Enzymatisk nedbrydning af alkohol

Denne underside udgør tredje del af teorien for Biotech Academys materiale om Alkohol og enzymkinetik.

Når alkohol optages i kroppen, kan den ikke uden videre udskilles i samme form igen. Den skal nedbrydes til forskellige dele, der derefter kan behandles og udskilles af kroppen. Denne nedbrydningsproces forløber ikke af sig selv, men skal sættes i gang – man siger, at den skal katalyseres. En katalysator for en reaktion i kroppen vil oftest være et enzym, i dette tilfælde de to enzymer alkoholdehydrogenase og aldehyddehydrogenase. For at forstå alkohols nedbrydning i kroppen er det derfor nødvendigt at kigge nærmere på, hvad enzymer er, samt på hvordan de virker.

Hvad er et enzym?

Enzymer er en fællesbetegnelse for proteiner, der fungerer som katalysatorer for kemiske reaktioner. Det vil sige at de forøger reaktionshastigheden uden selv at blive forbrugt. En katalyseret reaktion kan forløbe flere millioner gange hurtigere end den samme ikke-katalyserede reaktion.

Hvis to reaktanter er til stede uden et enzym til at katalysere reaktionen mellem dem vil reaktionen ofte ske med så lav en hastighed at den i praksis vil være ubetydelig. Enzymer spiller derfor en vigtig rolle i hele den menneskelige krop, idet de bestemmer hvilke reaktioner der vil forløbe med en nævneværdig hastighed. En yderligere vigtig egenskab ved enzymer er deres specifitet. Et givent enzym er kun i stand til at katalysere bestemte reaktioner under meget specifikke betingelser, hvilket er en vigtig egenskab og yderst brugbart i kroppen.

En del enzymer katalyserer ikke reaktioner uden tilstedeværelsen af et yderligere ’hjælpemiddel’, kaldt en cofaktor. En cofaktor kan enten være et metal eller et lille organisk molekyle, kaldt et coenzym. Cofaktorer hjælper enzymet med at katalysere en given reaktion og er således også med til at bestemme, hvilke reaktioner der forløber. Dette er blandt andet på grund af, at coenzymer kan være bærere af forskellige kemiske grupper, og derfor udgør de en transportvej for nogle molekyler. I denne artikel vil der blive set nærmere på de to coenzymer NADH og NAD⁺.

Hvordan virker et enzym?

Der er stor forskel på enzymer og deres funktioner, men man kan overordnet forklare enzymers generelle funktion ud fra figur 4. Et enzym (E) og et substrat (S) mødes og danner de et kompleks (ES), hvorefter en kemisk reaktion forløber. Når reaktionen er løbet til ende er substratet forbrugt, og tilbage er enzymet samt en mængde produkt (P). Enzymet bevarer sin oprindelige form og struktur og kan katalysere en ny reaktion. Enzymet bliver altså ikke forbrugt under reaktionen.

Figur 4. Enzymers overordnede katalysemekanisme. a) Et substrat (rødt) nærmer sig et enzym (gult). b) De to danner et enzym-substrat-kompleks. c) En kemisk reaktion forløber, og substratet omdannes til produkt (blåt). d) Produktet frigives, og enzymet kan katalysere en ny reaktion.

En måde at forstå et enzyms opbygning og interaktion med substrater på, er det såkaldte ’nøgle-i-lås’-princip, som er illustreret på figur 4. Her ses det, at en del af enzymet kan opfattes som et nøglehul, hvori substratet passer perfekt. Dette hul kaldes enzymets aktive site. Det er altså i det aktive site at selve katalysen og reaktionen sker. Visse enzymer har flere aktive sites, og disse kan derfor katalysere flere reaktioner samtidig.

Michaelis-Menten-kinetik

Studiet af kemiske reaktioners forløb kaldes reaktionskinetik. Enzymkinetik handler derfor om reaktioner, der er katalyseret af enzymer. Specielt er reaktionshastigheder ofte interessante og siger meget om reaktioners forløb. Men hvad menes der nøjagtigt med reaktionshastighed?

