derefter skal bakterien være i stand til at opformere sig inde i værten og danne toksiner, der er skadelige for værten.

    Fylogenien spiller en vigtig rolle, når man arbejder med bakterier, da det er vigtigt at kunne se, om en nyfundet bakterie er patogen eller ej. Man kan få kendskab til dette ved at analysere 16S rRNA-sekvensen af bakterien og finde placeringen i et fylogenetisk træ, for at se, om bakterien tilhører en gruppe af patogene bakterier.

    Fylogenien blandt prokaryoter kan altså benyttes til mere end at se, hvorfra de forskellige organismer stammer.

     

    5.1.3 Eukaryoter

    Ved at kigge på cellestrukturen for en prokaryot og en eukaryot, kan man se, at eukaryoten er meget mere kompleks i sin opbygning. I modsætning til den simple prokaryot indeholder den eukaryote celle en membranafgrænset cellekerne og organeller som mitokondrier. Ud fra fylogeni og fossilfund mener man, at den første eukaryot er opstået for omkring 2,1 milliarder år siden.

     

    5.2 Hvordan udnytter man diversiteten i bioteknologiindustrien?

    Ligesom der er stor diversitet mellem de tre domæner, er der også meget stor diversitet inden for hvert af domænerne. Det er en meget stor diversitet mellem alle bakterier, og der findes rigtig mange af dem. I et gram jord findes f.eks. op til 10 milliarder bakterier.

    De mange år, der er forløbet, har betydet en stor diversitet. Årsagen til dette er mutationer og genetisk rekombination samt at bakterierne har tilpasset sig bestemte nicher, der opfylder deres livskrav.

    Cellulaser har stor interesse for bioethanolindustrien, da bioethanol typisk fremstilles ved behandling af mindre nyttigt planteaffald med cellulose. For at finde cellulaseproducerende organismer har man forsøgt at identificere nicher, hvor det kunne være fordelagtigt for organismerne at kunne nedbryde cellulose. Det kunne for eksempel være på marker eller andre steder med meget planteliv. Termitter lever f.eks. af træ, og derfor fik en forsker ideen om at undersøge de bakterier, der lever i termittens mave. Denne forskning resulterede i opdagelse af nye cellulaseproducerende bakterier. Da cellulose er hovedkomponenten i planters cellevæg, måtte termitten være i stand til at nedbryde cellulose for at optage energi fra træet.

    Læs mere:

    Om termitter og deres gavn i bioethanolproduktion
    På denne hjemmeside er der et link til en film om termitter og cellulaser, som er rigtig god

  • Øvelser

    Der er to eksperimenter tilknyttet dette projekt. Se dem i menuen til venstre.

    Se lærervejledning her.

    Praktiske informationer:
    De enkelte eksperimenter er designet så de kan stå alene

    1. Evolutionseksperiment

    Det første eksperiment går ud på at illustrere evolution af jordbakterien Pseudomonas fluorescens når P. fluorescensdyrkes op i et statisk medie. Et statisk medie fører til at der opstår et heterogent miljø med forskellige oxygenkoncentrationer (høj oxygenkoncentration ved overfladen og lav oxygenkoncentration ved bunden). Der vil derved opstå mutanter med forskellige niche-specificiteter. Dette kan observeres via forskellige kolonimorfologier.

     

    Downloads

    Øvelsesvejledningen findes her.

    2. Isolering af nye cellulaseproducerende bakterier

    Novozymes har sponsoreret 1 million kr til køb af udstyr til dette eksperiment. Det har derfor tidligere været muligt at booke en kasse med højteknologisk udstyr.

    Forsøget går ud på at opsamle jordprøver fra området omkring gymnasiet. Fra jordprøven isoleres cellulaseproducerende bakterier ved en screening på specielle agarplader. Der laves PCR på bakteriernes DNA, hvor udvalgte gener opformeres. Hvis der isoleres en spændende ny bakterie kan man hjælpe Novozymes forskning ved at sende stammen ind. Projektets udførsel er beskrevet i øvelsesvejledningen.

