• Svampe laver din ost

    Arla Foods amba og Institut for Systembiologi, byder dig velkommen til projektet ”Svampe laver din ost”. Projektet er udarbejdet af Julie Nilsson i samarbejde med de to partnere. Gennem dette projekt vil du lære om hvordan skimmelsvampe ikke blot er noget der findes i fugtige huse, men faktisk bliver brugt til produktion af en lang række oste. Du vil lære om hvordan bioteknologien benyttes i industrien, og hvordan bioteknologi også er kemi. Når du er færdig med projektet, vil du vide hvorfor en ost lugter af ost, og hvorfor blåskimmelost er blå – det er alt sammen svampenes skyld.

    Projektet indeholder en række artikler der kan benyttes enkeltvis eller som et samlet undervisningsforløb. Materialet er specielt velegnet til tværfagligt arbejde mellm kemi og biologi, og i særdeleshed også til undervisningen i bioteknologi.

    Teorien er suppleret af en eksperimentel øvelse med dyrkning af svampe, der primært henvender sig til biologi og bioteknologi, samt et online spil omhandlende tyndtlagschromatografi, der er tiltænkt undervisningen i kemi og bioteknologi.

    For at navigere rundt i projektet artikler kan menuen i venstre side anvendes. En oversigt over projektet ses nedenfor.

     

    Projektoversigt

    • Velkommen
    • Teori
      • Svampe og deres sekundære metabolitter
      • Osteproduktion hos Arla – fra mælk til skimmelost
      • Giv osten duft og smag
      • Svampeidentifikation
      • Kend din metabolit
    • Øvelse

    God fornøjelse!

  • Velkommen

    Arla Foods amba og Institut for Systembiologi, byder dig velkommen til projektet ”Svampe laver din ost”. Gennem dette projekt vil du lære om hvordan skimmelsvampe ikke blot er noget der findes i fugtige huse, men også kan bruges positivt som ”starterkulturer” til produktion af en lang række oste. Du vil lære om hvordan bioteknologien benyttes i industrien, og hvordan bioteknologi også er kemi. Når du er færdig med projektet, vil du vide hvorfor en ost lugter af ost, og hvorfor blåskimmelost er blå – det er alt sammen svampenes skyld.

    Produktionen af ost menes at kunne dateres flere tusinde år tilbage i tiden, til oldtidsfolket sumererne, der boede i Mesopotamien – det vi nu kender som Irak. Sumererne levede der i år 4.000 – 3.000 f.kr., og således menes osteproduktion at være mere end 5000 år gammel. Både vikingerne omkring år 1000 og senere tiders bønder fremstillede ost, og viden herom kom dels fra egne erfaringer samt fra munke der rejste til Danmark og bragte osteproduktion med sig. I midten af 1800 tallet begyndte man at eksperimentere med en forbedring af mælkeproduktionen, og dette resulterede naturligvis i bedre ostefremstilling.

    Med tilsætning af skimmelsvampe til ost, skabtes en ny art ost, nemlig skimmelosten. En af de mest kendte skimmeloste er osten Roquefort. Den produceres af fåremælk i området Roquefort-sur-Soulzon, og tilsættes svampen Penicillium roqueforti (P. roqueforti), der giver blåskimmelosten Roquefort sin karakteristiske smag, duft og udseende. Dernæst lagres osten i de lokale Combalou grotter, hvor jorden allerede indeholder skimmelsvampen P. roqueforti. Dette betyder at svampen har optimale vækstforhold i grotten, da temperaturen og luftfugtigheden er helt perfekt. Udelukkende oste der kommer fra Roquefort-sur-Soulzon området, må kaldes for Roquefort, selv om P. roqueforti anvendes til fremstilling af mange andre blåskimmeloste.