Lad os først betragte en helt simpel kemisk førsteordensreaktion, hvor en reaktant, R, omdannes til produktet, P:

Reaktion 1:

$R \rightarrow P$

Denne reaktion sker med en vis hastighed V, der siges at være lig mængden af R der forsvinder pr. tidsenhed, for eksempel 2 mol/sek. På samme måde kan V siges at være lig mængden af P, der dannes pr. tidsenhed.

Disse to definitioner er i visse tilfælde ikke lig hinanden, men blot proportionale. Begge kan dog anvendes på lige fod, så længe man husker, hvilken man har valgt. I det følgende antager vi, at de er ens.

I praksis vil man kigge på hvordan koncentrationerne af R og P, skrevet [R] og [P], ændrer sig:

Ligning 1:

$V = \frac{\Delta [P]}{\Delta t} = \frac{- \Delta [R]}{\Delta t}$

At en reaktion er en førsteordensreaktion betyder, at reaktionshastigheden er proportional med koncentrationen af en reaktant. Det vil sige at jo mere reaktant der er til stede, jo hurtigere vil reaktionen forløbe.
Proportionalitetskonstanten i denne sammenhæng kaldes reaktionens hastighedskonstant, der betegnes k.

Ligning 2:

$V = k \cdot [R]$

Dette udgør grundlaget for forståelse af reaktionshastigheder for førsteordensreaktioner. Med denne viden kan vi nu opstille en model for enzymreaktioner, der blev udviklet af Leonor Michaelis og Maud Menten i 1913. Modellen kaldes derfor Michaelis-Menten modellen.
Modellen beskriver hvorledes et substrat (S) og et enzym (E) indgår i et kompleks, og hvordan der herved dannes et produkt.

Substrat er det ord man bruger til at betegne reaktanter i enzymreaktioner.

Reaktionsskemaet for en Michaelis-Menten reaktion ser således ud:

Reaktion 2:

$E + S \rightleftharpoons ES \rightleftharpoons E + P$

Både dannelse af ensym-substrat komplekset, samt dannelse af produkt og enzym, er reversible reaktioner. Dannelse af ES-komplekset sker med hastighedskonstanten $k_1$ , og den modsatte reaktion med hastighedskonstanten $k_{-1}$ . Ligeledes for dannelse af produktet: reaktionen forløber med hastighedskonstanten $k_2$ , og den modsatte reaktion forløber med hastighedskonstanten $k_{-2}$ .

For at forsimple situationen vælger vi at se på reaktionen umiddelbart efter blanding af substrat og enzym. På dette tidspunkt er der endnu ikke noget produkt til stede, hvorfor k_-2-reaktionen ikke kan forløbe. Vi kan derfor se bort fra denne.

Reaktionen ser nu sådan ud:

Reaktion 3:

$E + S \rightleftharpoons ES \overset{k_2}{\rightarrow} E + P$

Hastighedskonstanten k₁ er et udtryk for hvor hurtigt enzym og substrat vil sætte sig sammen og danne ES. k_-1 fortæller hvor hurtigt ES vil falde fra hinanden igen, uden at en reaktion forløber. Dette kaldes at komplekset dissocierer. Dannelsen af produkt ud fra ES-komplekset sker med hastighedskonstanten k₂.

Vi kan nu opstille et udtryk for hvor hurtigt der vil dannes produkt. Fordi vi kun kigger på reaktionshastigheden lige når reaktionen startes, kalder vi denne hastighed for V₀:

Ligning 3:

$V_0 = k_2 \cdot [ES]$

Vi vil nu gerne omskrive ligning 3, så det udtrykkes ved kendte størrelser. Vi går ud fra, at vi kender startkoncentrationen af såvel enzym, som substrat.

