Nedbrydning af plastik

Resume: I takt med at den globale velstand er steget, er det globale plastikforbrug også. I 2018 blev der produceret over 350 millioner tons plastik på verdensplan. Størstedelen af forbruget af plastik kommer fra emballage, som udgør hele 40% af al plastik i Europa. Brug af plastik i fødevareindustrien er smart, da det reducerer massen af indpakning, samt holder mad friskere og derved mindsker madspild.  

 

Modstandsdygtigheden af plastik overfor (bio)nedbrydning har været anset som et af dets fordele. Dog har det også vist sig at forsage store miljømæssige problemer. For selvom vi flittigt affaldssorterer vores plastik, så det kan blive genanvendt, er det ikke helt så enkelt. Det plastik, der ender til genbrug, er typisk en blanding af forskellige farver. Al den plastik bliver omsmeltet ved meget høje temperaturer, og resultatet er en grå eller sort plastik, som få firmaer vil have lyst til at bruge som emballage. Dette bliver f.eks. til gulvtæpper, eller andet plastik, man anser for at have ”lav værdi”. Til sidst kan plastikket ikke smeltes om til ny plastik længere og ender på lossepladser eller bliver brændt på et forbrændingsanlæg. Der er så derfor ikke længere tale om egentlig genanvendelse.

 

Man står derfor overfor et problem, da man gerne vil af med den enorme mængde af plastik, der har ophobet sig på vores klode. Spørgsmålet er derfor så, om man kan gøre afskaffelsen og genanvendelsen af plastik mere bæredygtig?

 

Kernen af bioteknologi er at anvende naturen til menneskers fordel.  Når det kommer til at nedbryde et så holdbart materiale som plastik, er dette ikke en undtagelse. Forskere har for nyligt fundet en bakterie, der har udviklet sig til at kunne nedbryde og metabolisere et plastik ved navn PET. Det er da fantastisk! Da plastikaffald først har været tilstede i naturen siden 1960’erne, viser det, hvor hurtigt mikroorganismer er til at tilpasse sig. Dette projekt vil kigge nærmere på bionedbrydningen af PET vha. enzymer og forklare kemien bag dette.

God fornøjelse med projektet!

Teori:

Inden du kommer til den egentlige bionedbrydning i casen, er det vigtigt først at få styr på strukturen af plastik, enzymer, og de funktionelle grupper der indgår i disse. Dette bliver beskrevet med tilhørende spørgsmål i baggrundsteorien. Når du har læst teorien, kan du gå videre til casen. Det kan være, at du allerede har mødt dele af teorien i din undervisningen, teoriafsnittet er således en mulighed for at få det opfrisket efter behov. Teorien består af 4 afsnit:

  • Intermolekylære bindinger
  • Funktionelle grupper
  • Strukturen af plastik
  • Enzymer
    • Hovedklasser
    • Aminosyrer og proteinstruktur
    • Det aktive site og induced fit mekanismen
    • Cofaktorer & coenzymer

 

Tilgå afsnittene ved at trykke på knapperne nedenfor. Spørgsmål til afsnittene kan tilgås under lærervejledninger.

 

Case: Bionedbrydning af PET med enzymer

Projektets case omhandler et enzym, der er i stand til at bionedbryde den type af plastik der bruges i plastikflasker. Casen kan læses og løses efter baggrundsteorien. Spørgsmål og svar kan findes under lærervejledninger.

Teori der indgår:

  • Strukturen af PET
  • PETase og MHETase
  • Katalytisk triade
  • Oxyanion hul
  • Ester hydrolyse
  • Andre PET nedbrydende enzymer
  • Bionedbrydning i praksis

 

Strukturen af PET-plastik

De plastikflasker vi drikker af, er typisk lavet af plastikpolymeren polyethylentereftalat (PET). Langt størstedelen af PET, der bruges til emballage, er produceret til kun at blive anvendt en enkelt gang, og der er derfor et stort potentiale for bedre genanvendelse.

 

PET fremstilles fra molekylerne ethylenglycol (EG) og dimethyl tereftalat (DMT), der begge bliver fremstillet på basis af stoffer fra råolie.

 

Figur 1: Polymeren polyethylentereftalat (PET) bliver produceret ud fra komponenterne ethylenglycol (EG) og dimethylereftalat (DMT).

 

 

PET er en lineær polymer, og bliver oftest bare kaldt polyester, selvom der findes flere forskellige polyestere. Monomeren af PET kaldes mono-(2-hydroxyethyl) tereftalat, kort MHET. MHET kan nedbrydes til to molekyler; tereftalsyre (TPA) og EG (se figur 2). Tereftalsyre er en aromatisk syre, da den består af en aromatisk ring, hvorpå der sidder to carboxylsyrer. Læg mærke til at TPA ikke er det samme molekyle som DMT, da methylgrupperne (-CH3) erstattes med hydroxygrupper (-OH) under polymerisationen. Hverken TPA eller EG er miljøskadelige i sig selv.

