• Introduktion - Ølbrygning

    Ølbrygning er verdens første form for bioteknologi. Det er et klart eksempel på, hvordan mennesket teknologisk kan styre biologiske processer og derved producere et biologisk produkt. Fremstilling af øl er altså ikke en proces, der lige er blevet opfundet, men der bliver hele tiden forsket i alle dele af ølbrygningsprocessen, således at fremstillingen kan optimeres. Forbehandling og mæskning er processer der drives af enzymer til stede i det byg, man anvender til ølbrygning. Projektet indeholder en beskrivelse af de relevante enzymer, for at kunne give et bedre indblik i de biologiske processer som ølbrygning kræver. Gæring indebærer vækst af gærceller, hvilket forudsætter en forståelse af de typer sukkerarter, som gær kan vokse på, samt en forståelse for vækstfaserne i en fermenteringsproces.

    Projektet giver dig et indblik i den forskning og udvikling, der foregår i en dansk bioteknologi virksomhed. Der er altså mere biologi i ølbrygning, end man måske lige går og tror! Det skulle gerne stå klart efter du har læst teorimaterialet. Først får du en kort beskrivelse af ølbrygningens rige danske historie. I de fem teori afsnit, vil hele ølbrygningsprocessen blive beskrevet i detaljer. Det første afsnit, Introduktion, skal ses som en oversigt, og det er en fordel at have figuren fra denne fremme, mens man læser de tre følgende teoriafsnit. Det sidste afsnit, Vækstfaser, skal ses som supplerende materiale, hvis der eksempelvis udføres vækstforsøg med gær under arbejde med projektet.

    Prøv også kræfter med biologien bag ølbrygning, med de tilhørende forsøg!

     

  • Ølbrygningens historie i Danmark

    Ølbrygning er et af de første eksempler på anvendt bioteknologi, og øl blev brygget længe før man egentlig vidste, at der var mikroorganismer involveret i processen. Den første nedskrevne beretning om brygning er fra Egypten for 5000 år siden. I Danmark er de første spor omkring 3.400 år gamle og stammer fra Egtvedpigens grav. Ølbrygningen har gennem de seneste år gennemgået noget af en revolution. Et utal af mikrobryggerier dukker op hvert år, specialøl er blevet meget populære, og mange ølentusiaster ynder at fremstille deres helt egen øl. Alligevel er maltnings-, brygge- og gæringsprocessen stort set den samme, og har været uændret de seneste 150 år. Den mere videnskabelige forståelse af de processer, der ligger til grund for ølbrygning, har dog betydet en øget effektivitet og en større kontrol af processerne.

    Ølbrygning kan med rette siges at have haft en finger med i spillet om at sætte Danmark på verdenskortet inden for bioteknologi. Carlsberg, der var et af de første store danske bryggerier, blev grudlagt i 1847. I 1875 oprettede brygger J.C. Jakobsen Carlsberg Laboratorium. Laboratoriet blev organiseret i to afdelinger: kemi og fysiologi, hver med dets egen professor. Deres mål var at udvikle det naturvidenskabelige kendskab til maltning, brygning og fermenteringsoperationer. Forskningen på laboratoriet resulterede i nogle meget vigtige observationer, og har dannet grundlag for mange teknikker og metoder, der stadig bruges i laboratorier verden over. Eksempelvis kan der nævnes:

      • Professor, Emil Chr. Hansen, der var leder af Fysiologisk Afdeling på Carlsberg Laboratorium fra 1879 til 1909, fandt i 1883 en måde, hvorved gær kunne rendyrkes, så man undgik vildgær i ølbrygningen. På det tidspunkt havde mange bryggerier problemer med vildgær, og derfor var denne opfindelse meget afgørende for bryggeriindustrien over hele verden. Den første brygning med rendyrket gær, Carlsbergs undergær nummer 1, Saccharomyces carlsbergensis, blev en succes.
      • Laboratoriets første leder, Johan Kjeldahl, offentliggjorde i 1883 en metode til at bestemme nitrogenindholdet i organisk materiale, hvilket kan bruges til at bestemme proteinindhold.
      • Kemikeren S.P.L. Sørensen introducerede i 1909 pH-begrebet, der bruges som mål for opløsningers surhedsgrad den dag i dag.
      • I 1935 klarlagde Øjvind Winge, professor ved Carlsbergs Laboratoriums fysiologiske afdeling, livscyklus og generationsskifte hos gær. Dette har haft stor betydning for forståelsen af gærgenetik og molekylære biologi af de stammer, der i dag bruges i laboratorier over hele verden.

    Laboratoriet eksisterer stadig og har til huse i Carlsbergs Forskningscenter. Forskningen spænder fra fordybelse i byggens og gærens stofskiftereaktioner til anvendt forskning og udvikling, hvor nye metoder og råvarer afprøves.

     

    Læs mere:

    Kristof Glamann. Bryggeren. Gyldendal 1996 (4. udgave, 2. oplag)
    Kristof og Kirsten Glamann. Nordens Pasteur. Gyldendal 2004

  • Teori

    Ølbrygning er en relativt simpel proces. Gærceller overføres til et næringsmedie, som kaldes urten, hvor de optager og forbruger næringsstoffer for at kunne vokse.

    Under gæringen omdanner cellerne sukker til alkohol, CO_2 og en række andre kulstofforbindelser. Det er i høj grad disse kulstofforbindelser, der er med til at give øllet smag.

    Når gæringsprocessen er færdig, fjerner man gærcellerne fra næringsmediet. Dette gærede medie, nu uden gærceller, kalder vi: ”Den grønne øl.”

    Den grønne øl modnes og filtreres, før vi kan tilsætte kulsyre, og tappe den som færdig øl. Figur 1 viser alle trinene, der indgår i en ølproduktion. Alle trinene vil blive gennemgået i detaljer i de følgende afsnit.

     

     

    Figur 1. Oversigt over de processer der leder til øl på flaske.

    Dette afsnit handler om de processer, der løber forud for selve bryggeprocessen, dvs. omdannelsen af maltbyg til den færdige urt, der skal bruges under gæringen.

