Enzymers rolle i brødbagning

I en levende organisme foregår mange komplicerede reaktioner, som uden hjælp af en biologisk katalysator ville gå alt for langsomt til, at man ville kunne opretholde de nødvendige livsprocesser. Katalysatorerne udgøres i en organisme især af enzymer, der øger hastigheden af kemiske reaktioner uden selv at blive forbrugt.

Enzymers specificitet

Enzymer, der er proteiner, er meget specifikke mht. hvilke reaktioner, de katalyser, og hvilke substrater de binder. Specificiteten opstår på grund af den tredimensionelle form og struktur af enzymet og dets aktive center. Enzymets aktive center er det sted, hvor katalytiske grupper, der kan bryde eller danne bindinger, befinder sig, og hvor substratet bindes. Hvis man kigger på hele enzymet, udgør det aktive center kun en meget lille del (6-12 aminosyrer) (Fig. 4), men det betyder ikke, at den resterende del af enzymet kan undværes. Tværtimod. Udformningen af det aktive center, de substrater, der bindes, samt de reaktioner, der katalyseres, er stærkt afhængige af hele enzymets opbygning.

Figur 4. Det aktive center er markeret med blåt. Som det ses, udgør det kun en meget lille del af enzymet. Enzymet er fordøjelsesenzymet trypsin. Den lilla struktur (et peptid) er et fragment af et større protein.

Figur 5. Enzymet har en specificitet overfor substratet, sammenligneligt med hvordan kun en specifik nøgle (substratet) passer i en lås (enzymet).

Figur 6. Ved binding til et substrat ændrer enzymet sin konformation, hvilket kaldes et induced fit. Når substrat / produkt løslades, ændres enzymets konformation tilbage.

Dannelse af ES-kompleks

Når et substrat bindes til det aktive center på et enzym, dannes et såkaldt enzym-substrat-kompleks (ES-kompleks). Binding af substrat til det aktive center kan finde sted på tre forskellige måder, nemlig ved hydrogenbindinger, ved elektrisk tiltrækning eller frastødning og ved hydrofobiske vekselvirkninger.
De kræfter, der holder enzymer og deres substrater sammen, er forholdsvis svage og virker kun, hvis enzymet og substratet passer godt sammen. Af denne grund passer enzym og substrat tit sammen som en nøgle i en lås (Fig. 5).

Da et enzym imidlertid ikke er en fast struktur, men er forholdsvis fleksibel, sker det dog oftere, at enzymet ændrer form ved binding af substrat. Dette fænomen kaldes induced fit og er illustreret i Figur 6. Substratet ændrer ofte også form.

Ændringen i enzymets form medfører, at substratet og enzymet passer bedre sammen, og at substratet og det aktive center kommer i tæt kontakt med hinanden. Derudover kan ændringen også bruges til f.eks. at holde vand ude af det aktive center, så den reaktion, der skal katalyseres, kan forløbe uden problemer. Begge dele er tilfældet for den gruppe af enzymer, der hedder kinaser (fosfatoverførende transferaser). Disse enzymer overfører fosfatgrupper fra molekyler med højt fosfatgruppe-overførselspotentiale, som f.eks. ATP, til substrater ved en reaktion, som kaldes fosforylering. Hvis der er vand til stede ved disse reaktioner, er der en stor sandsynlighed for, at fosfatdonor-molekylerne vil hydrolyseres, og der vil i så fald ikke blive overført en fosfatgruppe til substratet.

Figur 7. Exergone og endergone reaktioner.
A: I en exergon reaktion vil reaktanterne opføre sig som en kugle, der ruller ned ad en bakke. Der vil frigives energi.
B: I en endergon reaktion skal der tilføres energi. En kugle ruller ikke op ad en bakke af sig selv.

