Hvad er fermentering?

Denne underside om fermentering udgør anden del af teorien for Biotech Academys materiale om fermentering.

 

Fermentering er den proces, hvor man dyrker mikroorganismer industrielt for at producere et bestemt stof. Produkterne kan være medicin, enzymer, farvestoffer og mange andre ting. Både svampe og bakterier bruges til disse fermenteringer.

Den generelle opbygning af en fermenteringsproces starter med, at man producerer det medie der skal bruges. Et medie indeholder de næringsstoffer, som mikroorganismen skal bruge for at overleve. Derfor er det en stor fordel, hvis man har et dybdegående kendskab til den organisme, som man skal bruge. Når man har lavet mediet, skal det steriliseres sammen med fermenteringstanken og eventuelt tilbehør. Sterilisering betyder, at man dræber alle de mikroorganismer, som f.eks. kom ind i tanken, da man samlede den. Hvorfor sterilisering er vigtigt, vil du læse senere.

Først efter steriliseringen tilføres tanken de mikroorganismer, som man har valgt at arbejde med. Dette kaldes podningen (inokulering). Herefter gælder det om at give mikroorganismerne de mest optimale forhold for at få dem til at producere så meget som muligt. Det kan f.eks. være, at man skal sørge for, at der er den rigtige temperatur i tanken. Når fermenteringen er færdig eller bliver afsluttet, så udvinder man produktet og fjerner andre stoffer. Desuden sørger man for ordentlig oprydning og bortskaffelse af eventuelle affaldsprodukter.

For at opnå det største udbytte, er der mange forskellige ting man skal tage højde for. Anabolisme dækker over de reaktioner, som kræver energi. At opbygge et produkt fra næringsstoffer er en anabolsk proces, og den bruger energi for at forløbe. Katabolisme er det modsatte. Kataboliske reaktioner frigiver energi, når større molekyler nedbrydes til mindre. Disse to ting er vigtige at huske, da man skal bruge både energi og små molekyler til opbygning af det ønskede produkt.

Fermenteringsprocessen vil nu blive gennemgået i de trin, som man også udfører i virkeligheden.

Vækstforhold
Mikroorganismer kræver forskellige næringsstoffer for at kunne vokse. Væksten er afgørende for, at mikroorganismen producerer en stor mængde produkt. Man skal huske at tage højde for, at mikroorganismer er forskellige. Nogle organismer kræver et slags næringsstof, mens andre måske foretrækker et andet. Der kan også være forskel i mængden, der er behov for. Nogle næringsstoffer er nødvendige i store mængder, mens andre kun er nødvendige i små mængder.

 

Figur 5. I fermentering tilsættes et vækstmedie og mikroorganismer til en steril fermenteringstank. Mikroorganismerne vokser og producerer et ønsket produkt, der til sidst oprenses.

Fire grundstoffer er nødvendige for vækst, det drejer sig om:

• Carbon (C)
• Nitrogen (N)
• Hydrogen (H)
• Oxygen (O)

Du har lært, at en celle hovedsageligt består af vand og makromolekyler – proteiner, lipider, nukleinsyrer og kulhydrater. Udover de fire grundstoffer kan det også være nødvendigt at tilsætte andre grundstoffer i større eller mindre mængde. Dette drejer sig om:

• Fosfor (P)
• Svovl (S)
• Selen (Se)
• Kalium (K)
• Calcium (Ca)
• Jern (Fe)

Kalium og jern kan være nødvendige for aktiviteten af flere enzymer og for proteiner, mens calcium kan hjælpe nogle mikroorganismer med at stabilisere deres cellevæg. Vækstfaktorer, som tilføjes i små mængder, er vitaminer og aminosyrer. Disse tilføjes, selvom de fleste mikroorganismer selv er i stand til at danne dem. Ved at undersøge sammensætningen af næringsstoffer i det miljø, som mikroorganismen oprindeligt lever i, kan man få oplysninger om hvilke stoffer, der vil være nødvendige og vigtige at tilføre for at opnå en god vækst. Det er ikke godt, hvis mikroorganismer ikke kan leve under de forhold, som man har sat op til dem. Så vil man ikke få produceret det ønskede produkt.