    Malt, dvs. spiret byg, er den fundamentale råvare til ølbrygning. Malten bidrager til øllets smag og farve, yderligere er dens proteiner vigtige for dannelsen af skum og sidst, men ikke mindst er den næringskilde for gæren. Byg har et naturligt indhold af stivelse, som findes i små stivelseskorn i frøhviden, se Figur 2. Byg, der bruges til malt, også kaldet maltbyg, adskiller sig fra almindelig byg ved at have et højt stivelsesindhold. Stivelsen nedbrydes bl.a. til maltsukker, der under gæringen omdannes til alkohol. For at maltsukkeret kan blive tilgængeligt for gæren, skal stivelsen i bygkornene først frigøres og nedbrydes. Herefter kan gæren starte med at lave alkohol.

    Fremstilling af malten foregår i tre trin: Støbning, maltning, tørring – og kan evt. afsluttes med en ristning. Derefter knuses malten og blandes med vand, hvorefter mæskningen igangsættes. Denne opløsning filtreres og koges med humle. Resultatet af disse processer er ølurten, der skal bruges i bryggeriet. Alle de nævnte trin vil blive behandleti detaljer i de følgende afsnit.

     

    Støbning

    Under støbningen udblødes bygkernerne i vand i ca. 48 timer, og de optager vand, indtil vandindholdet når ca. 42-48 %. Når vandindholdet når op på dette niveau, vil kimen starte med at producere et hormon, der hedder gibberellinsyre. Gibberelinsyren igangsætter spiringen. Hormonet transporteres til aleuroncellerne, hvor det starter dannelsen af en række enzymer.

    Maltning

    Maltning er bryggerens fagudtryk for den kontrollerede spiring af bygkerner, der foregår på et malteri. Efter støbningen overføres bygkernerne til spirekasser, hvor de får lov til at spire videre i ca. fem dage. I malteriet spires bygkerner i portioner på 1000 ton under ensartede betingelser. Kernerne bliver vendt en gang imellem, for at de kan vokse separat. Hvis rødderne ikke vendes, vil de vikles ind i hinanden og dermed være meget svære at skille ad. Som en naturlig del af spiringsprocessen, danner aleuronlaget og kimen enzymer, der er i stand til at nedbryde de næringsreserver (stivelse og protein), der opbevares i frøhviden.

    Stivelsekornene er omgivet af en proteinmatrix, som skal nedbrydes af proteaser. Proteaser er enzymer, der nedbryder proteiner ved at spalte deres peptidbindingen. Disse dannes i aleuron- og scutellumlagene, før de stivelsesnedbrydende enzymer kan få adgang til stivelsen. Yderligere indeholder frøhviden blandt andet β-glucaner, som er strukturelle komponenter af cellevæggen i frøhviden.

    Om β-glucaner

    β-glucan er et polysakkarid, der består af glucoseenheder, der er holdt sammen af henholdsvis β-1,3 og β-1,4 glykosidbindinger. β-glucan minder derfor meget om cellulose, hvor glukosemolekylerne udelukkende er bundet sammen af β-1,4 glykosidbindinger. β-glucaner nedbrydes af glucanase til glukose. Glucaner er en fællesbetegnelse for polymere af glukosemolekyler. Stivelse er derfor også en glucan, nemlig en α-glucan, da glukosemolekylerne er bundet sammen af α-1.4 glykosidbindinger.

    Figur 2. To forskellige tværsnit af byg. Frøhviden i den modne bygkerne og i malten består af døde celler, mens kimen og aleuronlaget er levende. Det er i aleuron- og scutellumlagene at α-amylaserne dannes. (Aleurone: aleuronlag; endosperm: frøvide; scutellum: skjoldblad; embryo: kim; husk: skal. Bemærk at tegningen er lidt misvisende: aleuronlaget strækker sig også uden om kimen).

     

    To vigtige stivelsesnedbrydende enzymer er aktive under maltningen, nemlig α-amylase og β-amylase. α-amylasen dannes under spiringen i aleuronlaget; α-amylasen ligger derimod som et inaktivt enzym i bygkernens frøhvide, men den aktiveres under spiringen. De to enzymer har forskellig funktion, idet α-amylase klipper de lange stivelsesmolekyler i mindre stykker af varierende længde, hvorimod β-amylase frigør to sammenhængende glukosemolekyler fra hvert af de lange stivelsesmolekyler. Forskellen skyldes, at α-amylase er en endoamylase og hydrolyserer α-1,4 bindinger inde i stivelsesmolekylet, mens β-amylase er en exoamylase, der hydrolyserer α-1,4 bindinger fra den ikke-reducerende ende af stivelsemolekylet ved frigivelse af maltsukker (også kaldet maltose). Forskellene på de to amylaser er illustreret i Figur 3.

    Ud over α-amylase og β-amylase dannes også β-glucanaser, således at β-glucanerne i frøhvidens cellevægge kan nedbrydes. Når cellevæggene nedbrydes, betyder det, at amylaserne får lettere adgang til stivelseskornene. Ud over at give amylaserne lettere adgang til stivelsen, er det meget vigtigt, at en stor del af β-glucanerne i frøhviden er fjernet, inden ølurten skal filtreres, da for høje mængder af β-glucaner forårsager langsom filtrering. Når β-glucaner opløses i vand, dannes der en meget viskøs (tyktflydende) opløsning, som kan stoppe filtret.

    Figur 3. Nedbrydning af stivelse.

     

    Tørring

    Efter spiringen tørres kernerne med varm luft (også kaldt kiln-tørring). Herefter kan kernerne ristes, hvilket benyttes ved produktion af mørkere øltyper. Temperaturen under tørringen og ristningen er altafgørende for maltens karakteristika og farve. Ristes malten ved lav temperatur, bliver den lys, ristes malten derimod ved en høj temperatur, får man en meget mørkere malttype, idet der dannes kemiske bindinger mellem eksempelvis fedtsyrer eller aminosyrer. Når malten ristes ved høje temperaturer, inaktiveres en stor del af enzymerne desuden ved denaturering.

    Fremstillingen af malten er en efterligning af den spiring, der foregår i bygkerner, når de sås på marken om foråret. Når bygkernerne i jorden optager vand på grund af jordens fugtighed, vil kimen danne hormonet gibberellin, der igangsætter spiringsprocessen. α-amylase dannes i aleuronlaget og β-amylaserne aktiveres, således at stivelsen i frøhviden nedbrydes – og proteaser danner aminosyrer og små peptider. Kimen bruger den energi, der er i den nedbrudte stivelse og protein til at spire. Når det første grønne blad ser jordens overflade, er det ikke længere nødvendigt med energi fra den nedbrudte stivelse og protein, da planten nu kan udføre fotosyntese. Frøhviden kan således opfattes som bygkernens ”madpakke” og bruges som energi, når foråret kommer. Det er vigtigt, at man på malteriet stopper spiringen efter fem dage, da stivelsen ellers vil bruges til at danne spirer og rødder, hvilket ikke er smart, når man er interesseret i at brygge så meget øl som muligt.