    Projektet illustrerer en stor del af teorien i de tilknyttede artikler. Både gennem isoleringen af bakterier ved screening og opformering af DNA ved hjælp af PCR.

     

     

     

     

     

     

     

    Ved at trykke på ”Func. set” bag på kameraet kan du se kameraets indstillinger. Det skulle gerne se ud som på billedet.

    Er kameraet anderledes indstillet, ændres dette ved hjælp af navigationstasterne i cirklen rundt om ”Func. set”-knappen. Herefter trykkes på ”Func. set”, og kameraet er nu klar til brug.
    Når kameraet skal monteres på holderen, skal du bruge den lille plast-skrue, samt unbrako-nøglen.

    Kameraet skrues fast i holderen, så det sidder så højt oppe som muligt (skruehullet er aflangt). Stram ikke for hårdt med unbrakonøglen!

    Den kørte elektroforesegel lægges midt på transilluminatoren, og luftbobler presses forsigtigt ud. Lysintensiteten på transilluminatoren sættes på ”High”.

    Holderen med kameraet placeres oven på transilluminatoren, så lys ikke kan slippe ind ved kanterne for neden. Kameraet og transilluminatoren tændes. Zoom ind på gelen – billedet bliver dog af højest kvalitet hvis der ikke zoomes helt ind. Tryk udløseren halvt ned og lad kameraet fokusere, før du tager billedet.

    Af og til bliver lysmålerne ved med at blinke – se pilene på billedet. Tryk alligevel udløseren helt i bund, og kameraet vil i de fleste tilfælde tage et udmærket billede alligevel.

    Af og til bliver lysmålerne ved med at blinke – se pilene på billedet. Tryk alligevel udløseren helt i bund, og kameraet vil i de fleste tilfælde tage et udmærket billede alligevel.

  • Artikler mm.

    Fra halm til alkohol

    Forskere ved DTU og Novozymes arbejder målrettet på at udvikle bedre enzymer til nedbrydning af lignocellulose.

    [Foto: Colourbox].

     

    Evolutionslæren

    En artikel om Darwin, evolutionsteori og livets opståen.

     

    Livet skal sættes på stregkode

    Et internationalt forskningsprojekt skal forsøge at få styr på alverdens levende organismer ved hjælp af små ”DNA-stregkoder”.

     

    Jagten på generne

    En artikel, der illustrerer hvordan bioinformatikken bliver benyttet til daglig på center for biologisk sekvensanalyse, DTU.

     

    Artikler fra Ingeniøren

    Sygdomme driver menneskets evolution

    Naturlig selektion og sygdomme har haft langt større betydning for menneskets udvikling end hidtil antaget.

     

    Forskere intensiverer jagten på ukendt liv

    Undersøgelse af livet under havbunden fører til spørgsmålet, om livet kan være opstået under havbunden.

    [Foto: Colourbox]

  • Labtek videoer

    Laboratorieteknik

    Her ses forskellige videoer om laboratorieteknik.

    Se hvordan man arbejder sterilt

    Se hvordan man laver en renstrygning

    Se hvordan man bruger en pipette

    Se hvordan man laver gelelektroforese

  • Evolutionsforedrag af Paul Rainey

    Charles Darwin ville i år 2009 være fyldt 200 år, og det er præcis 150 år siden at grundstenen til moderne evolutionsbiologi blev lagt med udgivelsen af “Arternes Oprindelse”.

    I denne anledning afholdte den verdensførende evolutionsmikrobiolog Paul Rainey et spændende foredrag på DTU, som kan ses i videoplayeren nedenfor. Paul Rainey er fra Massey University, New Zealand. Titlen på forelæsningen er: ”The Evolution of Biological Complexity”.

    Professor Rainey tegner i denne forelæsning et billede af livets evolution med fokus på de store skift i udviklingen som f.eks. overgangen fra enkeltstående organismer til samfund af samarbejdende organismer.

    Foredraget er optaget på DTU den 18. februar 2009 og redigeret ned til 20 minutter af Biotech Academy.