Kemiske reaktioner og spontanitet

Ved de fleste kemiske såvel som biokemiske reaktioner, vil der enten frigives eller skulle tilføres energi. En reaktion, hvor der frigives energi, en såkaldt exergon reaktion, kan opfattes som en kugle, der ruller ned ad en bakke. Det er noget, der sker spontant, dvs. af sig selv (Fig. 7A). Omvendt vil en reaktion, der kræver energitilførsel – en endergon reaktion, ikke være spontan. På samme måde som en kugle ikke af sig selv ruller op ad en bakke (Fig. 7B).

Det, der har betydning for, om en reaktion er spontan eller ej (exergon eller endergon), er energiindholdet – også kaldt Gibbs fri energi (G), i henholdsvis reaktanterne og produkterne i reaktionen. Denne energi afhænger især af de bindinger, der findes i molekylerne, og de vil som regel ikke være ens for reaktanter og produkter i den samme reaktion. Når der foregår en reaktion, sker der således enten et fald eller en stigning i den fri energi.
Ændringen i den fri energi (∆G) ved en reaktion er givet som den fri energi i produkterne (G_produkter) minus den fri energi i reaktanterne (G_reaktanter):

ΔG = G_produkter– G_reaktanter

Hvis reaktanternes fri energi er større end produkternes (∆G < 0), betyder det, at der frigives energi ved reaktionen, og at den er spontan. Omvendt vil en stigning i fri energi (∆G > 0), dvs. en reaktion, hvor produkternes energiindhold er større end reaktanternes, betyde, at reaktionen ikke forløber spontant, men kræver energitilførsel. Se Figur 8. Det giver god mening; for at få noget med et større energiindhold, er man nødt til at tilføre energi. Og omvendt.

Figur 8. Spontane og ikke spontane reaktioner.

Figur 9. Kuglen ligger nu i en lille fordybning. For at den kan rulle ned ad bakken, er det nødvendigt med et energi-input.

Ændringen i fri energi (∆G) fortæller altså, om reaktionen er spontan eller ej. Den siger imidlertid intet om, hvordan reaktionen forløber, eller hvor hurtigt det går.

Aktiveringsenergi E_a

Selvom en reaktion er spontan, kræves der ofte et input af energi, før den går i gang. Dette input kaldes aktiveringsenergien E_a.

Hvis vi vender tilbage til kuglen på toppen af bakken (Fig. 7A) er der ingen tvivl om, at kuglen vil rulle ned. Eneste problem er blot, at kuglen nu ligger i en lille fordybning (Fig. 9). For at kuglen kan rulle ned ad bakken, skal den op af fordybningen, hvilket kræver et energi-input.

Det samme gør sig gældende ved kemiske reaktioner, hvor reaktanterne skal over en energibarriere, før reaktionen forløber. Aktiveringsenergien tilfører reaktanterne energi, hvilket medfører, at de passerer energibarrieren og befinder sig på en mere ustabil form. Dette er en overgangstilstand, der kaldes transition state.

I Figur 9 ses det, at lige før kuglen ruller ned, har den en højere fri energi, end da den lå i fordybningen, hvilket skyldes den tilførte energi. Det samme gælder molekyler i overgangstilstanden (transition state). De har her højere fri energi end både reaktanter og produkter (Fig. 10).

Ændringen i fri energi (∆G) for reaktionen er uafhængig af aktiveringsenergien (E_a) samt af molekylernes fri energi, når de er i transition state. Ændringen afhænger udelukkende af den fri energi for reaktanter og produkter. I forhold til ændringen i fri energi er aktiveringsenergien normalt ikke særlig stor.

Enzymers virkemåde

Enzymer øger reaktionshastigheden ved at sænke substratets aktiveringsenergi (E_a), hvilket er det samme som at lette overgangen til transition state. Selvom aktiveringsenergien er mindre i en enzymkatalyseret reaktion, er ændringen i fri energi (∆G) ved reaktionen den samme (Fig. 11). Som nævnt afhænger ∆G kun af den fri energi i reaktanter og produkter. Den er uafhængig af om reaktionen er enzymkatalyseret eller ej.

Figur 10. Energiforløb for en proces, der passerer en overgangstilstand. Aktiveringsenergi (E_a) og ændring i fri energi (ΔG) er vist.