 

Figur 2: Ethyleneglycol (EG) og terefatalsyre (TPA) danner monomeren MHET. De er bundet sammen af en esterbinding. Monomeren MHET bindes ved esterbindinger til at danne polymeren PET.

 

 

De to molekyler TPA og EG, danner monomeren, ved at være af bundet en esterbinding. MHET monomererne er også bundet til hinanden via esterbindinger i PET og danner derved polymeren. Disse esterbindinger kan brydes ved hydrolyse, og derved kan PET blive til dets mindre bestanddele.

 

Enzymerne PETase & MHETase

I 2016 opdagede et hold af japanske forskere en helt ny bakterie, der er i stand til at bruge carbon fra PET som dets primære carbonkilde. En carbonkilde er et carbonholdigt molekyle (kulhydrat, aminosyre, CO2, fedtsyre), som levende organismer bruger til energi og cellevækst. Bakterien, der senere har fået navnet Ideonella sakaiensis, blev isoleret fra prøver fra en losseplads med PET-plastik flasker. Det viser sig at bakterien er i stand til at nedbryde PET ved hjælp af to forskellige hydrolaser, der bryder esterbindingerne.

 

Når bakterien sidder på overfladen af PET, udskiller den dels det ekstracellulære enzym – PETase. Dette enzym katalyserer hydrolysen af PET-polymererne på overfladen af plastikflasken til dets monomerer MHET. MHET optages nu ind i cellen, hvor den intracellulære hydrolase – MHETase – hydrolyserer MHET til dets to komponenter, TPA og EG. De to komponenter TPA og EG, bliver yderligere nedbrudt og indgår i cellens metabolisme, hvor bakterien bruger carbon fra disse som energikilde og udgangsmateriale for vækst. TPA og EG bliver derved nedbrudt til H2O og CO2.

 

Figur 3: I. sakaiensis ses som lilla bakterier på overfladen af en PET plastikflaske. Først udskilles PETase fra bakterien og nedbryder PET til MHET ved hydrolyse. MHET optages herefter i cellen, hvor den nedbrydes af MHETase til EG og TPA.

 

Enzymerne der nedbryder hhv. PET og MHET hedder IsPETase og IsMHETase efter det substrat de hydrolyserer, og organismen de kommer fra (Ideonella sakaiensis).

 

Det aktive site i PETase

Hvis vi kigger på det aktive site i PETase, så ligger det tæt på overfladen. Dette er en stor fordel, da det betyder at plastikket nemmere kan få kontakt og danne intermolekylære bindinger med det aktive site. Det aktive site i PETase består af to bindingsdele og en katalytisk del. I den første bindingsdel, binder PETase til PET polymeren med en hydrofobisk kløft. Den hydrofobiske kløft kan ses i figur 4b, som den blå farve.

 

Figur 4: 4-MHET (grøn) bundet til PETase. a) Subsite I er vist i pink. b) subsite II er vist i blåt. c) Den katalytiske triade er vist i gul.

 

Det aktive site af PETase er i stand til at binde i alt 4 MHET-dele (i PET-polymeren). I figur 4 ses det at MHET kæden drejes således at det passer i enzymet. De to bindingsdele kaldes subsite I og II (hhv. figur 4a og 4b). Ind imellem de to subsites ligger den katalytiske del, som består af 3 aminosyrer.

 

I figur 5 ses det hvordan subsite I binder den første MHET monomer, mens subsite II binder de 3 resterende monomerer. Subsite II er delt op i 3 dele, a, b, og c, der hver binder til én MHET-del. Hydrolysen af esterbindingen sker i den katalytiske del mellem de to subsites. Ved første hydrolyse bliver PET polymerkæden delt i 2. Herefter rykker næste MHET del op til subsite I, og der brydes endnu en esterbinding. Dette fortsætter så igennem polymeren.

 

Figur 5: Figuren viser hvordan PET polymeren kløves til individuelle MHET monomere. 1) PET polymer er bundet til det aktive site og første hydrolyse forløber. 2) Efter første hydrolyse rykker polymeren en enhed frem og anden hydrolyse forløber. 3) Efter anden hydrolyse frigives en MHET monomer.

 

Aminosyrer der indgår i et polypeptid navngives ud fra forkortelsen på aminosyren og det nummer det har.  F.eks. H128 el. His128, dette betyder at dette er aminosyren histidin (H), der er nummer 128 i polypeptidkæden fra N-terminalen.