Derfor kan man opskrive formler der angiver hvor hurtigt ES-komplekset henholdsvis dannes og nedbrydes:

Hastigheden for dannelse af ES-komplekset, her kaldt $V_{dannelse}$ , er produktet af reaktanterne og den tilhørende hastighedskonstant, $k_1$ :

Ligning 4:

$V_{dannelse} = k_1 \cdot [E] \cdot [S]$

Hastigheden for dissociation og omdannelse af ES-komplekset kalder vi så $V_{dissociation}$ . Denne findes som:

Ligning 5:

$V_{dissociation} = k_{-1} \cdot [ES] + k_2 \cdot [ES] \leftrightarrow V_{dissociation} = (k_{-1} + k_2) \cdot [ES]$

Reaktionen vil næsten øjeblikkeligt nå en tilstand der kaldes Steady state. Dette betyder at koncentrationen af ES-komplekset er konstant. Det betyder altså at hastigheden af dannelse og nedbrydning (dissiociation plus produktdannelse) af ES-komplekset er den samme, og vi kan derfor sætte ligning 4 og ligning 5 lig hinanden og omskrive dem en smule:

Ligning 6:

$k_1 [E] \cdot [S] = (k_{-1} + k_2) \cdot [ES]$

$\leftrightarrow \frac{[E] \cdot [S]}{[ES]} = (k_{-1} + k_2)$

$\leftrightarrow \frac{[E] \cdot [S]}{[ES]} = \frac{k_{-1} + k_1}{k_2}$

Fordi højresiden kun består af konstanter kan man forsimple ovenstående udtryk ved at indføre en ny konstant, kaldt Michaelis-Menten-konstanten (K_M). Denne konstant defineres som højresiden af den omskrevne ligning 6, dvs:

Ligning 7:

$K_M = \frac{k_{-1} + k_2}{k_1}$

Michaelis-Menten-konstanten er et udtryk for enzymets bindingsaffinitet over for substratet. Denne konstant har en enorm betydning, hvilket vi vil se senere. Michaelis-Menten-konstanten er specifik for en given reaktion og kan bestemmes eksperimentelt eller slås op.

Samlet set siger ligning 6 og ligning 7 da:

Ligning 8:

$K_M = \frac{[E] \cdot [S]}{[ES]}$

I kroppen og i andre biologiske omgivelser vil det næsten altid være sådan, at der er en langt højere koncentration af substrat end enzym. Det betyder, at koncentrationen af substrat, der endnu ikke er indgået i et kompleks med enzymet (frit substrat), vil være næsten lige så stor som den totale koncentration af substrat. Hvis vi kalder koncentrationen af det frie substrat for [S] og den totale koncentration af substrat for [S]_T, kan vi altså antage at disse to er ens:

Ligning 9:

$[S] \approx [S]_T$

Koncentrationen af det frie enzym kalder vi på samme måde for [E], mens vi kalder den totale enzymkoncentration for [E]_T. I modsætning til substratet vil der dog her være en relativt stor del af enzymet som er bundet i ES-komplekset. Vi ved, at koncentrationen frit enzym, [E], er lig den totale koncentration af enzymet, [E]_T, minus koncentrationen af ES-komplekset, [ES], altså:

Ligning 10:

$[E] = [E]_T - [ES]$

Ligning 9 og 10 kan nu sættes ind i ligning 8, hvilket giver os:

Ligning 11:

$\frac{([E]_T - [ES]) \cdot [S]}{[ES]} = K_M$

Løses der for [ES] finder man

Ligning 12:

$[ES] = [E]_T \cdot \frac {[S]}{[S] + K_M}$

Vi er nu kommet frem til et udtryk for koncentrationen af ES-komplekset, [ES]. Dette kan vi indsætte i ligning 3, som var et udtryk for V₀, altså hastigheden hvorved produktet, P, bliver dannet:

Ligning 13:

$V_0 = k_2 \cdot [E]_T \cdot \frac{[S]}{[S] + K_M}$

Er det nu muligt for os at sige noget om en reaktions maksimale hastighed, V_max, altså den maksimale værdi, som V₀ kan antage? Ud fra ligning 3 kan vi se at V₀ vokser når [ES] vokser. For at finde ud af hvornår [ES] er størst, må man tænke på hvad der sker rent biologisk. Vi husker på, at substrat og enzym mødes og indgår i et kompleks med hinanden, og at der ofte er meget højere koncentration af substrat end enzym. Vi kan derfor udlede, at maksimalhastigheden må indtræde, når alle de tilstedeværende enzymer er bundet i et kompleks. Det betyder altså, at man når et punkt, hvor der er så meget substrat til stede, at alle enzymerne indgår i komplekser og derfor hele tiden har travlt med at katalysere reaktionen. I denne situation gælder at:

Ligning 14:

$[ES] = [E]_T$

Ud fra ligning 3 og ligning 14 kan vi så skrive et udtryk for maksimalhastigheden, kaldt $V_{max}$ :

Ligning 15:

$V_{max} = k_2 \cdot [E]_T$

Vi kan nu indsætte ligning 15 i ligning 13, hvilket giver os:

Ligning 16:

$V_0 = V_{max} \frac{[S]}{[S] + K_M}$

Vi har nu udledt den berømte Michaelis-Menten-ligning, der er en helt central del af al enzymkinetik.

Betydningen af maksimalhastigheden er allerede beskrevet, men hvilken betydning har K_M?

Hvis vi i Michaelis-Menten-ligningen sætter [S] = K_M, får vi følgende:

Ligning 17:

$V_0 = V_{max} \cdot \frac{K_M}{K_M + K_M} = V_{max} \frac{1}{2}$

Vi kan her se, at resultatet bliver halvdelen af maksimalhastigheden. Det betyder altså, at K_M er lig den substratkoncentration der skal til, for at reaktionen forløber med nøjagtigt halvdelen af maksimalhastigheden. På figur 5 ses en grafisk afbildning af sammenhængen mellem [S] og V₀ ifølge Michaelis-Menten-ligningen.

Figur 5. Michaelis-Menten ligningen afbildet grafisk. Kurven viser tydeligt hvad der sker med reaktionshastigheden når koncentrationen af substrat øges. Ligeledes kan man se hvilken betydning V_max og K_M har.

I praksis beskriver K_M-værdien enzymets affinitet over for substratet, dvs. hvor tilbøjeligt enzymet er til at indgå i et kompleks med substratet. En lav K_M-værdi betyder, at der ikke skal særlig meget substrat til, for at reaktionen forløber med en hastighed tæt på maksimalhastigheden, V_max. Omvendt betyder en høj K_M-værdi, at der skal meget substrat til, for at reaktionen forløber tæt ved sin maksimalhastighed.

Bemærk, at K_M-værdien ikke har nogen indflydelse på størrelsen af V_max, men kun indflydelse på, hvor meget substrat der skal til for at nå maksimalhastigheden. Det betyder, at V_max er uafhængig af K_M, og begge kan antage høje og lave værdier, uanset størrelsen af den anden.

Alkohols nedbrydning i kroppen

Når vi indtager ethanol, udskilles det, i uomdannet form, kun meget langsomt gennem urin og sved. Kroppen skal derfor nedbryde det til nogle andre stoffer, som vi er stand til at udskille hurtigere, så alkoholen ikke ophobes i kroppen. Denne nedbrydningsproces involverer blandt andet enzymet alkoholdehydrogenase (ADH) samt de to coenzymer NAD⁺ og NADH. De største koncentrationer af ADH findes i leveren, og nedbrydningen foregår derfor primært her. Alkohol er kun et af de stoffer, leveren nedbryder, og kombinerer man eksempelvis et for stort alkoholforbrug med meget fed mad, kan leveren overbelastes og sættes helt ud af funktion – også kaldt leversvigt eller skrumpelever. Ved leversvigt ophobes de gift- og affaldsstoffer, der ellers skulle være nedbrudt i leveren, hvilket gør det til en farlig sygdom, som er ret udbredt blandt alkoholikere.