    I Danmark begyndte produktionen af blåskimmelost med Hanne Nielsen fra Havartigården, der i 1874 benyttede komælk til produktionen af en Roquefort-lignende ost. Blåskimmelosten HØNG Danablu er udviklet af Marius Boel, der først i 1914 producerede en dansk Roquefort-lignende ost, og dernæst i slutningen af 1920’erne som den første benyttede homogeniseret kaffefløde i produktionen. De skimmelsvampe Marius Boel tilsatte sin ost, voksede han selv frem på gammel rugbrød – hvis mugpletter nemlig også er skimmelsvampe. En ikke helt sikker metode, da Marius ikke kunne være helt sikker på kun at have de godartede skimmelsvampe, men kunne risikere at tilsætte giftige svampe til osten, som kunne vokse under samme betingelser som den gode svamp. I dag sker dyrkningen af skimmelsvampe under kontrollerede forhold i laboratorier, så man er sikret at der kun tilsættes netop den type kultur der ønskes. Hvidskimmeloste som camembert kan dateres tilbage til 1700-tallet, og camembert osten udspringer af den velkendte brieost.

    Da man i sin tid begyndte at fremstille skimmeloste, var de kemiske processer bag duft, smag og farveudviklingen ukendte. I dag har mange års forskning betydet, at man nu har viden omkring hvilke kemiske stoffer der giver blåskimmeloste deres karakteristiske smag, og hvad det egentlig er en skimmelsvamp gør ved osten. Gennem introduktion til principperne bag osteproduktion, svampes opbygning og hvordan man kan identificere enkelte kemiske komponenter, der er til stede i en ost, vil du nu få indsigt i hvordan bioteknologien og kemien bruges i vor tids industri.

    God fornøjelse.

  • Teori

    Nedenfor ses en oversigt over de artikler, der indgår i projektet.

    • Svampe og deres sekundære metabolitter
    • Osteproduktion hos Arla – fra mælk til skimmelost
    • Giv osten duft og smag
    • Svampeidentifikation
    • Kend din metabolit

    Rigtig god fornøjelse med den teoretiske del af projektet!

     

    Svampe er eukaryote mikroorganismer, der findes i mange forskellige udgaver. De fleste kender dem som champignoner og andre svampe, der benyttes i maden, men i virkeligheden er svampe langt mere end det. Svampe inddeles traditionelt i tre hovedgrupper: skimmelsvampe (også kaldt mugsvampe), gærsvampe og storsvampe. Disse tre grupper kan også kaldes hhv. filamentøse svampe, éncellede svampe og makroskopiske svampe. I dette materiale fokuserer vi på de filamentøse svampe, skimmelsvampene, idet de benyttes til produktionen af skimmeloste.

    Skimmelsvampe findes overalt i naturen, typisk i jord, på nedbrudt plantemateriale og på dyr. Derudover kender vi dem fra muggent brød og frugt, samt som de svampe der ofte skaber problemer i fugtige huse. Skimmelsvampe kan dog også være ønskede, og det er netop tilfældet i produktionen af ost. En blåskimmelost som HØNG Danablu, der kan ses på figur 1, indeholder skimmelsvampe.

    Figur 2. Blåskimmelost med Penicillium roqueforti i . Svampen er opbygget i et mycelium.

    De blå-grønne årer der ses i osten, er Penicillium roqueforti (P. roqueforti), som vokser i osten og medvirker til at give den smag og duft. Hvidskimmeloste som HØNG Camembert indeholder svampen Penicillium camemberti (P. camemberti).

    Grunden til at disse skimmelsvampe kaldes filamentøse svampe, er, at de vokser i såkaldte filamentøse netværk. Disse netværk kaldes mycelier, og opbygningen af et sådant kan ses på figur 2.

    Svampe er opbygget af celler, ligesom alle andre levende organismer. Disse celler vokser i sammenhængende rækker, der kaldes hyfer. Når flere hyfer sidder sammen i et netværk, kaldes det et mycelie. Hvis man opdager en mugplet på sit rugbrød, er det derfor dette mycelie man kan se. Alle hyfer vokser fra enden. Når enden af en hyfe kommer op på overfladen af myceliet, dannes såkaldte sporer. Disse sporer vil med tiden blive båret bort fra svampen via luften eller på anden måde. De vil så blive grobund for et nyt svampemycelie andetsteds. Sporerne kan have forskellige farver og fremstår samlet som en støvagtig flade. P. roqueforti har blå-grønne sporer. Det er således overfladen på det svampemycelie, der vokser i osten, som er de blå-grønne årer i en blåskimmelost. P. camemberti derimod, har hvide sporer, hvorfor camembertoste blot forbliver hvide.