    Efter tørringen fjernes spirer og rødder fra bygkernerne, og den færdige malt er klar til det næste trin i bryghuset. α- og β-amylaserne, der blev dannet/aktiveret under maltningen, bevares i malten (hvis ikke den ristes ved for høje temperaturer), men enzymaktiviteten udnyttes først under mæskningen.

     

    Mæskningen

    Bygkerner kan indeholde mere end 65 % stivelse. Under mæskningen nedbrydes stivelsen til kulhydrater, der kan forgæres. For at give de forskellige stivelsesnedbrydende enzymer optimale forhold til nedbrydning af stivelsen, foregår mæskningen ved forskellige temperaturer. Mæskningen foregår i store kedler (Figur 4).

    Den færdige malt bliver kvadret (formalet); dernæst blandes den med vand, og mæskningen begynder. En typisk mæskning består af følgende trin, se Figur 5: Indmæsking (blanding af malt og vand ved 37°C i 10 minutter; opvarming til 52°C for at lade β-glucanaser, β-amylaser og proteaser virke (10-15 minutter); videre opvarmning til 68° C for at lade α-amylaserne virke (fra en halv til en time); til sidst afmæskes ved 72° C i 10-15 minutter for at få den sidste del af stivelsen i opløsningen nedbrudt.

    For at den enzymatiske nedbrydning af stivelsen rigtigt kan gå i gang, er det nødvendigt at øge temperaturen til over 60° C for at gelatinisere (forklistre) stivelsen.

    Resultatet af mæskningen er en kompleks opløsning med meget maltose, maltotriose, lidt glukose og ikke-forgærbare sukre, som også kaldes dextriner, se Figur 6 og Figur 7 (grunden til at dextriner er ikke-forgærbare forklares i afsnit 4). Opløsningen består af ca. 75 % forgærbart kulhydrat og kaldes nu urten.

     Figur 4. Kobberkedlerne, der bruges til mæskningen. Med tilladelse fra Carlsbergs Forskningscenter

     

    Figur 5. Eksempel på en mæskeprofil. Der findes mange eksempler på mæskeprofiler. α- og β-amylasens aktivitet styres vha. temperaturen under mæskningen, ved at ændre på temperatur og tid får man en bestemt kulhydratsammensætning af den færdige urt. Bemærk, at α-amylase er meget mere varmestabil end β-amylase.

     

    Figur 6. Struktur af maltose. Maltose betår af to og glukosemolekyler, der er bundet sammen af α-1,4 glykosidbindinger

     

    Figur 7. Struktur af maltotriose. 

     

    Ved at ændre på mæskningstemperaturen er det muligt at favorisere en enzymreaktion over for en anden, idet forskellige enzymer ikke har samme temperaturoptimum. Desuden vil urten være mindre forgærbar, hvis der anvendes høje temperaturer tidligt under mæskningen, idet enzymerne inakiveres ved denaturering.

    Efter mæskningen filtreres mæsken (resultatet af mæskningen) i et sikar eller et mæskfilter. Den faste del der frafiltreres, kaldes masken. Den består blandt andet af skallerne fra malten og den flydende del kaldes urten. Det er urten (også kaldt ølurten), der bruges i bryggeprocessen. Urten smager meget sødt og har en brødagtig aroma.

    Masken indeholder blandt andet cellulose og protein. Den bruges til foder i landbruget.

     

    Kogning

    Efter filtreringen koges ølurten under tilsætning af humle. Kogningen foregår i brygkedlen og varer ca. en time. Under kogningen inaktiveres og koagulerer de enzymer og proteiner, der er til stede. Samtidigt steriliseres urten – hvilket er vigtigt, da der efterfølgende skal tilsættes ølgær. Derved undgås det, at bakterier eller andre gærtyper kan producere uønskede aromastoffer, der forringer øllet. Når urten koges, ændres koncentrationen af de forskellige kulhydrater i opløsningen ikke, da enzymerne er inaktiverede. De hyppigst forekommende kulhydrater i urten er: maltose, maltotriose, glukose, fruktose, samt en række dekstriner, der betegnes som ikke-forgærbare oligosakkarider.

    Efter kogningen har urten en næringsmæssig sammensætning, der gør den velegnet som vækstmedie for gær.

    For at forstå selve gæringsprocessen, er det meget vigtigt at have et godt kendskab til gærsvampen, Saccharomyces cerevisiae, der blandt andet bruges til fremstilling af øl. Saccharomyces er latin og betyder sukkersvamp. Navnet henviser til organismens evne til at omdanne sukker til ethanol og carbondioxid. Ethanol (alkohol) er gærcellernes affaldsprodukt og har ingen videre værdi for cellerne.

     

    Der findes mange forskellige gærarter, men det er kun enkelte, der bruges til ølbrygning. Det skyldes, at gærarterne skal have nogle specielle egenskaber og producere nogle aromastoffer, der er særligt ønskede i øl. Et eksempel på en fremavlet gærstamme til ølbrygning er Saccharomyces carlsbergensis.

    Den første del af dette afsnit vil udelukkende fokusere på S. cerevisiae. De gærstammer, der bruges til ølbrygning, er nært beslægtede med S. cerevisiae. De vil blive nærmere diskuteret sidst i afsnittet.

    Gær er encellede eukaryotiske mikroorganismer. Det vil sige, at de er organiseret ligesom plante- og dyreceller med eksempelvis cellekerne, mitokondrier, endoplasmatisk retikulum, golgiapparat osv., se Figur 8.

    Gærceller har en meget tyk cellevæg, der bl.a. består af glucaner og kitiner, hvilket gør cellerne meget robuste. De forskellige organeller i cellen varetager specifikke funktioner. I peroxisomerne foregår blandt andet nedbrydningen af fedtsyrer (også kaldet b-oxidation). Vakuolerne er vigtige organeller, der sometider fungerer som endestation for intracellulær trafik af proteiner. De indeholder blandt andet en masse uspecifikke proteaser til nedbrydning af proteiner. Desuden bruges de også til at opbevaring af visse aminosyrer.

