Gateway kloning
Gateway er et kommercielt kloningssystem til sammensætning af DNA-sekvenser og kan fx bruges, hvis der skal kobles grønt fluorescrende protein (GFP) til et gen.
Forudsætter: PCR og gelelektroforese
Der eksisterer i dag en række moderne kloningsværktøjer, der kan bruges til at sammensætte DNA-sekvenser i stedet for den klassiske ’klippe/klistre’-metode med restriktionsenzymer og DNA ligase.
Gateway er et sådant kloningsværktøj og er baseret på rekombination. Rekombinationen gør det muligt at indsætte en DNA-sekvens i et specifikt rekombinationssted i en anden DNA-sekvens. Disse steder har nogle helt særlige Gateway DNA-sekvenser. Gateway-sekvenserne placeres også for enderne af det DNA, der skal flyttes i kloningen (se figur 27). Det er nyttigt fordi man på den måde kan flytte et gen til et særligt Gateway-plasmid, der fx allerede indeholder et andet gen, som man vil sætte sammen med. Eksempelvis kunne det være green fluorescent protein (GFP), som fluorescerer grønt, og koblet til et protein dermed afslører hvor i cellen det befinder sig.
Gateway rekombination stammer fra en bakterie-virus (bakteriofag) der hedder lambda. Den angriber E. coli og rekombinerer sit eget DNA ind i bakteriens DNA netop der hvor Gateway-sekvenserne naturligt er placeret i E.colis eget DNA. Rekombinationen katalyseres af særlige enzymer, som også indgår i Gateway systemet og nu kaldes clonase.
Gateway kloningsenzymerne
Der eksisterer to forskellige Gateway clonaser: BP clonase og LR clonase, som katalyserer hver deres retning af rekombination-reaktionen. Hvis et DNA-fragment indsættes med BP clonase, ændres Gateway-sekvensen således, at DNA-fragmentet vil blive trukket ud igen ved senere brug af LR clonasen.
Der findes fire forskellige overordnede Gateway-sekvenser, der kan bruges for enderne af de DNA-fragmenter, der skal udskiftes og der hvor de skal skiftes hen.
Sekvenserne kaldes attB, attP, attL og attR. Navnene hænger sammen med clonaserne, således at fragmenter med attB-ender rekombinerer og udskiftes med et fragment, der har attP-ender, når BP clonasen bruges. Under rekombinationen ændrer attB og attP sig til hhv. attL og attR. LR clonasen kan så styre den modsatrettede rekombination. Der er dog sjældent nogen grund til blot at vende direkte tilbage til udgangspunktet, så derfor skal det nye plasmid isoleres fra resten af blandingen og forstærkes i antal.
Figur 27. En BP-kloning hvor et GEN-fragment med attB-haler udskiftes med ccdB-fragmentet i pENTR-plasmidet. Reaktionsblandingen transformeres ind i E. coli i kanamycin-medium for at blive opformeret i antal, så de skal have kanr-genet fra pENTR for at overleve. De vil dog dø af ccdB-genet, hvis de modtog en pENTR, som ikke reagerede i BP-kloningen.
En styrke ved Gateway er ’selvmordsgenet’ ccdB, der sidder i det fragment, som man bytter ud i Gateway-plasmiderne ved rekombinationen.
Når selve Gateway-kloningsreaktionen er overstået, transformerer man nemlig E. coli med reaktionsblandingen. Her dræbes de E. coli der får de uinteressante Gateway-fragmenter (med ccdB), mens E. coli som modtager et rigtigt klonet plasmid nu er fri for selvmordsgenet og dermed kan forstærkes i antal, når E. coli-bakterierne vokser. Gateway-plasmidet indeholder også et resistensgen til antibiotika, så man kan dræbe de E. coli, der hverken blev transformeret med rigtigt eller forkert Gateway-plasmid.
Gateway i praksis
Gateway-sekvenserne er ned til ca. 20 nukleotider lange og tilføjes til enderne af et DNA-fragment med PCR. I PCR forstærkes det specifikke fragment som er placeret mellem de to brugte primer-sekvenser. Gateway-enderne påsættes ved at designe primerne, så Gateway-enderne sidder som en hale til primerne. Under PCR-reaktionen vil de dermed blive sat for enderne af det forstærkede DNA-fragment (se figur 27). Gel-elektroforese benyttes efterfølgende til adskillelse og oprensning af de nye fragmenter med Gateway-haler, som nu er klar til at indgå i en Gateway-kloning.
Brugen af E. coli til at opkopiere antallet af rigtigt klonede plasmider, betyder at man efter en nats dyrkning af bakterierne, slår bakterierne ihjel og udtrækker de nu mange plasmider med et særligt oprensnings-kit.
Hvis man i en Gateway-kloning fx har indsat et gen ved siden af GFP på et plasmid, for at klone de to gener sammen, skal man til sidst trække selve det nye gen ud fra plasmidet. Det foregår med en nye PCR, hvor primerne er valgt til at forstærke netop fra starten af det oprindelige gen og til GFP slutter. Gateway kan også klone DNA til brug i sletning af hele gener eller introduktion af enkelte punktmutationer udover at påsatte fx GFP, som forklaret her. På grund af Gateway-sekvenserne vil de to klonede proteiner få 7-8 aminosyrer sat i mellem sig. Gateway er et kommercielt kloningssystem, som ejes og udvikles af Invitrogen. Systemet har væsentligt flere muligheder end eksemplificeret her.