    Organismer, som for eksempel skimmelsvampe, producerer både primære og sekundære metabolitter. Primære metabolitter er stoffer, som er nødvendige for organismens overlevelse, og som findes overalt i levende organismer. De primære metabolitter kan for eksempel være aminosyrer, vitaminer, fedtstoffer og andre stoffer der indgår i livsvigtige processer i cellen.

    Sekundære metabolitter, er stoffer der produceres gennem naturligt forekommende pathways i organismer, men som ikke er direkte nødvendige for cellernes vækst og reproduktion. Det er imidlertid de sekundære metabolitter, der bestemmer, hvilken farve svampen har, hvordan den lugter og smager, og hvilke giftstoffer den udskiller. Reaktionsvejen for de sekundære metabolitter, er ofte specifikke for slægten eller arten. Derfor kan disse metabolitter i nogle tilfælde benyttes til at bestemme slægtskab mellem organismer. Det kan du læse mere om i artiklen Svampeidentifikation.

    Men hvorfor producerer svampe sekundære metabolitter, hvis de ikke er direkte nødvendige for overlevelse? En af grundene er, at dannelsen af visse sekundære metabolitter kan føre til, at svampene ikke bare overlever, men lever bedre, kan vokse sig større, har en farve, der beskytter dem mod f.eks. UV-lys, eller at de kan beskytte sig mod andre farer. En lang række forskellige stoffer produceres som sekundære metabolitter. Da Alexander Fleming i 1928 ved et tilfælde opdagede, at vækst af skimmelsvampen Penicillium notatum i en petriskål slog omkringvoksende bakterier ihjel, opdagede han samtidig svampens produktion af den sekundære metabolit penicillin.

    De metabolitter, der produceres, afhænger af den næring, svampen får. Derfor kan en svamp som Penicillium roquefortivære ugiftig, når den vokser på ost, som vi ser det i produktionen af blåskimmeloste, men hvis den samme svamp vokser på brød, dannes giftige metabolitter. Det kan du også læse mere om i artiklen Svampeidentifikation.

     

    Læs mere

    Farvestoffer fra svampe
    Læs mere omkring hvordan svampe kan bruges som små cellefabrikker der producerer farvestoffer til vores mad.

    Forskning i svampe på DTU Systembiologi
    Se mere omkring hvordan Center for Mikrobiel Bioteknologi under DTU Systembiologi forsker i svampe og deres sekundære metabolitter (på engelsk).

    Når man skal producere ost, afhænger det færdige produkt både af stoffer, der er til stede i mælken, de mælkesyrebakterier og enzymer der tilsættes, den svamp der benyttes i produktionen samt temperatur, pH og modningstid. Arlas Research & Development afdeling arbejder målrettet på at optimere osteproduktionen, således at der bliver lavet den bedst mulige ost. Nedenfor gennemgås kort, hvorledes man hos Arla går fra mælk til skimmelost for de to oste Danablue (blåskimmelost) og Camembert/Brie (Hvidskimmelost). Produktionen af de to oste foregår nogenlunde ens, men da der er små afvigelser, er de her beskrevet separat.

    Danablue

    • Mælken hentes ind fra landmændene,og i Arlas oste bruges mælk fra danske besætninger. Når der produceres ost, er de vigtigste stoffer i mælken fedtet, proteinerne og lactosen, også kaldt mælkesukkeret. Mælken har typisk et fedtindhold på ca. 4,2 %, et proteinindhold på ca. 3,7 % samt et lactoseindhold på 4,6 %. Det er vigtigt at smagen er den samme hver gang man laver en ost. Smagen afhænger af fedtindholdet, og derfor skal dette være det samme i al den mælk man benytter. Dette sikres ved at centrifugere mælken, og fjerne overskydende fedt. Fedtet kan udskilles i centrifugen, da fedt er lettere end den resterende mælk.