Medie
Alle de nævnte stoffer, som tilføres for at sikre en god vækst, findes i et dyrknings-medie. Mediet designes ud fra forskellige parametre, bl.a. hvilken slags mikroorganisme der skal arbejdes med. At designe dette medie er ikke nemt, og man må være meget opmærksom under forberedelserne, for at opnå en god produktion. Der findes i dag mange mikroorganismer, som endnu ikke er blevet dyrket i et laboratorium eller i en fermenteringstank. En af grundene til dette er, at man ikke har kunnet give dem de rette næringsforhold.

En problemstilling, som virksomhederne ofte arbejder med, er:

Produktion af størst muligt udbytte af produktet per gram forbrugt medie.

Derudover skal der gerne produceres et minimalt udbytte af andre produkter, som man ikke ønsker. Krav til mediet er, at det skal være nemt at producere, og at det skal være billigt.

Der findes to forskellige kategorier af medier – et defineret medie og et komplekst medie. Når man producerer et defineret medie, så ved man præcist, hvad det indeholder, og man ved præcist, hvor meget man tilfører af de forskellige stoffer. Man kender derfor den specifikke sammensætning af mediet. Et komplekst medie består af komponenter, hvor man ikke kender den præcise sammensætning. Man er altså ikke helt klar over, i hvilke mængder de forskellige stoffer findes i mediet.

Man kan sige, at et defineret medie laves ud fra en opskrift, hvor man får opgivet hvor mange gram, man skal tilføje af hver ingrediens. Et komplekst medie er så opskriften, hvor der kun er givet navnet på ingredienserne – men ikke mængden. I et defineret medie ved du, at du skal bruge 10 gram sukker, men i et komplekst medie ved du kun, at du skal bruge sukker. Fordelen ved et komplekst medie er, at det er lidt billigere end et defineret medie.

Som tidligere nævnt er der nogle vigtige stoffer, der skal tilføjes til en fermentering for at opnå gode vækstforhold. Når man producerer mediet, kommer disse stoffer fra forskellige kilder.

• Carbon
  Carbon kan komme fra f.eks. glukose. Carbon findes i kulhydrater, og normalt vælger man at bruge stivelse, da det er nemmest at skaffe. Valget kan dog falde på et andet materiale alt efter, hvilket produkt man ønsker at producere. Ofte vil produkter af lav værdi blive produceret i store mængder, mens produkter af høj værdi vil blive produceret i mindre mængder. Hvis man skal producere et produkt af høj værdi, kan man vælge en lidt dyrere carbonkilde, da man ikke skal bruge så meget.

• Nitrogen
  Nitrogen finder man enten i et organisk eller uorganisk materiale. Organiske materialer, som indeholder nitrogen er aminosyrer eller proteiner. Uorganiske stoffer, som indeholder nitrogen, er ammoniumsalte.

Herudover skal mediet tilføres de mineraler, grundstoffer og vitaminer, der er nødvendige for vækst. Og til sidst skal der tilføres vand. Nu har vi lavet et medie. Det næste trin er at bygge en fermenteringstank, som vi kan putte mediet i.

Fermenteringstank
En fermenteringstank kaldes også for en bioreaktor. De vigtigste egenskaber for en fermenteringstank er, at den er steril og at man kan måle og styre en række forhold, f.eks. temperaturen. Det man tilfører og får i udbytte kan derved nøje kontrolleres.

Selve reaktoren kan enten være lavet af glas eller stål. Ofte er små tanke lavet af glas, mens store tanke er lavet af stål. De findes i mange forskellige størrelser, alt efter om de bruges til forskning eller produktion med henblik på salg.

For at have en reaktor kørende, skal man have adgang til elektricitet, vand og luft. Luften kan enten være oxygen, nitrogen eller kuldioxid. Luften tilføres væsken i tanken gennem nogle rør. I enden af røret er der et lille hul, så luften kan komme ud i væsken og blive opløst. Inden luften kommer ned i tanken, skal det igennem et sterilfilter. Dette gøres for at undgå kontaminering.

Når luften er kommet ind i tanken, skal den fordeles rundt til cellerne. Nede i tanken findes en omrører. Den hjælper med at overføre luften til væsken og med at fordele luft og næringsstoffer rundt i hele tanken til alle celler. Omrørerene kan have forskellige former. Det er vigtigt, at formen ikke ødelægger cellerne. Ud over en omrører sidder der også et redskab, som kaldes en strømbryder. Det er nogle plader, der sidder fast i tanken. Pladernes formål er at bryde strømmen, således at næringsstoffer og oxygen bliver fordelt bedst muligt.