 

Subsite I består bl.a. af Met161, Ile208, og aromaterne Trp185, og Tyr87, som danner hydrofobe interaktioner med benzenringen i den første monomer af PET og herved bidrager til stabiliteten af komplekset i Fig. 5. De intermolekylære bindinger og interaktioner mellem PET og subsite II er hovedsageligt hydrofobe interaktioner. Subsite II består bl.a. af aminosyrerne Thr, Ala, Trp, Ile, Asn, Ser, og Arg.

 

Figur 6: Det aktive site af PETase der er bundet til en PET-polymer der består af 4 MHET-monomerer (grøn). Aminosyresidekæderne i de forskellige subsites er fremhævet i deres repektive farver. De lyserøde aminosyrer tilhører subsite I og de blå aminosyrer tilhører subsite IIa, IIb, og IIc. Den katalytiske del er vist i gul. Polypeptidkæden af PETase er markeret med gråt.

 

Ser236 og Asn246 ligger i subsite IIc, og danner polære intermolekylære bindinger med PET substratet (se figur 7). Nitrogenatomet i Ser236, danner hydrogenbinding med carbonylgruppen på den ene side af aromaten i MHET-delen, hvor nitrogenatomet  i asparagins sidekæde danner hydrogenbinding med carbonylen på den anden side af aromaten.

 

Figur 7: Subsite IIc hvor Ser236 og Asn246 danner polære intermolekylære bindinger med den sidste MHET monomer der er bundet til det aktive site.

 

 

Det kan også forekomme at PETasen binder i polymeren således at der kun er 2 MHET-monomerer i subsite II. Pga. dette er PETase i stand til at bryde esterbindingerne således at der dannes 2 forskellige monomerer bis(2-hydroxyethyl) tereftalat (BHET) og MHET. BHET ligner MHET men har en ekstra -CH2CH2OH gruppe. MHETase kan dog kun nedbryde MHET og ikke BHET.

 

Figur 8: Strukturen af de 3 produkter PETase danner ved nedbrydning af PET.

 

 

Enzymerne katalyserer hydrolysen

Nogle enzymer, har en katalytisk triade i deres aktive site. En katalytiske traide er et sæt af tre aminosyrer, der indgår i katalysen for reaktioner, hvor det er ekstra krævende for at reaktionen kan forløbe. De er typiske for hydrolaser. De tre aminosyrer i triaden består af en syre, base, og en nukleofil. Nukleofiler er elektronrige atomer, der er i stand til at donere en elektron, da de har et ledigt elektronpar (f.eks. oxygen). Nukleofiler reagerer med elektrofiler, som er elektronfattige atomer, der gerne vil optage en. Elektrofiler er typisk positivt ladede eller er en positiv dipol i polære bindinger. I vores eksempel, altså i PETase og MHETase, består den katalytiske triade af aspartat, histidin og serin (se figur 9). Dette er almindeligt for hydrolaser der modificerer estere.

 

Figur 9: Den katalytiske triade i PETase er vist i gul, selve enzymet er farvet gråt.

 

I PETase består den katalytiske triade af Asp206, His237 og Ser160. Selvom de tre aminosyrer er lokaliseret langt væk fra hinanden i primærstrukturen af enzymet, er de placeret sammen lokalt i den tertiære struktur, og udgør på den måde kløvningssitet. Aspartat er en syre da den indeholder en carboxylsyregruppe. Histidin er en base ved neutral pH da dets NH gruppe i aromaten kan fungere som en proton modtager. Serin er nukelofil og kan donere en elektron i sin -OH gruppe. I en katalytisk triade arbejder syren og basen sammen, ved at danne hydrogenbindinger og overføre elektroner frem og tilbage mellem hinanden til serinen. Dette gør serinen til en stærkere nukleofil så den kan danne kovalente bindinger med substratet og reaktionen lettere kan forløbe.

 

Ester hydrolysen

PETase og MHETase hører til den undergruppe af hydrolaser, der hedder esteraser. Esteraser katalyserer hydrolysen af esterbindinger, der brydes og bliver til en carboxylsyre- og en alkoholgruppe.

 

Figur 10: Hydrolyse af en ester giver en carboxylsyre og en alkohol.

 

I baggrundsteorien fandt vi ud af at oxygen i carbonylen i esteren er elektronegativ, og carbon i carbonylen er elektropositiv.  Derfor kan carbonatomet fungere som en elektrofil. Elektrofilen reagerer med nukleofilen Ser160 i esterhydrolysen. Ser160 danner en kovalent binding med carbonatomet fra carbonylen, hvilket hjælper til at der optages hhv. en -OH gruppe og hydrogen  fra vand.