    Figur 8. Skematisk tværsnit af en gærcelle.

     

    Gæren S. cerevisiae er normalt en diploid organisme ligesom mennesker og har 16 par kromosomer, altså 32 kromosomer i alt. Ligesom det kan forekomme hos grønne planter, kan gær dog også formere sig vegetativt på det haploide stadium. Den har ca. 12 millioner DNA-nukleotidpar og 6200 proteinkodende gener (på den haploide form). Arvemassen er dermed kun ca. tre gange større, end den som colibakterien klarer sig med, og 250 gange mindre end DNA-mængden i en human celle. Man kender ikke funktionen af en tredjedel af de 6200 gener.

    S. cerevisiae er en chemoorganotrof. Det vil sige en organisme, der opnår sin energi ved at oxidere (eller nedbryde) organiske kemiske stoffer. Disse stoffer er hovedsageligt sukre. Yderligere er S. cerevisiaeen fakultativ anaerob, hvilket vil sige, at den under de rette vækstbetingelser kan leve både aerobt og anaerobt. Under oxygenfattige forhold vil S. cerevisiae producere energi ved gæring (alkoholfermentering), altså nedbryde sukker til carbondioxid, ATP og alkohol. Ved høje koncentrationer af glukose, kan gæring også foregå under aerobe forhold.

    De fleste gærarter, der bruges i laboratoriet og i industrien, vokser bedst ved 20-30°C.

    Figur 9. Knopskydning af gær. Gæren er diploid, hvilket er illustreret ved angivelsen af kernen som de to halve cirkler

     

    Gærs livscyklus

    Når gær befinder sig i et miljø, hvor der er gode vækstbetingelser, formerer de sig ved knopskydning. Når knoppen har nået en vis størrelse, afsnøres den, og efterlader et ar på modercellen. Ved afsnøringen kommer modercellen og dattercellen til at indeholde hver sin kerne med et identisk sæt kromosomer, se Figur 9.

    Knopskydning starter på modercellen på et sted, som cellen vælger efter bestemte regler, således aldrig et sted, der har været brugt før.

    Gærceller kan også blive ”gamle”, idet en gærcelle kun kan dele sig et vist antal gange. Det afhænger selvfølgelig af den specifikke gærart, men normalt siger man, at en gærcelle maksimalt kan knopskydes 25 gange.

    I 1935 opdagede Øjvind Winge, som var professor ved Carlsberg Laboratoriums fysiologiske afdeling, at bagegær har køn. Det vil sige, at gær analogt til mennesker har en form for han- og hunkøn, der kaldes kønstype A og α; det gælder dog kun for haploiderne. Man kan ikke se forskel på A- og α-celler, men hvis vækstbetingelserne bliver dårlige (eksempelvis tørke, forhøjet temperatur eller lignende) bruger gærcellerne kønsdifferenteringen. Gærcellerne går under disse forhold over til kønnet formering, og danner sporer. Dannelsen af sporer er en form for overlevelsesmekanisme, der blandt andet sikrer, at gæren kan erhverve sig andre egenskaber, end dem der opnås ved spontane mutationer.

    Figur 10. Gærceller, hvor man kan se forskellige stadier af knopskydning og arvæv efter knopskydning

     

    Ved knopskydning replikeres modercellens DNA, hvorefter der sker en mitotisk deling, således at modercellen og dattercellen kommer til at indeholde hver sin kerne med et identisk sæt kromosomer. Under visse sultbetingelser afløses den mitotiske deling af en meiotisk deling, som består af en DNA-replikation og to efterfølgende kernedelinger. Dette resulterer i fire haploide cellekerner, som indesluttes i hver sin spore, og som indeholder hver et sæt kromosomer. To af sporerene vil være af parringsstype a, og to vil være af parringstype α.

    Når to celler af modsat parringstype mødes, vil der ske fusion af de to celler, hvorefter de to cellekerner sammensmeltes. Resultatet er en diploid gærcelle med to sæt kromosomer. Denne gærcelle kan nu knopskydes, hvis vækstbetingelserne er gode.

     

    Ølgær

    En interessant egenskab ved de fleste stammer af ølgær er, at det ikke, eller kun i ringe grad, danner sporer. Det er muligvis en af grundene til, at egenskaberne fra den gær, som bruges til ølbrygningen, ikke ændres i stor udstrækning. Dette er meget vigtigt, da øllet ellers eksempelvis kunne få en anden smag. På grund af gærs evne til at reproducere sig selv ved knopskydning (omtalt ovenfor under livscyklus), kan man blive ved med at opformere den samme gærstamme som en renkultur. Dermed kan man sikre en ensartet ølbrygning hver gang. Denne viden udnyttede man allerede fra slutningen af 1800-tallet, efter at Emil Chr. Hansen, der var professor ved Carlsbergs Laboratoriums fysiologiske afdeling, isolerede enkelte celler af bryggerigær. Han udviklede en måde, hvorpå gær kunne rendyrkes, så man undgik vildgær i ølbrygningen.

    Figur 11. Saccharomyces cerevisiaes livscyklus. Paringstype a og a er illustreret med hhv. hvide og sorte cirkler. Diploide celler (3) sporulerer under visse sultbetingelser. Sporuleringen resulterer i dannelsen af fire haploide sporer der indesluttes i en sporesæk (5). Når næringsbetingelserne igen er rette, kan cellerne eksistere i en haploid fase (2 og 4). To celler med modsat parringstype kan mødes og danne en diploid gærcelle (1).

     

    Grundlæggende opdeles ølgær i to grupper. Overgær og undergær. Ølbrygning med de to forskellige gærtyper adskiller sig fra hinanden på følgende måder:

    • Overgær stiger til op til overfladen under gæringen sammen med carbondioxidbobler, og danner et tykt gærlag på øllets overflade. Gæringen foregår ved 18-25°C, og under gæringsprocessen er det ikke alt maltsukkeret, der omdannes til alkohol og CO2. Noget af maltsukkeret forbliver derved i det færdige bryg og giver en mere sød og fyldig øl. Yderligere giver den højere gæringstemperatur mere aroma i øllet, hvilket resulterer i en mere frugtagtig og aromatisk øl.
    • Undergær synker til bunds under gæringen, som foregår ved 10 til 16°C. Under processen omdannes næsten al maltsukkeret til alkohol og CO2. Øllet bliver på den måde mindre fyldigt og får et mere rent og neutralt smagsbillede med en mindre kraftig aroma.