  • Ordliste

    Herunder er en alfabetisk ordliste med forklaring til mange af de ord, der optræder i artiklerne, og som måske ikke er kendt på forhånd.

    Antibiotikaresistens
    Ved antibiotikaresistens forstås tolerance overfor antibiotika. Antibiotikaresistente bakterier kan dermed ikke slås ihjel med de pågældende antibiotika.

     

    Baseparing
    I DNA parrer A med T og C med G, mens der for RNA gælder, at A parrer med U og C med G. Baseparingen sker ved hydrogenbindinger mellem de forskellige baser i DNA- eller RNA-molekylet. DNA eksisterer som en dobbelthelix af to DNA-strenge, hvor baseparring sker mellem de to strenge (intermolekylært). RNA er enkeltstrenget og baseparring sker derfor mellem baser indenfor samme streng (intramolekylært), ved at RNA-strengen folder tilbage så molekylet i nogle områder bliver dobbeltstrenget.

     

    Biodiversitet
    Ved biodiversitet forstås mangfoldigheden af levende organismer.

     

    Cellulose
    Cellulose er et organisk stof sammensat af lange kæder af glukose ved hjælp af β-1,4-glucosidbindinger. Cellulose er hovedbestanddelen i planters cellevæg.

     

    Cellulase
    Cellulaser er enzymer, der spalter cellulose til glukoseenheder. Cellulaser virker normalt uden for cellerne, idet cellulose molekylet i modsætning til glukose er for stort til at blive optaget af cellerne.

     

    Denaturering
    Kemisk proces hvormed DNA eller proteiner mister sin rummelige struktur. Dette kan for eksempel ske ved udsætning for syre eller opvarmning. Hvis et protein mister sin rummelige struktur mister det sin funktion.  

     

    Det centrale dogme
    Informationsflowet går fra DNA til protein via mRNA. Dette betyder at DNA koder for RNA, som koder for protein. I enkelte tilfælde kan RNA kode for DNA for eksempel i en retrovirus som HIV, men protein koder aldrig tilbage til RNA eller DNA.

     

    Deletion
    Tab af et eller flere nukleotider i DNA.

     

    DNA-replikation
    Kopiering af DNA. En proces der katalyseres af enzymet DNA-polymerase.

     

    Enzym
    Et enzym er et protein med katalytisk aktivitet. Enzymer katalyserer de mange biokemiske processer i levende celler. En del enzymer bliver udskilt /sekreteret fra de levende celler, og virker udenfor cellerne.

     

    Essentielle gener
    Gener, der er nødvendige for at cellen kan overleve.

     

    Excision repair
    En reparationsmekanisme under DNA-replikation, som fjerner abnorme baser.

     

    Favoriseres
    Ved at bestemte organismer favoriseres menes, at de har en overlevelsesmæssig fordel i forhold til andre organismer.

     

    Frame-shift mutation
    Mutation som fører til ændring af læserammen.

     

    Fylogenetisk træ
    Illustration af evolutionære forhold i et diagram, hvor hvert punkt viser en opdeling.

     

    Fænotype
    Den måde hvorpå arveegenskaberne i kombination med miljøet kommer til udtryk i en organisme.

     

    Genetisk rekombination
    Genoverførsel mellem organismer.

     

    Genotype
    Arveegenskaberne i en organisme.

     

    Hydrogenbindinger
    Tiltrækningskræfter mellem et elektropositivt hydrogenatom og et elektronegativt atom (f.eks. oxygen).

     

    Insertion
    Indsættelse af et eller flere nukleotider i DNA.

     

    Inverted repeat
    Når to områder på RNA-strengen er komplementære, kan RNA-strengen folde tilbage og danne baseparring mellem de to områder. Dette kaldes inverted repeat.

     

    Konjugation
    Overførsel af genmateriale mellem to bakterier ved hjælp af plasmider.

     

    Krydset evolution
    (her) Genoverførsel mellem bakterier.