Ved dannelsen af et ES-kompleks er der forskellige katalytiske mekanismer, der kan bevirke, at aktiveringsenergien bliver mindre, og reaktionen får lettere ved at forløbe. Et par af dem er beskrevet nedenfor.

I det tilfælde, hvor der er to substrater, der skal reagere med hinanden, er det oftest enzymets rolle at bringe de to i kontakt med hinanden og orientere dem rigtigt, således at de atomer, mellem hvilke der skal dannes nye bindinger, føres sammen (Fig. 12). Dette er måske den mest simple mekanisme, hvorved et enzym kan katalysere en reaktion.

Aktiveringsenergien kan også mindskes, ved at de eksisterende bindinger i substratmolekylerne gøres ustabile, hvorved overgangen til transition state fremmes. Der findes enzymer, som gør dette ved at strække eller vride substratmolekylerne (Fig. 13). Det er f.eks. det, man ser ved induced fit, hvor enzym og substrat ændrer form, når ES-komplekset dannes.

Figur 11. Enzymer sænker aktiveringsenergien, og katalyserer derved biokemiske reaktioner.

Figur 12. Enzymet orienterer de to substrater rigtigt i forhold til hinanden så de nemmere kan reagere. Dette medfører en sænking af aktiveringsenergien.

Figur 13. Enzymet belaster substratmolekylet, så de eksisterende bindinger bliver ustabile. Dette medfører en sænking af aktiveringsenergien, da mindre energi skal til for at bryde bindingerne i substratet.

Fjernelse eller tilførsel af protoner (H⁺) destabiliserer også substratmolekylernes bindinger, der herved bliver lettere at bryde. Det sker ved syre-base katalyse, hvor sure eller basiske sidekæder på aminosyrerne i enzymets aktive center fjerner eller overfører protoner (Fig. 14).

Oxidoreduktaser indeholder typisk metalioner som co-faktorer. Her udnyttes metalioners evne til at optage og afgive elektroner uden at metalionerne frigøres fra enzymet. Som ved syre-base katalyse vil fjernelse eller tilførsel af elektroner til substratmolekylerne kunne destabilisere eksisterende bindinger og fremme dannelse af nye.

Enzymkinetik

Ordet kinetik stammer fra det græske ord kineein, der betyder bevæge. I forbindelse med kemi og biologi handler det om, hvordan molekyler bevæger sig, hvordan de støder ind i hinanden, og hvordan dette kan resultere i, at der sker en reaktion. Beskæftiger man sig med enzymkinetik, undersøger man enzymers reaktionshastigheder, der typisk udtrykkes ved den omdannede stofmængde af produktet pr. sekund. Ud fra reaktionshastighederne er man i stand til at beskrive enzymernes aktivitet og udtale sig om andre vigtige kendetegn ved de enzymkatalyserede reaktioner.
I forbindelse med anvendelsen af enzymer i fødevareproduktion har enzymernes aktivitet bl.a. stor betydning for, hvor meget enzym der skal tilsættes.

Figur 14. Enzymet destabiliserer bindingerne i substratmolekylet ved at give det ladninger.

Michaelis-Menten modellen

Beskæftiger man sig med enzymkinetik, vil man ofte benytte Michaelis-Menten modellen. Denne model er forholdsvis simpel og gør rede for de kinetiske karateristika af de fleste enzymkatalyserede reaktioner.

Generelt forestiller man sig, at omdannelsen af et substrat til produkt sker via to trin:

1. Dannelse af ES-kompleks (binding af substrat til enzym).
2. Omdannelse af substrat til produkt og frigørelse af produkt fra enzym.