Når man indtager alkohol, vil det først løbe gennem spiserøret til mavesækken. Fra mavesækken føres det videre til tarmkanalen, hvor det optages og går ind i blodbanen. Via blodbanen føres det rundt til alle kroppens organer, for eksempel hjernen, hvilket giver følelsen af beruselse. Alkoholen føres også til leveren, hvor den primære nedbrydning foregår.

Det første trin i nedbrydningen af alkohol er oxidationen af ethanol (CH₃CH₂OH) til acetaldehyd (CH₃CHO), der også kaldes ethanal:

Reaktion 3:

$CH_3CH_2OH + NAD^+ \rightleftharpoons CH_3CHO + NADH + H^+$

Reaktion 3 katalyseres af enzymet alkoholdehydrogenase (ADH). Udover at ethanol omdannes til ethanal/acetaldehyd omsættes coenzymet NAD⁺ til NADH i reaktionen. Som omtalt i forrige afsnit fungerer coenzymer som bærere af forskellige kemiske grupper. I dette tilfælde er det hydridionen H^–, der transporteres til mitokondrierne, hvor den bidrager til produktionen af ATP.

Næste trin i nedbrydningsprocessen er omdannelsen af acetaldehyd til acetat (CH₃COO^–). Igen omsættes coenzymet NAD⁺, men denne gang er det enzymet aldehyddehydrogenase, der virker som katalysator i reaktion 4 og får den til at forløbe:

Reaktion 4:

Efter dette trin kan acetat protoneres og blive til sin korresponderende syre, eddikesyre (CH₃COOH), der så kan omdannes til acetyl-coenzym A (acetyl-CoA). Acetyl-CoA går i forbindelse med oxaloacetat som et led i citronsyrecyklussen og nedbrydes til vand og carbondioxid. Vand og carbondioxid kan udskilles direkte af kroppen, og alkoholen er således blevet fuldstændig nedbrudt.

NAD⁺ indgår i reaktionerne for at oplagre den energi der frigives ved oxidationerne. Dette sker ved at NAD⁺ som nævnt bliver reduceret til NADH, hvilket opretholder redoxbalancen (der skal ske lige mange reduktioner og oxidationer). På et senere tidspunkt kan NADH frigive den oplagrede energi hvorved der i sidste ende kan dannes ATP. Et indtag af alkohol bidrager dermed til opbygning af kroppens energidepoter.

Ethanol har i sig selv virkninger på kroppen, både euforiserende og skadelige. Derudover spiller nedbrydningsproduktet acetaldehyd også en rolle i forbindelse med konsekvenserne af at drikke alkohol. Mens alkohol nedbrydes i kroppen vil der være en mængde acetaldehyd såvel i leveren, som i blodet.

Acetaldehyd er giftigt for kroppen, og kan nå at forårsage forskellige skader inden det nedbrydes. Det er for eksempel acetaldehyd der er skyld i at fostre kan udvikle føtalt alkoholsyndrom, hvis moderen drikker store mængder alkohol under graviditeten. Nogle af de symptomer man forbinder med tømmermænd, forårsages ligeledes af forhøjede koncentrationer af acetaldehyd i blodet.

Disse ubehagelige (og skadelige) effekter af acetaldehyd udnyttes i behandling af alkoholisme. Medikamentet Antabus indeholder et aktivt stof som hedder disulfram. Stoffet fungerer som irreversibel inhibitor (se afsnit 4. Medicinsk brug af alkohol) overfor enzymet aldehyddehydrogenase, så nedbrydningen af acetaldehyd (reaktion 4), forhindres. Dette vil resultere i at der hurtigt ophobes store mængder acetaldehyd i kroppen, og patienten vil opleve et stærkt ubehag, som kan sammenlignes med meget voldsomme tømmermænd.

Personer der er på Antabus har derved et kraftigt incitament til at lade være med at drikke alkohol.