 

Ester hydrolysen har brug for en syre for at den katalyseres, dette kommer fra den katalytiske triade.

 

Mekanismen for hydrolysen i mere avanceret form er illustreret i figur 11.

 

Ester hydrolysen (avanceret):

 

Figur 11: Figuren viser mekanismen bag ester hydrolysen der forekommer i det aktive site på i PETase og MHETase.

 

De sorte pile på figur 12 viser hvordan elektronerne flytter sig, og danner nye bindinger mellem atomerne i den katalytiske triade.

  1. Aspartat fjerner først en hydron (H+) fra histidin, herefter fjerner histidin en hydron fra serin. Dette gør oxygenet i serin nukleofilt, og det danner derfor en binding med elektrofilen i carbonylen. Oxygenatomet i carbonylen bliver deprotoneret, og bliver til en anion (oxyanion). Transition astate intermediatet stabiliseres af hydrogenbindinger til amininer, der også er tilstede i det aktive site.
  1. Der er nu dannet et transition state intermediat hvor oxyanionen stabiliseres af oxyanion hullet.
  2. Herefter fjernes det ene oxygenatom i intermediatet hydronen fra histidin. Det ene produkt af reaktionen med alkoholgruppen er nu dannet, og esterbindingen er brudt.
  3. Der kommer nu vand ind i det aktive site. Oxygenatomet i vandet er nukleofilt, da det har to ledige elektronpar, det angriber derfor det elektrofile carbonatomet i carbonylen.
  4. Oxygenatomet bliver igen en oxyanion, der stabiliseres af oxyanion hullet. Der er igen dannet et transition state intermediat.
  5. Aspartat mister sin hydron til histidin, og serin fjerner et hydron fra histidin. Bindingen mellem serin og intermediatet bliver derved brudt. Det andet produkt med carboxylsyreenden er nu dannet, og reaktionen er slut.

 

Mekanismen for nedbrydning af MHET i MHETase er den samme som ovenstående. Både PETase og MHETase er serin hydrolaser, hvilket er hydrolaser hvor der er en nukleofil serin tilstede i det aktive site.

Andre PET nedbrydende enzymer

Vi har nu stiftet bekendtskab med et enzym der evolutionært er udviklet til netop at nedbryde PET. Men inden man fandt bakterien I. sakaiensis havde forskere allerede været et kig ude i naturen efter enzymer, der kunne nebdryde PET. Lige nu kender man til flere enzymer fra både bakterier og svampe, der er i stand til at nedbryde PET polymeren ved at hydrolysere esterbindingerne. De enzymer der har vist sig at kunne nedbryde PET er også serin hydrolaser (cutinaser, lipaser og carboxylesteraser). Enzymerne blev fundet ved at lede efter esteraser, hvis substrater strukturelt ligner PET.

 

Cutinaser

Det viser sig at de hydrolaser man har fundet som viser at kunne nedbryde PET bedst, er cutinaser. Som navnet afslører er cutinasernes substrat cutin. Cutin er en voksagtig polymer, der sidder i de øverste celler på overfladen af planter.

Cutin er en hydrofobisk polyester, hvilket det har til fælles med PET. Cutinaser har udviklet aktive sites som ligger på overfladen af proteinet, så det er nemmere at komme i kontakt med det hydrofobiske molekyle. Vi vil kigge på to cutinaser, én fra svampen Humicola insolens og en fra bakterienThermobifida fusca. Enzymerne kaldes hhv. HiCut og TfCut2. Begge enzymer er serin hydrolaser og deres katalytiske triade består, som i PETase og MHETase ligeledes af en serin, histidine og aspartat sidekæde. De har også et oxyanion hul. De to enzymers aminosyresekvens er ca. 50% identisk med PETase. Da den katalytiske triade er den samme i alle tre enzymer går man ud fra at deres katalytiske mekanisme også er ens. Den overordnede struktur af PETase ligner cutinaser. I figur 12 ses strukturen af de tre enzymer.

 

Figur 12: Strukturen af enzymerne PETase fra I. sakaiensis, HiCut fra H. insolens of TfCut2 fra T. Fusca.

Bionedbrydning i praksis:

For at nedbryde PET plastik i praksis, behøver man ikke nødvendigvis at bruge selve mikroorganismerne, men kun enzymerne. Ved udelukkende at bruge enzymerne undgår man, at skulle understøtte dens vækst. Man har derfor fundet gernerne fra enzymerne ved gensekventering og fået dem udtrykt i en god produktionsorganimse som f.eks. E. coli. Produktionsorganismen laver så ens enzymer, der derefter ekstraheres og oprenses, for at man kan arbejde med en ren enzymopløsning.