    De to ølgærtyper er meget forskellige. Undergær kaldes Saccharomyces carlsbergensis og overgær kaldes Saccharomyces cerevisiae. Undergær har to typer af kromosomer. Den indeholder et eller to sæt, der minder om dem i S. cerevisiae og et eller to sæt der stammer fraSaccharomyces baynus. Den er således en artshybrid og kan genetisk beskrives som værende en permanent amfiploid. Overgær udgør derimod en mere divers mængde stammer, hvoraf de fleste er nært beslægtede med S. cerevisiae laboratoriestammer.

    En af de fysiologiske årsager til, at to gærtyper opfører sig forskelligt, er, at overgær har en forholdsvis hydrofob overflade, mens undergær har en mere hydrofil overflade. Overgær vil således i højere grad bindes til de carbondioxidbobler der stiger til vejrs under gæringen, således at gæren svæver op til overfladen. Undergæren vil i stedet bundfældes, når der ikke længere er flere forgærbare kulhydrater tilbage. Flertallet af de forskellige gærtyper, der bruges til ølbrygning, tilhører overgær, men størstedelen af øl gæres med undergær.

    Undergær adskiller sig desuden i den klassiske systematik fra overgær, idet S. carlsbergensis har MEL-generne, der koder for enzymet melibiase (også kaldet α-galaktosidase). Melibiase nedbryder melibiose, der er et disakkarid bestående af galaktose og glukose. Der findes dog gærstammer, der har MEL-gener, men som i andre fysiologiske henseender samt i genomsekvens klart må regnes for S. cerevisiae.

    For at gæren kan omdanne urten til øl, skal urtens sukre omdannes til ethanol og carbondioxid. Gæringen resulterer også i dannelsen af en del biprodukter, der er meget vigtige for blandt andet øllets smag og aroma.

     

    Efter at urten er færdigkogt, afkøles den, inden gæringen kan startes. Gæringsprocessen varer typisk 3-10 dage og foregår i store gæringstanke (Figur 12). I tankene har gærcellerne ikke adgang til oxygen, da processen skal foregå anaerobt. I starten skal urten derimod indeholde oxygen, så gærcellerne kan lave steroler og fedtsyrer. Gæringen foregår ved forskellige temperaturer afhængig af hvilken øltype, der brygges. Anvender man undergær, foregår gæringen normalt ved 10-16°C; anvender man derimod overgær, er temperaturen lidt højere, nemlig 18-25°C.

    Under gæringen vil gærcellerne som en naturlig del af de stofskifteprocesser, der foregår, udvikle varme. Derfor afkøles tankene under gæringen. Faktisk producerer gærcellerne mere ethanol pr. tid, jo højere temperaturen bliver, men da en højere temperatur resulterer i uønskede aromastoffer, køles tankene ned.

    De biokemiske processer, der foregår inde i gærcellerne under gæringsprocessen, er forklaret i det følgende afsnit.

    Figur 12. Billedet viser gæringstanke med et volumen på hver ca. 2000 hektoliter. Med tilladelse fra Carlsbergs Forskningscenter.

     

     

    Nedbrydning af sukre

    Som nævnt i afsnit 2 indeholder ølurten blandt andet glukose, maltose og maltotriose. De sukre, der findes i urten, nedbrydes i en meget bestemt rækkefølge, da gæren skal hydrolyserere di- og trisakkarider inden de kan nedbrydes i glykolysen. Derfor optages og nedbrydes glukose før maltose og maltotriose. Det skyldes blandt andet en mekanisme, der kaldes glukoserepression, og som sikrer, at gærcellen ikke spilder unødvendig energi på at nedbryde større molekyler, når glukose allerede er til stede.

    Man inddeler sukrene i urten i to kategorier afhængigt af, hvornår de bliver nedbrudt i løbet af gæringen:

    • Hovedgæring: glukose og maltose
    • Sekundær gæring: maltotriose

    Glukose nedbrydes til pyruvat gennem glykolysen. Glukose optages af gærcellen ved en ikke-energikrævende proces, der varetages af specifikke glukose-transportører. Derefter phosphoryleres glukose af det første enzym i glykolysen, hexokinase. Glykolysen er en betegnelse for en række reaktioner (1-10 i Figur 13), der foregår i cytoplasmaet, og som resulterer i dannelsen af to pyruvatmolekyler. Man kan kalde det for en spaltning af glukosemolekylet, da glukose indeholder seks carbonatomer, mens pyruvat kun indeholder tre.

    I vores celler nedbrydes glukose også gennem glukolysen til pyruvat i cytoplasmaet; pyruvat omdannes videre til oxaloacetat. En mindre del af oxaloacetaten overføres til mitokondrierne, hvor det indgår i citronsyrecyklussen. Den mængde oxaloacetat, der overføres til mitokondrierne og indgår i citronsyrecyklussen, er lige netop stor nok til at opretholde citronsyrecyklussen.

    Gærceller har også mitokondrier og er derfor ligesom vores celler i stand til fuldstændigt at nedbryde glukosen til carbondioxid og vand. Den overordnede funktion af glykolysens og citrosyrecyklussens mange trin er gradvist at overføre den energi, der er i glukosemolekylet til en ”energivaluta” i form af ATP. Skete hele omdannelsen i et enkelt trin, ville den energi, der er i glukosen, ikke kunne ”fanges”, og der ville tabes en stor mængde energi i form af varme.

    Hvorfor er der alkohol i øl?

    Under anaerobe forhold er gærcellerne dog ikke i stand til fuldstændigt at nedbryde pyruvat. Den fuldstændige nedbrydning til carbondioxid kræver nemlig oxygen. Oxygenen indgår ikke i reaktionerne i glykolysen eller citronsyrecyklus, men derimod i de redoxreaktioner i respirationskæden, hvor NADH og FADH2 oxideres. Oxygenen bruges som oxidationsmiddel for coenzymet NADH. Dette coenzym bliver i glykolysen og citronsyrecyklus reduceret, da det modtager hydrogenatomer samt elektroner.