    Alle uønskede bakterier, heriblandt bakterier der kan være sygdomsfremkaldende, skal fjernes fra mælken, inden der laves ost.

    Dette gør man ved at varmebehandle mælken ved 63˚C  i 20 sekunder. På den måde slår man alle uønskede bakterier ihjel, men de enzymer, der skal fungere i osteproduktionen, er stadig intakte. Proteiner denaturerer ved for høj temperatur. Det betyder, at de mister deres form og således ikke længere kan fungere. Da enzymer er en slags proteiner, kan de heller ikke tåle en for høj temperatur. Forskellige enzymer denaturerer ved forskellige temperaturer. Det er derfor vigtigt, at vide en masse om præcis hvilke enzymer der fungerer i osteproduktionen, således at man kan sikre, at temperaturen ikke bliver så høj, at de også ødelægges. De enzymer, man ønsker at bevare her, er dem, der nedbryder fedtet i mælken, da fedtnedbrydningen er en vigtig del af smagsudviklingen i osten.

    Endnu en vigtig ting i fremstillingen af ost, er mælkens pH-værdi. Den skal helst være 4,8, men mælkens naturlige pH er ca. 6,7. Derfor skal pH-værdien sænkes fra 6,7 til 4,8. En sænkning af pH kan som bekendt ske ved at tilsætte syre. I osteproduktionen gøres dette ved at få en starterkultur, der bl.a. indeholder mælkesyrebakterier, til at omdanne lactosen (mælkesukkeret) i mælken til mælkesyre.
    Fremstillingen af denne starterkultur, sker ved at tilsætte en lille portion mælkesyrebakterier til en lille mængde mælk. Mælkesyrebakterierne begynder at vokse i mælken, og når mælkens pH er ca. 4,6 er starterkulturen klar. Starterkulturen kan nu tilsættes den store mængde mælk, der skal blive til Danablue.

    Starterkultur, svampen Penicillium roqueforti og enzymblandingen Osteløbe tilsættes alle mælken samtidig. Dette sker ved 30 grader og fører til følgende processer i mælken:

    Enzymblandingen Osteløbe får mælkens proteiner til at adskille sig fra resten af mælken. Enzymerne og mælkens proteiner bliver til ostemasse, og det resterende produkt, vallen, kasseres. I løbet af ca. 2 timer er pH i mælken faldet til 6,3, og der er næsten kun proteiner og fedt – ostemasse – tilbage. Yderligere valle fjernes, og ostemassen, der altså er fedt og proteiner, kommes i forme. I løbet af de næste 24 timer sørger mælkesyrebakterierne for at pH falder til ca. 4,8. Dernæst saltes ostene og står i yderligere 24 timer.

    Når ostene er saltede, prikkes ostene, dvs. en lang række nåle bores ind i den færdigformede ost. Ved at prikke osten på denne måde, skaber man dybe huller i osten, hvor ilt kan komme ind. Svampen P. roqueforti kan kun vokse aerobt, dvs. når der er ilt til stede. Derfor begynder svampen kun at vokse de steder, hvor osten er prikket.
    Ostene lagres ved ca. 10 °C.

    • De første 2 uger: Mælkens naturlige enzymer og enzymer fra starterkulturen begynder at nedbryde fedt og protein.
    • Uge 3-4: P. roqueforti vokser kun langsomt, da temperaturen er lav, pH er lav og saltindholdet er højt i osten. Derfor ses der først vækst af P. roqueforti efter ca. 3 ugers modning. Enzymer fra P. roqueforti begynder straks at nedbryde fedt og protein i osten, og efter ca. 4 uger er nedbrydningen så fremskreden, at osten er modnet nok til at kunne spises. Efter ca. 20 uger er osten så nedbrudt og kraftigt smagende, at den ikke længere er spiselig. De processer, der sker ved nedbrydning af fedt og protein, er gennemgået i afsnittet Giv osten duft og smag.