 

Forskere sidder og prøver at optimere PET nebrydende enzymer ved at ændre enkelte aminosyrer i eller omkring det aktive site. Dette kaldes enzyme-engineering og er et stort felt indenfor bioteknologi. Firmaer som Novozymes® optimerer enzymer ved enzyme-engineering så de kan blive endnu mere attraktive som produkter, ved at være mere effektive. Forskere ønsker bl.a. at gøre PETase endnu bedre til at binde til PET og herved forbedre enzymaktiviteten. Man er også intersseret i at designe enzymer der er mere stabile og dermed robuste ved industriel anvendelse.

 

Det specielle ved Idoenella sakaiensis er, at den har det ekstra enzym MHETase, og den derfor også er i stand til at nedbryde monomeren af PET. Man har ikke fundet nogle mikroorganismer udover I. sakaiensis, der kan metabolisere PET. Dette betyder dog ikke at det ikke er muligt at de findes.

 

Fundet på systemet fra I. sakaiensis kan være start på en ny innovativ teknologi, der potentielt kan være en løsning til genanvendelse af plastik. For at kunne rulle bionedbrydning af PET-plastik ud på stor skala, skal processen dog være 100-1000 gange hurtigere end den er lige nu. Det er derfor en markant forbedring, der skal til. Men forskere er optimiske og ser et stort potentiale indenfor forskningsfeltet, hvor man forventer fremskridt indenfor de næste par år.

Strukturen af PET-plastik

Strukturen af PET-plastik

De plastikflasker vi drikker af, er typisk lavet af plastikpolymeren polyethylentereftalat (PET). Langt størstedelen af PET, der bruges til emballage, er produceret til kun at blive anvendt en enkelt gang, og der er derfor et stort potentiale for bedre genanvendelse.

 

PET fremstilles fra molekylerne ethylenglycol (EG) og dimethyl tereftalat (DMT), der begge bliver fremstillet på basis af stoffer fra råolie.

 

Figur 1: Polymeren polyethylentereftalat (PET) bliver produceret ud fra komponenterne ethylenglycol (EG) og dimethylereftalat (DMT).

 

 

PET er en lineær polymer, og bliver oftest bare kaldt polyester, selvom der findes flere forskellige polyestere. Monomeren af PET kaldes mono-(2-hydroxyethyl) tereftalat, kort MHET. MHET kan nedbrydes til to molekyler; tereftalsyre (TPA) og EG (se figur 2). Tereftalsyre er en aromatisk syre, da den består af en aromatisk ring, hvorpå der sidder to carboxylsyrer. Læg mærke til at TPA ikke er det samme molekyle som DMT, da methylgrupperne (-CH3) erstattes med hydroxygrupper (-OH) under polymerisationen. Hverken TPA eller EG er miljøskadelige i sig selv.

 

Figur 2: Ethyleneglycol (EG) og terefatalsyre (TPA) danner monomeren MHET. De er bundet sammen af en esterbinding. Monomeren MHET bindes ved esterbindinger til at danne polymeren PET.

 

 

De to molekyler TPA og EG, danner monomeren, ved at være af bundet en esterbinding. MHET monomererne er også bundet til hinanden via esterbindinger i PET og danner derved polymeren. Disse esterbindinger kan brydes ved hydrolyse, og derved kan PET blive til dets mindre bestanddele.

 

Enzymerne PETase & MHETase

Enzymerne PETase & MHETase

I 2016 opdagede et hold af japanske forskere en helt ny bakterie, der er i stand til at bruge carbon fra PET som dets primære carbonkilde. En carbonkilde er et carbonholdigt molekyle (kulhydrat, aminosyre, CO2, fedtsyre), som levende organismer bruger til energi og cellevækst. Bakterien, der senere har fået navnet Ideonella sakaiensis, blev isoleret fra prøver fra en losseplads med PET-plastik flasker. Det viser sig at bakterien er i stand til at nedbryde PET ved hjælp af to forskellige hydrolaser, der bryder esterbindingerne.

 

Når bakterien sidder på overfladen af PET, udskiller den dels det ekstracellulære enzym – PETase. Dette enzym katalyserer hydrolysen af PET-polymererne på overfladen af plastikflasken til dets monomerer MHET. MHET optages nu ind i cellen, hvor den intracellulære hydrolase – MHETase – hydrolyserer MHET til dets to komponenter, TPA og EG. De to komponenter TPA og EG, bliver yderligere nedbrudt og indgår i cellens metabolisme, hvor bakterien bruger carbon fra disse som energikilde og udgangsmateriale for vækst. TPA og EG bliver derved nedbrudt til H2O og CO2.