Ud over rør til luft, omrører og strømbrydere sidder der forskellige målesonder, som har kontakt med væsken. En af disse sonder måler hvor meget luft (oxygen, nitrogen eller kuldioxid), der er opløst i væsken. Denne måling er vigtig, da man skal holde øje med, om cellerne får den helt rigtige koncentration af oxygen tilført.

Der er også en pH-måler. Du har lært, at mikroorganismer kræver forskellige forhold. Nogle vokser bedst ved en pH på 2, mens andre vokser ved en neutral pH. Ved hjælp af pH-måleren kan man tilføre syre eller base for at rette op på pH-niveauet. Hvis pH er for lav, tilføres base, og hvis pH er for høj, tilføres syre. Der skal derfor tilsluttes pumper og rør, som kan lede enten syre eller base ind i tanken.

 

Der findes også en temperaturmåler. At kunne ændre temperaturen er vigtigt, da den godt kan svinge under fermenteringen. Hvis det er for varmt, vil cellerne dø, og hvis det er for koldt, kan cellerne ikke vokse hurtigt nok, og produktionen vil derfor tage længere tid. Man kan ændre temperaturen på to forskellige måder – med eller uden en dobbeltvæg rundt om tanken. Med en dobbeltvæg menes et ekstra rum med vand rundt om tanken. Vandet regulerer temperaturen inden i tanken ved enten at: 1) fjerne varme, hvis vandet har en lavere temperatur end det, som er inden i tanken; eller 2) tilføre varme, hvis vandet har en højere temperatur. Man kan styre vandets temperatur via en computer.

Man ønsker også at have mulighed for at kunne tage sterile prøver ud fra tanken. Det kan foregå fra en åbning i toppen af tanken med en steril sprøjte.

Figur 6. Opstilling af en fermenteringstank, på laboratorie skala. Fermentoren har sensorer til at følge mikroorganismernes vækst, sprøjter til prøvetagning, samt luft- og medie-tilstrømning.

 

En fermenteringstank består altså af følgende:

• En tank
• En omrører, der er forbundet med en motor
• En pumpe og et filter til luft samt et rør til indføring af luft
• Strømbrydere
• Målere til pH, temperaturen og niveauet af opløst luft
• En åbning tilknyttet sprøjter til udtagning af prøver
• pH-reguleringssystem i form af syre og base med pumper og slanger ind til tanken
• Temperaturreguleringssystem i form af en dobbeltvæg med vand eller en enhed, der kan tilføre eller fjerne varme fra et medie

I den moderne verden er der mange processer, som er blevet automatiske takket være computere og robotter. Instrumenterne, som man bruger til at måle luft, pH og temperatur, er koblet til en computer, der hele tiden holder øje med værdierne. Det kan f.eks. ønskes, at pH værdien skal være 7 gennem hele processen. Måske falder pH i tanken til 4 om natten, og hvis der ikke bliver tilsat base, så slår den lave pH mikroorganismerne ihjel. Computeren har registreret, at pH værdien er faldet, og derfor tænder den for nogle pumper, som kan pumpe base ind i tanken. Næste morgen, lever vores mikroorganisme heldigvis stadig. Uden denne automatik skulle fermenteringen startes forfra. Efter mediet er produceret og fermenteringstanken er bygget – hvad skal der så ske?

 

Tre typer fermenteringer
Inden en fermentering starter, skal man have fundet ud af, hvilken slags fermentering, man gerne vil køre. Der findes tre forskellige typer fermenteringer:

• Batch
  I en batch fermentering er alle næringsstoffer i tanken fra starten. Herefter podes der med mikroorganismen. Fermenteringen stopper, når det begrænsende næringsstof er opbrugt. Med det menes, det næringstof som opbruges hurtigst og derved stopper fermenteringen.
• Fed-batch
  I en fed-batch fermentering tilføres der løbende næringsstoffer, efter at fermenteringen er sat i gang. Det kræver derfor ekstra udstyr i form af en pumpe til at føre næringsstof ind i tanken. Her stopper fermenteringen, når tanken er fyldt, og der ikke kan være mere i den.

• Kemostat
  I en kemostat bliver der også tilført næringsstoffer efter podning, men der bliver også fjernet celler, brugte næringsstoffer og produktet. Denne metode benyttes ofte i industrien. Der skal bruges ekstra udstyr i form af en pumpe til at få næringsstof ind i tanken og en pumpe til at få celler ud af tanken.

 

Figur 7. De tre typer fermentering: Batch, Fed-batch og kemostat. Se tekst for detaljer.