     

    Loop
    Hvis RNA-strengen danner en enkeltstrenget del som bliver sluttet sammen igen ved inverted repeat.

     

    Læserammer
    De tre måder, hvorpå en enkelt DNA-streng kan læses, da den genetiske information bliver læst i blokke af tre basepar.  

     

    Mismatch repair
    En reparationsmekanisme under DNA-replikation, som tjekker at alle baserne passer sammen.

     

    Missense mutation
    Mutation i gen som fører til ændring af en aminosyre i det protein genet koder for.

     

    Messenger RNA, mRNA
    RNA der koder for proteiner. mRNA bringer koden for proteiner fra arvematerialet til cytoplasmaet.

     

    Mutagener
    Stoffer, der forårsager mutationer.

     

    Mutationer
    Ændring af en eller flere baser i DNA-arvematerialet.

     

    Niche
    Ved en niche forstås et miljø bestående af faktorer, der er afgørende for, at en bestemt art kan overleve.

     

    Nonsense mutation
    Mutation i gen som resulterer i et stopkodon og dermed medfører, at translationen stopper før tid.

     

    Nukleotider
    Byggesten i DNA eller RNA Nukleotider består af en sukkerenhed, en phosphatgruppe og en af baserne A (adenin), C (cytosin), G (guanin), T (thymin) og U (uracil), hvor T kun findes i DNA og U kun findes i RNA. Sukkerenhederne i DNA-nukleotiderne er deoxyribose mens de består af ribose i RNA-nukleotiderne.

     

    Plasmider
    Genelementer, der eksisterer frit inde i bakterieceller. Typisk små og cirkulære.

     

    Primer
    Et kort stykke RNA eller DNA, der fungerer som udgangspunkt for DNA-replikation. En primer er nødvendig for DNA-replikation , da de involverede enzymer kun kan tilsætte nukleotider til en allerede eksisterende nukleotid-streng. I PCR benyttes syntetisk fremstillede primere, der er specifikke for den DNA-sekvens, der ønskes opformeret.

     

    Ribosomal RNA, rRNA
    RNA, der indgår i ribosomer. Findes i forskellige typer f.eks 16S i prokaryoter og 18S i eukaryoter.

     

    Sekventering
    Sekventering er opklaring af basernes rækkefølge i DNA eller RNA.

     

    Silent mutation
    Mutation i gen som ikke fører til nogen ændring af aminosyrer i det protein genet koder for.

     

    Subunit
    Et enkelt molekyle, som i samspil med andre molekyler udgør en funktionel enhed. Bruges typisk om proteiner (enzymer), der kan bestå af 2 eller flere forskellige proteiner, der tilsammen udgør det aktive enzym. Bruges også om ribosomer (stor og lille subunit).

     

    Toxiner
    Giftstoffer. Stoffer der er skadelige for nogle celler.

     

    Transduktion
    Overførsel af DNA fra en bakteriecelle til en anden ved hjælp af en bakteriofag (viruspartikel).

     

    Transformation
    En bakteries optag af frit DNA fra det omkringliggende miljø.

     

    Transkription
    Processen hvor DNA-strengens sekvens omskrives til RNA. Produkter fra transkription kan være mRNA, rRNA og tRNA.  

     

    Translation
    Processen hvor mRNA sekvensen oversættes til protein. Translation er en kompliceret enzymatisk process, der katalyseres af ribosomet.

     

    Van der Waals kræfter
    Tiltrækningskræfter mellem to hydrofobe molekyler.

null

Projektet er udarbejdet af Juliane C. Thøgersen. Juliane er færdig som civilingeniør i Bioteknologi fra DTU.

Juliane C. Thøgersen

null

Hans Henrik Stærfeldt er ansat ved Center for biologisk sekvensanalyse, DTU. Hans Henrik har været sparringspartner på denne artikel.

Hans Henrik Stærfeldt

null

Preben Nielsen er science manager på Novozymes. Preben har været med til udviklingen af dette undervisningsprojekt og især forsøget Isolering af cellulaseproducerende bakterier.

Preben Nielsen