 

Figur 3: I. sakaiensis ses som lilla bakterier på overfladen af en PET plastikflaske. Først udskilles PETase fra bakterien og nedbryder PET til MHET ved hydrolyse. MHET optages herefter i cellen, hvor den nedbrydes af MHETase til EG og TPA.

 

Enzymerne der nedbryder hhv. PET og MHET hedder IsPETase og IsMHETase efter det substrat de hydrolyserer, og organismen de kommer fra (Ideonella sakaiensis).

 

Det aktive site i PETase

Hvis vi kigger på det aktive site i PETase, så ligger det tæt på overfladen. Dette er en stor fordel, da det betyder at plastikket nemmere kan få kontakt og danne intermolekylære bindinger med det aktive site. Det aktive site i PETase består af to bindingsdele og en katalytisk del. I den første bindingsdel, binder PETase til PET polymeren med en hydrofobisk kløft. Den hydrofobiske kløft kan ses i figur 4b, som den blå farve.

 

Figur 4: 4-MHET (grøn) bundet til PETase. a) Subsite I er vist i pink. b) subsite II er vist i blåt. c) Den katalytiske triade er vist i gul.

 

Det aktive site af PETase er i stand til at binde i alt 4 MHET-dele (i PET-polymeren). I figur 4 ses det at MHET kæden drejes således at det passer i enzymet. De to bindingsdele kaldes subsite I og II (hhv. figur 4a og 4b). Ind imellem de to subsites ligger den katalytiske del, som består af 3 aminosyrer.

 

I figur 5 ses det hvordan subsite I binder den første MHET monomer, mens subsite II binder de 3 resterende monomerer. Subsite II er delt op i 3 dele, a, b, og c, der hver binder til én MHET-del. Hydrolysen af esterbindingen sker i den katalytiske del mellem de to subsites. Ved første hydrolyse bliver PET polymerkæden delt i 2. Herefter rykker næste MHET del op til subsite I, og der brydes endnu en esterbinding. Dette fortsætter så igennem polymeren.

 

Figur 5: Figuren viser hvordan PET polymeren kløves til individuelle MHET monomere. 1) PET polymer er bundet til det aktive site og første hydrolyse forløber. 2) Efter første hydrolyse rykker polymeren en enhed frem og anden hydrolyse forløber. 3) Efter anden hydrolyse frigives en MHET monomer.

 

Aminosyrer der indgår i et polypeptid navngives ud fra forkortelsen på aminosyren og det nummer det har.  F.eks. H128 el. His128, dette betyder at dette er aminosyren histidin (H), der er nummer 128 i polypeptidkæden fra N-terminalen.

 

Subsite I består bl.a. af Met161, Ile208, og aromaterne Trp185, og Tyr87, som danner hydrofobe interaktioner med benzenringen i den første monomer af PET og herved bidrager til stabiliteten af komplekset i Fig. 5. De intermolekylære bindinger og interaktioner mellem PET og subsite II er hovedsageligt hydrofobe interaktioner. Subsite II består bl.a. af aminosyrerne Thr, Ala, Trp, Ile, Asn, Ser, og Arg.

 

Figur 6: Det aktive site af PETase der er bundet til en PET-polymer der består af 4 MHET-monomerer (grøn). Aminosyresidekæderne i de forskellige subsites er fremhævet i deres repektive farver. De lyserøde aminosyrer tilhører subsite I og de blå aminosyrer tilhører subsite IIa, IIb, og IIc. Den katalytiske del er vist i gul. Polypeptidkæden af PETase er markeret med gråt.

 

Ser236 og Asn246 ligger i subsite IIc, og danner polære intermolekylære bindinger med PET substratet (se figur 7). Nitrogenatomet i Ser236, danner hydrogenbinding med carbonylgruppen på den ene side af aromaten i MHET-delen, hvor nitrogenatomet  i asparagins sidekæde danner hydrogenbinding med carbonylen på den anden side af aromaten.

 

Figur 7: Subsite IIc hvor Ser236 og Asn246 danner polære intermolekylære bindinger med den sidste MHET monomer der er bundet til det aktive site.

 

 

Det kan også forekomme at PETasen binder i polymeren således at der kun er 2 MHET-monomerer i subsite II. Pga. dette er PETase i stand til at bryde esterbindingerne således at der dannes 2 forskellige monomerer bis(2-hydroxyethyl) tereftalat (BHET) og MHET. BHET ligner MHET men har en ekstra -CH2CH2OH gruppe. MHETase kan dog kun nedbryde MHET og ikke BHET.

 

Figur 8: Strukturen af de 3 produkter PETase danner ved nedbrydning af PET.

