Enzyminhibering: Medicinsk brug af alkohol

Denne underside udgør fjerde del af teorien for Biotech Academys materiale om Alkohol og enzymkinetik.

I “Enzymatisk nedbrydning af alkohol” blev det beskrevet, hvordan alkohol nedbrydes i den menneskelige krop, når vi indtager det. Det viser sig, at viden om ethanols nedbrydning ved hjælp af enzymet alkoholdehydrogenase kan være yderst brugbar, når man skal behandle forgiftninger forårsaget af andre alkoholer, ofte methanol/træsprit. Det princip, der her udnyttes, kaldes inhibering. Princippet vil blive beskrevet nedenfor.

Enzyminhibering

Enzymers aktivitet er ikke nødvendigvis konstant og kan derfor godt blive påvirket af andre kemiske stoffer. Et eksempel er, når et fremmed molekyle kommer ind i processen og på den ene eller anden måde nedsætter enzymets aktivitet. Et sådant molekyle kaldes en enzyminhibitor. Nedsat aktivitet vil for enzymets vedkommende sige, at reaktionen med et substrat enten forløber langsommere, eller at der skal større koncentrationer af substrat til for at få reaktionen til at forløbe. Enzyminhibitorer findes naturligt i kroppen og cellerne bruger dem til at regulere forløbet af forskellige reaktioner og kredsløb i kroppen. Rigtig mange medicinalprodukter fungerer desuden som inhibitorer over for forskellige enzymer. Et eksempel er ritonavir, der sælges under navnet Norvir. Ritonavir bruges til at behandle HIV/AIDS-patienter, idet det fungerer som inhibitor over for enzymet HIV-protease, der er vitalt for virussets livscyklus.

Der findes overordnet to typer enzyminhibitorer – reversible og irreversible. Forskellen på de to er, at de irreversible inhibitorer reagerer direkte med enzymet og derved omdanner det, mens de reversible blot indgår i et kompleks med enzymet, substratet eller begge. Irreversible inhibitorer deaktiverer således enzymet permanent, i modsætning til de reversible.

I denne artikel er det kun reversibel inhibering, der vil blive behandlet. Man taler normalt om tre typer reversible enzyminhibitorer: kompetitive inhibitorer, unkompetitive inhibitorer og nonkompetitive inhibitorer.

Kompetitive inhibitorer

Et molekyle, der fungerer som kompetitiv inhibitor, vil konkurrere med substratet om det samme aktive site på enzymet. Da kun ét molekyle, enten substrat eller inhibitor, kan binde til det aktive site ad gangen, er det enzymets affinitet over for substratet og inhibitoren samt koncentrationerne af disse, der afgør, hvor meget af henholdsvis substrat eller inhibitor, der binder.

En kompetitiv inhibitor vil oftest ligne substratet meget, da det skal kunne binde til samme aktive site. I nogle tilfælde kan inhibitoren også omdannes af enzymet, i andre tilfælde kan det blot binde til enzymet.

Figur 6. Kompetitiv inhibering. Et rødt substrat nærmer sig enzymet, men en blå kompetitiv inhibitor kommer i forkøbet, så komplekset i stedet dannes mellem enzym og inhibitor.

Kompetitiv inhibering ændrer ikke enzymreaktionens maksimalhastighed (V_max,), men forøger værdien af Michaelis-Menten-konstanten (K_M). For at forklare dette via Michaelis-Menten-kinetik, skal der introduceres et nyt element. Husk på, at K_M er et udtryk for enzymets bindingsaffinitet over for substratet. Vi indfører nu konstanten K_i, der et udtryk for enzymets bindingsaffinitet over for inhibitoren. Konstanten defineres på følgende måde:

Ligning 18:

$K_i = \frac{[E] \cdot [I]}{[EI]}$

Som netop beskrevet er effekten af at anvende en kompetitiv inhibitor, at reaktionens K_M-værdi øges, hvilket betyder, at der skal bruges mere substrat for at opnå samme reaktionshastighed. Denne nye værdi af K_M kaldes for $K_{M}^{app}$ – app står for apparent (engelsk for tilsyneladende/effektiv) og defineres på følgende måde:

Ligning 19:

$K_{M}^{app} = K_M \cdot (1 + \frac{[I]}{K_i})$

Denne værdi beskriver altså den K_M-værdi, en reaktion har, når der samtidig er en kompetitiv inhibitor med en bindingsaffinitet K_i til stede. Bemærk, at man kan overkomme (dvs. ophæve effekten af) en kompetitiv inhibitor, hvis blot man tilsætter nok substrat.