Dette kan beskrives ved hjælp af følgende reaktion:

Reaktion 1:

$E+S \rightleftharpoons ES \overset{k_2}{\rightarrow} E+P$

Et substrat (S) bindes til et enzym (E) og danner et ES-kompleks (ES). Dette sker med hastighedskonstanten k_1:

Reaktion 2:

$E + S \oversett{k_1}{\rightarrow}ES$

Nu kan der så ske én af to ting. Enten vil enzymet og substrat gå fra hinanden igen (dissocieres) – dette vil ske med hastighedskonstanten k_-1:

Reaktion 3:

$ES\overset{k_{-1}}{\rightarrow}E+S$

Eller også vil reaktionen fortsætte, og der vil dannes produkt (P) med hastighedskonstanten k₂:

Reaktion 4:

$ES\overset{k_2}{\rightarrow}E+P$

Reaktion 2, 3 og 4 er opsummeret i reaktion 1. Idet reaktion 2 og 3 er hinandens modsætninger, er disse skrevet med en ligevægtspil i reaktion 1.

Dannelsen af ES-komplekset (reaktion 2) sker som regel hurtigt, hvorimod selve dannelsen af produkt (reaktion 4) er langsommere, og derfor kaldes dette det hastighedsbestemmende trin.

Modellen herover er den simpleste model, der gør rede for de kinetiske karakteristika af de fleste enzymkatalyserede reaktioner. Den kaldes Michaelis-Menten modellen opkaldt efter tyskeren Leonor Michaelis og canadieren Maud Menten, der fremsatte den i 1913. Det særlige ved denne model er, at ES-komplekset fungerer som et intermediat i reaktionen.

Michaelis-Menten ligningen

Ud fra Michaelis-Menten modellen og en antagelse om, at koncentrationen af ES-kompleks er konstant, kan man opskrive et matematisk udtryk, der beskriver, hvordan hastigheden af reaktionen – dvs. omdannelsen af substrat til produkt, afhænger af koncentrationerne af substrat og enzym samt af hastighedskonstanterne i de forskellige trin i reaktionen.
Dette udtryk kaldes Michaelis-Menten ligningen, og ser ud som følger:

Ligning 1:

$v_0 = V_{max}\cdot\frac{[S]}{[S]+K_M}$

Michaelis-Menten ligning beskriver initialhastigheden hvormed enzymet arbejder, V₀, som en funktion af substratkoncentrationen, [S]. Jo mere substrat der er til stede, des højere vil initialhastigheden være.

Derudover indgår to parametre: Michaelis-Menten konstanten, K_M er givet som:

Ligning 2:

$K_M=\frac{k_{-1}+k_2}{k_1}$

Og V_max, den maximale hastighed der kan nås med den gældende mængde af enzymer til stede:

Ligning 3:

$V_{max}=k_{cat}\cdot[E]_0$

Hvor k_cat er det samme som k₂, og [E]₀ er enzymkoncentrationen til stede, når substratet tilsættes.

V_maxer den enzymaktivitet der nås, når samtlige aktive sites, på alle enzymer, er bundet til substrat.

De to parametre, sammen med k_cat, bruges til at beskrive hvordan et enzym opfører sig. K_M beskriver enzymets affinitet for substratet. Mere præcist, så er K_M den substratkoncentration, hvor V₀= ½ V_max(se figur 15 og nedenstående afsnit). Dette afspejler hvor effektivt substratet kan binde til enzymet. Hvis K_M-værdien er lav, så har enzymet og substratet en høj affinitet, da meget lidt substrat skal til for at mætte enzymerne. Tilsvarende afspejler k_catog V_max hvor effektivt ES-komplekset er til at omdanne substratet til produkt. En høj k_catindikerer at enzymet på meget kort tid omdanner substrat til produkt.

En detaljeret udledning af Michaelis-Menten ligningen er beskrevet i Biotech Academy projektet “Alkohol og stoffer”, i teoriafsnittet “Alkohols nedbrydning i kroppen”.

Figur 15. V₀ som funktion af substratkoncentration [S]. En fortolkning af parametrene K_Mog V_maxer illustreret. Se brødtekst for detaljer.

Ved lav substratkoncentration, dvs., når [S] << K_M, vil hastigheden af reaktionen være proportional med substratkoncentrationen:

$v_0=\frac{V_{max}}{K_M\cdot[S]}$

Når substratkoncentrationen bliver meget højere end K_M ([S] >> K_M) fås:

$v_0=V_{max}$

I denne situation er reaktionshastigheden uafhængig af substratkoncentrationen.