Der er forskellige fordele og ulemper ved de forskellige typer fermenteringer. Alt efter hvilken organisme man arbejder med og hvilket produkt, man gerne vil have ud, så vælger man en af de tre typer.

Efter at mediet og fermenteringstanken er fundet og typen af fermenteringstank er bestemt, skal mediet og tanken steriliseres. Dette gøres ved at brug af meget høje temperaturer og tryk, som dræber de eventuelle mikroorganismer, som kunne findes i tanken eller mediet. Det er meget vigtigt, at der ikke er andre mikroorganismer i tanken end den eller dem vi ønsker at arbejde med.

Hvis der er andre til stede, kan der opstå en konkurrence om næringsstoffer mellem vores mikroorganisme og de uønskede. Der kan ske det, at de uønskede vinder og derved optager alle næringsstoffer. I denne situation vil der ikke blive produceret noget af det ønskede produkt, og man skal starte helt forfra med at producere et nyt medie. Derfor er det også vigtig at have handsker på og huske at spritte hænderne af med ethanol.

Når vi har sikret os, at mediet og tanken er sterile, kan vi tilføre mikroorganismen til tanken. Det kaldes som nævnt for podningen. Det er meget vigtigt, at man også udfører podningen sterilt, så vi ikke får tilført andre organismer end den, vi skal bruge. Man kan tilføre organismen ved hjælp af en sprøjte, som man stikker igennem en membran øverst i låget. Så snart man fjerner sprøjten igen, lukker hullet i membranen sammen. Heldigvis lykkedes det os at pode uden kontaminering! Nu er vores del af arbejdet færdigt, og mikroorganismen begynder at arbejde for os.

Undervejs er det vigtigt at holde øje med de forskellige forhold, så man er sikker på, at mikroorganismen har det så godt som muligt. Man skal holde øje med pH, opløst luft og temperatur. Undervejs kan man også holde øje med væksten af mikroorganismen nede i tanken. En god vækst er nemlig et tegn på en god produktion. En mikroorganisme kan være i forskellige vækstfaser, som alle kan give os en ide om, hvor god produktionen er på det pågældende tidspunkt.

• “Nølefasen”
  I starten findes der en ”nølefase” også kaldt for ”lag fasen”, hvor man ikke ser nogen vækst eller kun meget lille vækst. Mikroorganismen skal lige vænne sig til forholdene og mediet i tanken, før mikroorganismen begynder at optage og omdanne næringsstofferne.

• “Den eksponentielle fase”
  Denne fase starter, når cellerne begynder at fordoble sig i et bestemt tidsinterval. Hvor hurtigt de vokser og deler sig, afhænger af, hvor gode forholdene i tanken er.

• “Den stationære fase”
  Denne fase forekommer, når der ikke længere er vækst. På dette tidspunkt har cellerne brugt alle de næringsstoffer, der var tilstede i tanken.
• “Dødsfasen”
  Dette er den sidste fase, hvor antallet af levende celler falder. Det sker pga. manglede næringsstoffer og eventuelle affaldsstoffer, som virker hæmmende på cellernes vækst.

 

Man kan måle væksten af celler ved at udtage en prøve til en såkaldt OD-måling. OD står for optisk densitet. Man udtager en prøve fra tanken, og denne prøve overføres til et lille rør. Røret kaldes for en kuvette. Kuvetten stilles ind i et instrument, et spektrofotometer, der måler prøvens OD. Spektrofotometret sender lys igennem prøven. Cellerne og andre strukturer i prøven f.eks. opløste molekyler vil påvirke lyset således, at det svækkes. Spektrofotometret kan måle, hvor meget lyset svækkes. Jo højere OD bliver, jo højere er celleantallet. OD-målinger bruges tit i mange laboratorier til at holde øje med væksten af celler.

Nu er fermenteringen slut! Inde i tanken vil det færdige produkt, celler og ubrugte næringsstoffer være tilbage. Man bruger nu tid på at oprense produktet, så man kan sælge et rent produkt til kunderne uden celler og næringsstoffer i.

Figur 8. Vækstfasterne i en batch-fermentering. Se tekst for detaljer.

Spørgsmål – test din viden

1. Hvad karakteriserer et godt medie?
2. Nævn nogle af de fysiske forhold, som man skal tilpasse for at mikroorganismer kan gro i en tank.
3. Hvad er forskellen mellem de tre forskellige typer af fermentering?
4. Beskriv de forskellige faser af vækst, som cellerne gennemgår.