Nonkompetitive inhibitorer

En nonkompetitiv inhibitor kan binde sig til det frie enzym, og danne et EI-kompleks eller binde sig til ES-komplekset, se figur 7. Inhibitoren binder et andet sted på enzymet end substratet og kan altså binde uafhængigt af dette. Det betyder at der hele tiden vil være en del af enzymerne, som er bundet til en inhibitor og derfor ikke er tilgængelige for reaktionen. Dette betyder med andre ord at den effektive koncentration af enzymet bliver mindre, og dermed at maksimalhastigheden V_max reduceres, og i stedet kan beregnes som:

Ligning 20:

$V_{max}^{app} = \frac{V_{max}}{1} + \frac{[I]}{K_i}$

Dette udtryk beskriver altså den maksimalhastighed V_max^app reaktionen har, når en nonkompetitiv inhibitor er til stede. Ved non-kompetitiv inhibering påvirkes K_M ikke.

I modsætning til kompetitiv inhibering kan nonkompetitiv inhibering ikke overkommes ved at tilsætte mere substrat. Dette skyldes at andelen af enzymer der binder til inhibitoren ikke påvirkes af koncentrationen af substratet, da inhibitor og substrat binder to forskellige steder på enzymet.

Figur 7. Non-kompetitiv inhibering. Et enzym har to mulige skæbner ved nonkompetitiv inhibering. Det kan enten indgå i et kompleks med et rødt substrat med bindingsaffiniteten K_M, hvorefter den non-kompetitive inhibitor (blå) binder sig til det dannede ES-kompleks med bindingsaffiniteten K_i. Alternativt kan processen foregå ved at inhibitoren først indgår i et kompleks med enzymet, og substratet derefter binder sig til EI-komplekset. Fælles for der to tilfælde er at enzymet ikke er funktionelt så længe der er en inhibitor bundet.

Unkompetitive inhibitorer

Hvis et molekyle fungerer som unkompetitiv inhibitor, vil det kun binde sig til det kompleks, der bliver dannet mellem substratet og enzymet. Når inhibitoren binder til komplekset, dannes ikke noget produkt, komplekset stabiliseres, og reaktionen fuldendes ikke. Altså øges affiniteten for substratet, der derfor ikke slippes. Det kan også betragtes som en kemisk ligevægt:

Dette betyder, at den maksimale reaktionshastighed, V_max, vil sænkes, da der hele tiden vil være en mængde ESI-komplekser, der ikke kan katalysere reaktionen. Samtidig sænkes K_M, idet noget substrat er optaget i ESI-komplekset. Inhiberingen kan dog ikke påvirkes eller overkommes ved at tilsætte mere substrat, idet inhibitor og substrat ikke binder samme sted på enzymet.

Figur 8. Et rødt substrat indgår i et ES-kompleks med enzymet, men en blå unkompetitiv inhibitor introduceres, og der dannes derfor et ESI-kompleks bestående af alle tre molekyler.

Lineweaver-Burk-plot

Ofte har man en inhibitor, uden man ved, hvilken type, den er. Det kan man finde ud af ved at lave en grafisk afbildning.

De tre inhiberingstyper påvirker en reaktion på hver deres karakteristiske måde.

Kompetitiv inhibering: Reaktionens K_M-værdi øges, mens V_max ikke påvirkes.
Nonkompetitiv inhibering: Reaktionens V_max-værdi sænkes, mens K_M ikke påvirkes.
Unkompetitiv inhibering: V_max og K_M sænkes begge, således at forholdet V_max/K_M holdes konstant.

For at opnå en grafisk afbildning hvor man let kan identificere de forskellige inhiberingstyper, omskrives den oprindelige Michaelis-Menten-ligning. Ved at tage den reciprokke på begge sider af lighedstegnet fremkommer den såkaldte Lineweaver-Burk-ligning, der anvendes til at lave et Lineweaver-Burk-plot. Omskrivningen af Michaelis-Menten-ligningen ser ud som følger:

Ligning 16 (Michaelis-Menten ligningen) :

$V_0 = V_{max} \cdot \frac{[S]}{[S] + K_M}$

Ligning 21 (Lineweaver-Burk):

$\frac{1}{V_0} = \frac{K_M}{V_{max}} \cdot \frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{max}}$

Lineweaver-Burk-ligningen ses som en lineær funktion af formen y = a ∙ x + b, hvor x svarer til 1/[S] og y svarer til 1/V0. Dette medfører at hældningena = K_M/V_max, og skæringspunktet med y-aksen, b = 1/V_max. Fordi sammenhængen mellem 1/V₀ og 1/[S] er lineær, er den forholdsvis let at analysere. I en lineær funktion vil a udgøre den rette linjes hældning og b vil udgøre linjens skæring med y-aksen. Plottes Lineweaver-Burk-ligningen som 1/V₀ som funktion af 1/[S], vil det derfor se ud som vist i figur 9:

Figur 9. Lineweaver-Burk ligningen er afbildet grafisk. På x-aksen er 1/[S] og på y-aksen er 1/V_0. Der vil være en lineær sammenhæng mellem de to.