I det specielle tilfælde, hvor substratkoncentrationen er lig Michaelis-Menten konstanten ([S] = K_M) fås:

$v_0 = \frac{1}{2}\cdotV_{max}$

I mange enzymkatalyserede reaktioner indgår der mere end et substrat eller enzymet har mere end et aktivt center. I så fald kan man ikke benytte Michaelis-Menten modellen og ligningen beskrevet ovenfor. Man må da tage andre mere omfattende midler (modeller og ligninger) i brug.

Betydningen af K_M og V_max
Michaelis-Menten konstanten K_M har enheden mol pr. liter (M), og ligger typisk mellem 10^-1 og 10^-7 M. Den afhænger af flere forskellige faktorer som f.eks. temperatur og pH.
Idet, at K_M er den koncentration af substrat, hvor halvdelen af enzymmolekylernes aktive centre er fyldte, og reaktionshastigheden er halvdelen af V_max, kan K_M bruges som et mål for, hvor høj substratkoncentrationen skal være, for at man opnår en acceptabel reaktionshastighed.

Hvis hastigheden, hvormed enzymet og substratet dissocieres, er meget større end hastigheden, hvormed der dannes produkter (k_-1>>k₂), kan K_M skrives som:

$K_M=\frac{k_{-1}}{k_1}$

I dette tilfælde er Michaelis-Menten konstanten K_M lig med dissociationskonstanten for ES-komplekset. En høj K_M-værdi fortæller, at k₁ er mindre end k_-1, hvilket vil sige, at der er en svag binding mellem enzymet og substratet, og der er en stor sandsynlighed for at ES-komplekset opløses. Omvendt fortæller en lav K_M-værdi, at der er en stærk binding mellem substrat og enzym.

Men husk: K_M kan kun bruges til at sige noget om affiniteten mellem enzymet og substratet, hvis k_-1 er meget større end k₂.

Den enzymkatalyserede reaktions maksimale hastighed V_max angiver antallet af substratmolekyler, der omdannes af enzymet til produkt pr. tidsenhed, hvis enzymet er mættet. V_max er ligesom K_M afhængig af temperatur og pH. V_max ligger normalt mellem 1 og 10⁴ substratmolekyler pr. sekund.

Simpel bestemmelse af K_M og V_max
Hvis en enzymkatalyseret reaktion kan beskrives vha. Michaelis-Menten ligningen, og hvis reaktionshastighederne er målt ved forskellige kendte substratkoncentrationer, bruges specielle computerprogrammer til at bestemme Michaelis-Menten konstanten K_M samt den maksimale reaktionshastighed V_max. Man kan ikke umiddelbart bestemme de forskellige hastighedskonstanter, der indgår i K_M.
Det er dog også muligt i hånden at bestemme K_M og V_max ud fra de samme data eller vha. et mere simpelt program som f.eks. Microsoft Excel. Først skal Michaelis-Menten ligningen dog omskrives. Dette gøres ved først at dividere brøken med [S] i både tæller og nævner:

$v_0 = V_{max}\cdot\frac{[S]}{[S]+K_M} \leftrightarrow v_0=V_{max}\cdot\frac{1}{1+\frac{K_M}{[S]}}$

Så tages den reciprokke værdi på begge sider:

Ligning 4:

$\frac{1}{v_0}=\frac{1}{V_{max}}+\left(\frac{K_M}{V_{max}}\right)\cdot\frac{1}{[S]}$

Det ses, at denne ligning er på formen $y = ax + b$

Dvs. plottes 1/v₀ som funktion af 1/[S] fås en ret linje med hældningen K_M/V_max, der skærer y-aksen i 1/V_max og x-aksen i 1/K_M. Et sådan plot kaldes et Lineweaver-Burk plot eller et dobbelt reciprokt plot. Plottet er vist i figur 16.