    Det er i respirationskæden, som foregår over den indre membran i mitokondrierne, at NADH oxideres tilbage til NAD+ under dannelse af vand:

    NADH + H+ + ½O2 → NAD+ + H2O

    Under anaerobe forhold er respirationskæden ikke aktiv. Efter en kort periode med anerobe forhold stopper citronsyrecyklussen også med at virke. Det gør den fordi NADH ikke oxideres. Gærcellerne er dog nødt til at få energi på én eller anden måde. Som man kan se på figuren, resulterer glykolysen, udover pyruvat, også i 2 molekyler. ATP og to molekyler NADH. Da der kun findes en begrænset mængde NADH i cellen, er gærcellerne nødt til at finde en måde at regenerere dette molekyle til NAD+, fordi det skal bruges i reaktion 6 (se Figur 13).

     

    Figur 13. Pyruvats omdannelse til ethanol

     

    Gærcellerne kan regenerere NADH ved at danne alkohol (reaktion 11 og 12 i Figur 15). Først fraspaltes et carbondioxidmolekyle fra pyruvat, hvorved der dannes acetaldehyd. Derefter reduceres acetaldehyd til alkohol. Reduktionen af acetaldehyd kobles til oxidationen af NADH til NAD+, en såkaldt redoxreaktion. Se ovenfor.

    Nedbrydelse af maltose og maltotriose kræver, at sukrene optages ved hjælp af nogle specifikke transportproteiner. Når maltose og maltotriose er blevet optaget, hydrolyseres de af intracellelulære α-glukosidaser (blandt andet maltase) til glukose (husk, at maltose består af to glukoseenheder, der er bundet sammen af en α-glykosidbinding). Denne glukose indgår dernæst i glykolysen ligesom den glukose, der blot optages. Sukkermolekyler, der består af mere end tre hexose-enheder, kan ikke nedbrydes af gærcellerne. Disse sukre går under betegnelsen ikke-forgærbare kulhydrater. Det skyldes, at ølgær ikke har enzymerne til at nedbryde dextrinerne (eksempelvis α-amylase, der er omtalt i afsnit 2). Disse sukre vil derfor også være til stede i det endelige øl. Gærcellerne har også brug for nitrogen for at vokse; dette får de fra aminosyrer, der er fremkommet ved nedbrydning af proteiner under mæskningen. Under gæringen er det meget vigtigt at følge med i, hvor aktive gærcellerne er. Man måler derfor dagligt alkoholprocenten og hvor meget maltsukker, der er tilbage i øllet. Ølgær når sjældent mere end 3-4 % alkohol, før væksten og gæringen standser. Væksten standser dog ikke på grund af alkoholkoncentrationen, men udelukkende fordi næringskilden er opbrugt.

    Dannelse af biprodukter

    Smagen og aromaen af øl er meget kompleks, og den stammer ikke kun fra malten og humlen, men også fra nogle af de biprodukter, gæren producerer under gæringen og modningen. De mængdemæssigt vigtigste biprodukter er alkohol og carbondioxid. Ud over små mængder af glycerol og acetaldehyd dannes også spor af en række organiske syrer, blandt andet eddikesyre, ravsyre og mælkesyre. Der dannes også en del alkoholer, eksempelvis isoamylakohol og α-amylalkohol, som stammer fra gærcellernes omsætning af aminosyrer. Selvom koncentrationen af mange af disse forbindelser er meget lille, har de stor indflydelse på den færdige øl, da de smager meget kraftigt. Under hovegæringen dannes der eksempelvis velsmagende estre, heriblandt ethylacetat.

    Af de forskellige biprodukter, der dannes, er diacetyl meget vigtig. Diacetyl er en vicinal diketon, der er et biprodukt fra biosyntesen af de to aminosyrer leucin og valin. Diacetyl er et stort problem i ølbrygning, da stoffet har en smøragtig smag. Samtidig er vores smagsløg meget sensitive over for stoffet; det vil sige, at selv meget lave koncentrationer kan smages (helt ned til 0,10 mg/L). Diacetyl fremkommer spontant, dvs. ikke-enzymatisk ud fra α-acetolaktat. α-acetolaktat er et mellemprodukt i biosyntesevejen af valin og leucin. Det enzym, som omdanner α-acetolaktat til det næste mellemprodukt i syntesevejen, er ikke særligt effektivt. Derfor ophobes α-acetolaktat i gærcellen og eksporteres ud i øllet. I øllet omdannes α-acetolaktat spontant til diacetyl (Figur 14).

     

    Figur 14. Dannelse af diacetyl.

     

    Diacetyl fjernes igen fra øllet ved hjælp af to enzymer under den efterfølgende modningsproces (se mere under modningsafsnittet).

    Gæren fjernes efter hovedgæringen. Gæren kan bruges til nye gæringer, og den genbruges normalt 5-10 gange, inden den kasseres. Afhængigt af om der er blevet brugt under- eller overgær, opsamles cellerne på lidt forskellige måder. Når gæringen er afsluttet, bundfældes gærcellerne, hvis der er anvendt undergær. Gærcellerne kan høstes til brug i en ny gæring, ved at de pumpes ud af bunden af gærtanken. Hvis der i stedet er anvendt overgær, stiger gærcellerne op til overfladen og danner et tykt gærlag på øllets overflade. Dette lag kan skummes væk og opsamles. Ikke alle gærceller bundfælles eller stiger op til overfaden, så nogle vil forblive i suspension. Disse er ansvarlige for modningen af øllet, da de blandt andet er med til at nedbryde diacetylen.

    Efter hovedgæringen er øllet en uklar væske, der endnu ikke har smag som en rigtig øl.

     

    Modning

    Under hovedgæringen dannes en del smags- og aromastoffer, der er uønskede i den færdige øl. Derfor lagres øllet. Lagring er en proces, hvor øllet opbevares afkølet i et længere stykke tid (lagringen kan vare fra et par dage op op til fire måneder) efter gæringen. Øllet opbevares køligt, ved ca. 2-6°C men den valgte temperatur afhænger meget af øltypen.