 

 

Enzymerne katalyserer hydrolysen

Enzymerne katalyserer hydrolysen

Nogle enzymer, har en katalytisk triade i deres aktive site. En katalytiske traide er et sæt af tre aminosyrer, der indgår i katalysen for reaktioner, hvor det er ekstra krævende for at reaktionen kan forløbe. De er typiske for hydrolaser. De tre aminosyrer i triaden består af en syre, base, og en nukleofil. Nukleofiler er elektronrige atomer, der er i stand til at donere en elektron, da de har et ledigt elektronpar (f.eks. oxygen). Nukleofiler reagerer med elektrofiler, som er elektronfattige atomer, der gerne vil optage en. Elektrofiler er typisk positivt ladede eller er en positiv dipol i polære bindinger. I vores eksempel, altså i PETase og MHETase, består den katalytiske triade af aspartat, histidin og serin (se figur 9). Dette er almindeligt for hydrolaser der modificerer estere.

 

Figur 9: Den katalytiske triade i PETase er vist i gul, selve enzymet er farvet gråt.

 

I PETase består den katalytiske triade af Asp206, His237 og Ser160. Selvom de tre aminosyrer er lokaliseret langt væk fra hinanden i primærstrukturen af enzymet, er de placeret sammen lokalt i den tertiære struktur, og udgør på den måde kløvningssitet. Aspartat er en syre da den indeholder en carboxylsyregruppe. Histidin er en base ved neutral pH da dets NH gruppe i aromaten kan fungere som en proton modtager. Serin er nukelofil og kan donere en elektron i sin -OH gruppe. I en katalytisk triade arbejder syren og basen sammen, ved at danne hydrogenbindinger og overføre elektroner frem og tilbage mellem hinanden til serinen. Dette gør serinen til en stærkere nukleofil så den kan danne kovalente bindinger med substratet og reaktionen lettere kan forløbe.

 

Ester hydrolysen

PETase og MHETase hører til den undergruppe af hydrolaser, der hedder esteraser. Esteraser katalyserer hydrolysen af esterbindinger, der brydes og bliver til en carboxylsyre- og en alkoholgruppe.

 

Figur 10: Hydrolyse af en ester giver en carboxylsyre og en alkohol.

 

I baggrundsteorien fandt vi ud af at oxygen i carbonylen i esteren er elektronegativ, og carbon i carbonylen er elektropositiv.  Derfor kan carbonatomet fungere som en elektrofil. Elektrofilen reagerer med nukleofilen Ser160 i esterhydrolysen. Ser160 danner en kovalent binding med carbonatomet fra carbonylen, hvilket hjælper til at der optages hhv. en -OH gruppe og hydrogen  fra vand.

 

Ester hydrolysen har brug for en syre for at den katalyseres, dette kommer fra den katalytiske triade.

 

Mekanismen for hydrolysen i mere avanceret form er illustreret i figur 11.

 

Ester hydrolysen (avanceret):

 

Figur 11: Figuren viser mekanismen bag ester hydrolysen der forekommer i det aktive site på i PETase og MHETase.

 

De sorte pile på figur 12 viser hvordan elektronerne flytter sig, og danner nye bindinger mellem atomerne i den katalytiske triade.

  1. Aspartat fjerner først en hydron (H+) fra histidin, herefter fjerner histidin en hydron fra serin. Dette gør oxygenet i serin nukleofilt, og det danner derfor en binding med elektrofilen i carbonylen. Oxygenatomet i carbonylen bliver deprotoneret, og bliver til en anion (oxyanion). Transition astate intermediatet stabiliseres af hydrogenbindinger til amininer, der også er tilstede i det aktive site.
  1. Der er nu dannet et transition state intermediat hvor oxyanionen stabiliseres af oxyanion hullet.
  2. Herefter fjernes det ene oxygenatom i intermediatet hydronen fra histidin. Det ene produkt af reaktionen med alkoholgruppen er nu dannet, og esterbindingen er brudt.
  3. Der kommer nu vand ind i det aktive site. Oxygenatomet i vandet er nukleofilt, da det har to ledige elektronpar, det angriber derfor det elektrofile carbonatomet i carbonylen.
  4. Oxygenatomet bliver igen en oxyanion, der stabiliseres af oxyanion hullet. Der er igen dannet et transition state intermediat.
  5. Aspartat mister sin hydron til histidin, og serin fjerner et hydron fra histidin. Bindingen mellem serin og intermediatet bliver derved brudt. Det andet produkt med carboxylsyreenden er nu dannet, og reaktionen er slut.

 

Mekanismen for nedbrydning af MHET i MHETase er den samme som ovenstående. Både PETase og MHETase er serin hydrolaser, hvilket er hydrolaser hvor der er en nukleofil serin tilstede i det aktive site.