Ud fra Lineweaver-Burk plottet er det således ret let at aflæse såvel V_max, som K_M-værdien for enzymet:

Skæringen med y-aksen er lig 1/V_max.
Skæringen med x-aksen er lig -1/K_M.

I Lineweaver-Burk plottet kan man tydeligt skelne mellem de forskellige inhiberingstyper blot ved at kigge på deres grafiske afbildning. Hvis man plotter en enzymreaktion uden brug af en inhibitor og derefter plotter samme reaktion blot med brug af en inhibitor, vil man kunne se, om den anvendte inhibitor er kompetitiv, unkompetitiv eller nonkompetitiv. De forskellige inhiberingstyper vil komme til udtryk på følgende måder:

Kompetitiv inhibering: Den linje, som opnås ved at indtegne 1/V₀ som funktion af 1/[S], vil skære y-aksen samme sted, som linjen for den ikke-inhiberede reaktion. Dette skyldes, at V_max-værdien for en reaktion ikke ændres ved kompetitiv inhibering. Dog vil hældningen og skæringen med x-aksen være anderledes end ved den normale enzymreaktion, da K_M-værdien øges.
Nonkompetitiv inhibering: Den linje, som opnås ved at indtegne 1/V₀ som funktion af 1/[S], vil skære x-aksen samme sted, idet K_M-værdien ikke ændres ved nonkompetitiv inhibering. Både skæringen med y-aksen og grafens hældning vil dog ændres.
Unkompetitiv inhibering: Den linje, som opnås ved at indtegne 1/V₀ som funktion af 1/[S], vil have forskellige værdier for både skæringen med x-aksen såvel som y-aksen. Men hældningen vil være den samme, da K_M/V_maxikke ændres.

Figur 10. De forskellige inhiberingstyper afbildet i et Lineweaver-Burk-plot.

Alkohol som kompetitiv inhibitor

Det blev tidligere gennemgået, hvordan ethanol i kroppen, som første skridt i dets nedbrydning, binder sig til det aktive site på enzymet alkoholdehydrogenase (ADH) og derved bliver omdannet til ethanal. En anden alkohol, methanol/træsprit bliver også nedbrudt ved at binde sig til det aktive site på ADH men bliver modsat ethanol nedbrudt til formaldehyd og derefter til format (som er den korresponderende base til myresyre). Format er ekstremt giftigt for mennesker, og en så lille dosis som 10 mL ren methanol kan forårsage permanent blindhed mens 100 mL er en dødelig dosis. Der går dog typisk et par timer, fra man indtager methanol, til de giftige virkninger indtræffer, og man kan derfor ofte nå at give den forgiftede person en modgift.

Et stof, der kan fungere som modgift mod methanolforgiftning, er ethanol! Metoden er simpel, og teorien bag er faktisk allerede blevet gennemgået. Da både ethanol og methanol, for at blive nedbrudt i leveren, skal binde sig til det aktive site på ADH, vil de to stoffer konkurrere om denne plads, idet kun et af dem vil kunne reagere ad gangen. Giver man ethanol til en methanolforgiftet person, vil ethanolen derfor fungere som kompetitiv inhibitor og binde sig til en stor del af ADH-enzymerne. Da ADH har langt større affinitet for ethanol end methanol, vil dette forøge K_M-værdien for nedbrydningen af methanol væsentligt, hvilket betyder at nedbrydningen forløber langsommere. Methanol vil derved nedbrydes så langsomt, at det giftige format kun vil være i kroppen i koncentrationer under det toksiske niveau, fordi det så kan blive udskilt løbende.

Ethanol kan også fungere som kompetitiv inhibitor over for andre farlige stoffer, der nedbrydes af ADH. Et eksempel er ethylenglycol, der ofte bruges som antifrostvæske. Da ethylenglycol ofte er tilsat en blå farve og smager sødt, sker det jævnligt at små børn drikker det.

Alkohol – gift eller modgift?

I artikel 1. Hvad er et stof? blev det beskrevet, hvordan et stof kan have mange forskellige virkninger afhængig af dets anvendelse, koncentration og omgivelser. Alkohol er i virkeligheden et godt eksempel herpå, da det i høj grad er mangefacetteret: Det kan virke opstemmende og som en social isbryder i mindre koncentrationer. Det kan have ubehagelige korttidseffekter på kroppen ved lidt større koncentrationer (tømmermænd). Det kan have enorme konsekvenser for enkeltpersoner og familier i store koncentrationer og over lang tid (alkoholisme). Faktisk kan det inden for kort tid være dødeligt, hvis koncentrationen er høj nok.

Alligevel kan alkohol, som nævnt, også have en medicinsk effekt og en evne til at fungere som modgift mod forgiftninger, der er endnu farligere end den alkohol kan give. Anvendes alkohol som kompetitiv inhibitor over for træsprit eller ethylenglycol, kan det redde liv, mens det i andre situationer kan tage det.