    Under lagringen foregår den sekundære gæring, hvor den mængde gær, der er tilbage i øllet, nedbryder de sidste forgærbare kulhydrater (primært maltotriose, men det afhænger af proces og øltype). Nedbrydningen af disse kulhydrater resulterer i produktionen af en stor del af den kulsyre, der findes i det færdige øl. Den carbondioxid, der dannes under den sekundære gæring, er desuden med til at reducere mængden af svovlholdige stoffer, idet der sker en udvaskning, da de svovlholdige stoffer følger med carbondioxiden ud af gæringstanken. Lagringsprocessen er meget vigtig, da smagen forbedres, idet mængden af uønskede smagskomponenter i øllet reduceres. Eksempelvis nedbrydes diacetyl under modningen. Nedbrydelsen af diacetyl sker i to trin. Alle de enzymatiske reaktioner til nedbrydelse af diacetyl foregår inde i gærcellerne, derfor optages diacetyl først af gærcellen. Dernæst reduceres diacetyl ved hjælp af et af de to isoenzymer, diacetyl reduktase og acetoin dehydrogenase, til acetoin under oxidation af NADH. Acetoin reduceres videre til butandiol ligeledes under oxidation af NADH. Butandiol er en næsten smagsløs alkohol. Resultatet vil således være, at gærcellen omdanner et utroligt uønsket aroma-aktivt stof til en alkohol, der næsten ikke kan smages.

    Når øllet afkøles til tæt på dets frysepunkt, sker der en udfældning af forskellige stoffer. I frøskallen i maltbyg findes nogle polyphenoler af den type, der kaldes proanthocyanidiner. Disse stoffer går i opløsning under mæskningen og havner i det færdige øl, hvor de udfælder øllets proteiner. Dette medfører, at øllet bliver uklart; derfor filtreres de fleste slags øl efter lagringen, så de udfældede stoffer fjernes. Nogle øl, eksempelvis visse hvedeøl, filtreres dog ikke, og fremstår derfor som uklare.

    Den næste proces, der følger efter filtreringen, er justering af carbondioxidindholdet i øllet, og ofte vil man tilsætte lidt ekstra carbondioxid. Kun ca. 15 % af den carbondioxid gærcellerne danner, forbliver opløst i øllet. Resten forsvinder under gæringen. Carbondioxid øger øllets fylde og evne til at danne skum. Carbondioxid er desuden en smagsforstærker og spiller en stor rolle i at forlænge øllets holdbarhed. Mængden af carbondioxid, der kan opløses i øllet, afhænger af temperaturen og af det tryk, der er på overfladen af væsken.

     

    Tapning

    Til sidst tappes det færdige øl. I forbindelse med aftapning på flaske, dåse eller fustage, vil øllet normalt blive pasteuriseret enten før -, i forbindelse med – eller efter tapningen. Herved uskadeliggøres uønskede bakterier, og holdbarheden af øllet forlænges. Nogle øl pasteuriseres dog ikke; det gælder f.eks. visse belgiske øltyper. Disse har derfor ofte et større eller mindre indhold af levende gærceller.

    Figur 15. Oversigt over, de kemiske reaktioner i omdannelsen af glukose til alkohol. 

     

    Infektionsorganismer i øl

    Det er vigtigt, at ølbrygningen finder sted under hygiejniske forhold; der skal nemlig meget lidt forurening til, for at øllet får en forkert smag.

    De mikroorganismer, der kan skade øl, er begrænset til nogle få arter indenfor bakterier, vildgær og skimmelsvampe. Øl har som et resultat af gæringen en pH-værdi på ca. 4-5, hvilket betyder, at øl er et forholdsvis uhensigtsmæssigt vækstmedie for de fleste mikroorganismer. Alkoholkoncentrationen, den lave pH og tilstedeværelsen af humle, hæmmer væksten af de uønskede mikroorganismer. Desuden vil manglen på næringsstoffer begrænse væksten af de celler, der overlever de hårde betingelser. Ikke desto mindre kan nogle af disse mikroorganismer påvirke gæringen og have effekter på øllets smag og holdbarhed. Blandt bakterierne kan mælkesyre- og eddikesyrebakterier skade øllet. Har øllet en forkert sur smag, er der en god chance for, at det er pga. mælkesyrebakterier. Nogle bakterier kan også forårsage, at diacetylniveauet i øllet er forhøjet. Disse bakterier kaldes for ølpediokokker og kendes for deres særegne form. Pediokokker er kendetegnet ved, at otte celler ofte sidder bundet sammen i terningform.

     

    Gærcellerne aktiveres fra en ”dvale-tilstand” når de tilsættes urten. Når gærceller vokser aerobt kan vækstfaserne opdeles i tre: lag-fase, eksponentiel-fase, stationær-fase og døds-fase, se Figur 16.

    Når en population af mikroorganismer inokuleres i et friskt medie, vil væksten normalt ikke starte med det samme, men først efter en tidsperiode, der kaldes lag-fasen. Længden af lag-fasen af er blandt andet afhængig af vækstbetingelserne, som eksempelvis temperatur og næringskilde. Derefter indtræder den eksponentielle fase. Som nævnt før deler S. cerevisiae sig ved knopskydning, således at en celle bliver til to celler. To celler bliver til fire celler, som bliver til otte celler og så videre. Dette resulterer i, at der sker en fordobling af celleantallet. Fordoblingstiden (den tid det tager for at celletallet fordobles) er også afhængig af vækstbetingelser. Til sidst når næringen i mediet er opbrugt, vil gærcellerne indtræde den stationære fase. Efter den stationære fase, indtræder den sidste fase, nemlig dødsfasen. I denne fase går gærcellerne til grunde, hvilket skyldes mangel på næring.

    Figur 16. Vækstkurve for mikroorganismer i flydende kultur.

     

    Gærceller, der vokser på glukose gennemgår to eksponentielle vækstfaser. I den første vækstfase forbruges glukosen. Når glukosen er opbrugt vil cellerne indtræde en ny vækstfase. Dette skyldes at cellerne bruger nogle af de affaldsprodukter, der er blevet produceret i den første eksponentielle fase. I denne fase vil gærcellerne eksempelvis vokse på ethanol. Dette vil dog udelukkende ske, når gærcellerne vokser aerobt.

    Helt analogt til den aerobe vækst er der et vækstforløb for gærceller der vokser anaerobt. Når man brygger øl vil man normalt inddele disse i fire faser: Lag-fase, vækstfase, gæringsfase og sedimenteringsfase.