Andre PET nedbrydende enzymer

Andre PET nedbrydende enzymer

Vi har nu stiftet bekendtskab med et enzym der evolutionært er udviklet til netop at nedbryde PET. Men inden man fandt bakterien I. sakaiensis havde forskere allerede været et kig ude i naturen efter enzymer, der kunne nebdryde PET. Lige nu kender man til flere enzymer fra både bakterier og svampe, der er i stand til at nedbryde PET polymeren ved at hydrolysere esterbindingerne. De enzymer der har vist sig at kunne nedbryde PET er også serin hydrolaser (cutinaser, lipaser og carboxylesteraser). Enzymerne blev fundet ved at lede efter esteraser, hvis substrater strukturelt ligner PET.

 

Cutinaser

Det viser sig at de hydrolaser man har fundet som viser at kunne nedbryde PET bedst, er cutinaser. Som navnet afslører er cutinasernes substrat cutin. Cutin er en voksagtig polymer, der sidder i de øverste celler på overfladen af planter.

Cutin er en hydrofobisk polyester, hvilket det har til fælles med PET. Cutinaser har udviklet aktive sites som ligger på overfladen af proteinet, så det er nemmere at komme i kontakt med det hydrofobiske molekyle. Vi vil kigge på to cutinaser, én fra svampen Humicola insolens og en fra bakterienThermobifida fusca. Enzymerne kaldes hhv. HiCut og TfCut2. Begge enzymer er serin hydrolaser og deres katalytiske triade består, som i PETase og MHETase ligeledes af en serin, histidine og aspartat sidekæde. De har også et oxyanion hul. De to enzymers aminosyresekvens er ca. 50% identisk med PETase. Da den katalytiske triade er den samme i alle tre enzymer går man ud fra at deres katalytiske mekanisme også er ens. Den overordnede struktur af PETase ligner cutinaser. I figur 12 ses strukturen af de tre enzymer.

 

Figur 12: Strukturen af enzymerne PETase fra I. sakaiensis, HiCut fra H. insolens of TfCut2 fra T. Fusca.

Bionedbrydning i praksis

Bionedbrydning i praksis:

For at nedbryde PET plastik i praksis, behøver man ikke nødvendigvis at bruge selve mikroorganismerne, men kun enzymerne. Ved udelukkende at bruge enzymerne undgår man, at skulle understøtte dens vækst. Man har derfor fundet gernerne fra enzymerne ved gensekventering og fået dem udtrykt i en god produktionsorganimse som f.eks. E. coli. Produktionsorganismen laver så ens enzymer, der derefter ekstraheres og oprenses, for at man kan arbejde med en ren enzymopløsning.

 

Forskere sidder og prøver at optimere PET nebrydende enzymer ved at ændre enkelte aminosyrer i eller omkring det aktive site. Dette kaldes enzyme-engineering og er et stort felt indenfor bioteknologi. Firmaer som Novozymes® optimerer enzymer ved enzyme-engineering så de kan blive endnu mere attraktive som produkter, ved at være mere effektive. Forskere ønsker bl.a. at gøre PETase endnu bedre til at binde til PET og herved forbedre enzymaktiviteten. Man er også intersseret i at designe enzymer der er mere stabile og dermed robuste ved industriel anvendelse.

 

Det specielle ved Idoenella sakaiensis er, at den har det ekstra enzym MHETase, og den derfor også er i stand til at nedbryde monomeren af PET. Man har ikke fundet nogle mikroorganismer udover I. sakaiensis, der kan metabolisere PET. Dette betyder dog ikke at det ikke er muligt at de findes.

 

Fundet på systemet fra I. sakaiensis kan være start på en ny innovativ teknologi, der potentielt kan være en løsning til genanvendelse af plastik. For at kunne rulle bionedbrydning af PET-plastik ud på stor skala, skal processen dog være 100-1000 gange hurtigere end den er lige nu. Det er derfor en markant forbedring, der skal til. Men forskere er optimiske og ser et stort potentiale indenfor forskningsfeltet, hvor man forventer fremskridt indenfor de næste par år.

Kildehenvisning:
Dette projekt blev udgivet i august 2021. Det er udarbejdet af Biotech Academy og er blevet opdateret løbende.

null

Projektet er udarbejdet af Lea Helena Strother.
Lea er civilingeniørstuderende på DTU Bioengineering og er startet i 2018.

Lea Helena Strother

null

Institut for Systembiologi har Danmarks største biovidenskabelige og bioteknologiske forskning på universitetsniveau. Instituttet har været partner og sponsor på projektet.

Institut for Systembiologi

null

DTU skylab

null

Novozymes