    Når gærceller tilsættes urten, er deres første prioritet at reproduceres. Oplagret glykogen nedbrydes til glukose og bruges af gærcellerne til reproduktion (knopskydning). I starten af lagfasen bruges urtens sukre ikke, glykogen er derfor en meget vigtg næringsreserve. Vækstfasen omtales ofte også som respirationsfasen. Denne fase er meget tydelig, idet der dannes en masse skum på overfladen af urten, der skyldes den kuldioxid der frigives ved nedbrydning af sukrene. I denne fase falder pH kraftigt. Gæringsfasen følger lige efter vækstfasen og starter når oxygenen er opbrugt, det vil sige at det er en anaerob fase. Under denne fase dannes kuldioxid, ethanol og smagsstoffer. De fleste ølgær forbliver i urten i tre til syv dage, hvorefter sedimenteringsfasen starter. Under sedimenteringsfasen, flokkulerer cellerne og bundfældes. Cellerne begynder at undergå en proces, der igen forbereder dem til dvaletilstanden. Dette gøres ved at producere et stof der hedder glykogen. Glykogen er nødvendig for vedligeholdelse af cellen under dvalen og bruges også som energikilde under lagfasen.

  • Opgaver

    Opgaver – Teoretiske spørgsmål

    Nedenfor er nogle spørgsmål, som berører den centrale teori for emnet, og som kan hjælpe med at opklare nogle af de centrale teoretiske elementer. Du kan besvare alle spørgsmål ud fra teorien ovenfor.

    1. Nedskriv de biologiske processer, der foregår under hvert trin i de processer der indgår i produktion af øl (brug evt. Figur 1 i introduktionsafsnittet).

    2. Forklar hvad aerob og anaerob betyder og opskriv reaktionen for aerob og anaerob nedbrydelse af glukose.

    3. Forklar med egne ord hvad termerne haploid og diploid betyder.

    4. Forklar med egne ord hvad termostabilitet betyder.

    5. I hvilken del af mæskningen bliver størstedelen af maltsukkeret frigivet?

    6. Gærsvampen Saccharomyces cerevisiae er en meget vigtig industriel organisme. Hvad bruges denne svamp til udover at lave øl?

    7. Hvilke substrater vokser gær på? Forklar hvorfor gærceller ikke vokser på stivelse.

    8. Forklar forholdet mellem genotype og fænotype. Hvordan kan en celles metabolisme ændres og hvilke muligheder det giver?

    9. Forklar hvorfor det er vigtigt at der under modningen af øl stadig er gærceller tilbage.

    10. Forklar hvorfor gærceller kan blive ”gamle”.

    11. Hvorfor er det vigtigt præcist at vide hvilken gærstamme man bruger til fremstillingen af øl, og hvilke konsekvenser kan det have at bruge en ”forkert”.

    12. Forklar ud fra en NAD+/NADH balance hvorfor en gærcelle producerer ethanol under anaerobe forhold.

    13. Hvorfor er det vigtigt, at både 𝛼- og 𝛽-amylase er aktive under mæskningen?

    a. Hvad ville der ske med den efterfølgende gæring, hvis et af enzymerne ikke var aktive?

    b. Hvad ville der ske hvis enzymerne ikke blev inaktiveret efter mæskningen?

    14. Hvad ville der ske, hvis bygkernerne under spiringen fik lov til at spire i mere end fem dage. Hvad ville der ske hvis bygkernerne ikke får lov til at spire længe nok?

    15. Tegn strukturen for glucose og maltose. Forklar hvad de to sukkermolekyler har tilfælles.

    16. Beskriv de strukturelle forskelle mellem 𝛽-glucan og cellulose og mellem 𝛽-glucan og stivelse. Forklar hvorfor stivelse også kaldes en 𝛼-glucan?

    17. Ved mæskning ved lav temperatur (< 65°𝐶) op når man meget forgærbart sukker, mæskes istedet ved høj temperatur (> 65°𝐶) får man mere ”ikke-forgærbart” sukker, hvilket resulterer i en alkoholsvagere og sødere øl. Forklar hvorfor det er tilfældet.

    18. Nævn nogle forskelle mellem gærceller og bakterieceller.

    19. Beskriv hvordan diacetyl dannes og hvorfor det er uønsket i øl.

    20. Forskere indenfor bioteknologi bruger gær når de laver genteknologi. Saccharomyces cerevisiae har GRAS (generally regarded as safe) status. Dette betyder at S. cerevisiae er sikker at arbejde med og kan bruges til produktion af fødevarer. Hvorfor tror du at S. cerevisiae har GRAS status?

     

    Opgaver kan hentes som pdf her.

  • Forsøg

    Formålet med laboratorieøvelserne er at få en forståelse for de biokemiske processer der foregår i gærceller, samt vise nogle af de meget simple teknikker man kan bruge for at undersøge disse.

    Der er 6 øvelser til projektet:

    Øvelse 1: Gær i ballon

    Øvelse 2: Påvisning af sukraseaktivitet

    Øvelse 3: Påvisning af sukraseaktivitet i upasteuriseret øl

    Øvelse 4: Rendyrkning af gær

    Øvelse 5: Gæring af æblejuice

    Øvelse 6: Vækstforsøg med gær

     

    Faglig forberedelse

    Før øvelsen udføres er det vigtigt, at du har kendskab til kulhydraters opbygning samt en forståelse for hvordan sukre kan nedbrydes enzymatisk. Desuden er det vigtigt at vide hvordan cellen er opbygget. Alt dette kan du lære ved at læse de teoriafsnit der hører til dette projekt.

     

    Praktiske informationer

    Skulle det ske at det ikke er muligt at gennemføre alle øvelserne, kan de enkelte øvelser sagtens stå alene.

    Desuden er det muligt for eleverne at gennemføre nogle af øvelserne hjemme på køkkenbordet.

     

    Lærervejledning kan hentes her.

    Herunder kan du se vejledningsvideoer til øvelserne

    Gærs vækstfaser

    Gær og temperatur

    Gæren i øllet – sukraseaktivitet

    Gæren i øllet – renstrygning

    Hvis du har spørgsmål af enhver art til øvelsen, er du meget velkommen til at kontakte Biotech Academy. Så vil vi forsøge at hjælpe bedst muligt, hurtigst muligt.

    Rigtig god fornøjelse med øvelsen!

Kildehenvisning:
Dette projekt blev udgivet i november 2008. Det er udarbejdet af Biotech Academy og er blevet opdateret løbende.