    Camembert/Brie

    • Mælken hentes ind fra landmændene – i Arlas oste bruges mælk fra danske besætninger. De vigtigste stoffer i mælken, når der produceres ost, er fedtet, proteinerne og lactosen, også kaldet mælkesukker. Mælken har typisk et fedtindhold på ca. 4.2%, et proteinindhold på ca. 3.7% samt et lactose indhold på 4.6%. For at sikre at fedtindholdet i mælken er det samme hver gang man laver ost, og således sikre at smagen af osten bliver den samme hver gang, centrifugerer man mælken, og fjerner på den måde overskydende fedt. Fedtet kan uskilles i centrifugen, da fedt er tungere end den resterende mælk.
    • Ostemælken varmebehandles ved 72 °C i 15 sekunder. Her bliver eventuelle sygdomsfremkaldende bakterier slået ihjel, og samtidig dræbes andre bakterier, der kan have uønsket indflydelse på ostens smag. De forskellige mikroorganismer kan bedre vokse i en Camembert/Brie end i Danablue, fordi der er mere vand i en Camembert/Brie.
    • Endnu en vigtig ting i fremstillingen af ost, er mælkens pH-værdi. Denne skal helst være 5,0, men mælkens naturlige pH er ca. 6,7. Derfor skal pH-værdien sænkes fra 6,7 til 5,0. En sænkning af pH kan som bekendt ske ved at tilsætte syre. I osteproduktionen gøres dette ved at få en starterkultur, der bl.a. indeholder mælkesyrebakterier, til at omdanne lactosen (mælkesukkeret) i mælken til mælkesyre.
    • Fremstillingen af denne starterkultur, sker ved at tilsætte en lille mængde mælkesyrebakterier til mælk. Mælkesyrebakterierne begynder at vokse i mælken, og når den pH er ca. 4,6 er starterkulturen klar. Starterkulturen kan nu tilsættes den store mængde mælk, der skal blive til Camembert.
    • Starterkultur, svampen Penicillium camemberti og enzymblandingen Osteløbe tilsættes alle mælken samtidig. Dette sker ved 30 grader, og fører til følgende processer i mælken:
    • Enzymblandingen Osteløbe får mælkens proteiner til at adskille sig fra resten af mælken. Enzymerne og mælkens proteiner bliver til ostemasse, og det resterende produkt, vallen, kasseres. I løbet af ca. 2 timer er pH’en faldet til 6,3, og der er næsten kun fedt og proteiner – ostemasse – tilbage. Yderligere valle fjernes, og ostene kommes i runde forme, ca. 200 gram pr. form. I løbet af de næste 24 timer sørger mælkesyrebakterierne for at pH falder til ca. 5,0. Dernæst saltes ostene og står i yderligere 4 timer.
    • Når ostene er saltede, sprøjtes der en opløsning indeholdende svampen P. camembertii på ostene. De lagres ved ca. 10 °C.
    • Efter 4 – 5 dage vokser P. camembertii frem på overfladen af ostene. Der bruges mælkesyre, mens skimmelen vokser. Dermed fjernes mælkesyre fra overfladen, og pH vil derfor stige på overfladen af osten. Fordi ostene er små, så udfældes calciumsalte i overfladen. Calcium fra ostens indre diffunderer ud til overfladen. Da calcium binder proteinerne sammen, bliver osten blød indvendig, når calcium forsvinder. Samtidig dannes der en masse smags- og aromakomponenter ved væksten af P. camembertii og i en alder af ca. 3 uger er osten salgsklar. Den er holdbar til ca. 12 ugers alderen, hvor der er dannet for mange smagskomponenter.

    Stofklassifikationer

    I dette afsnit beskrives de stoffer, der giver duft og smag til osten. Først omtales de stoftyper, der benyttes ved fremstillingen. Dernæst forklares, hvad proteiner og enzymer er.

    Fedtsyrer:

    Fedtsyrer er naturlige bestanddele af mælk. Fedtsyrernes molekyler er bygget op af lange carbonkæder, med en carboxylgruppe (-COOH) i den ene ende, se figur 1.

    En carbonkæde består af en masse carbonatomer bundet til hinanden samt til hydrogenatomer, ved kovalente eller elektronpar-bindinger. Hvis carbonatomerne i en fedtsyre udelukkende sidder sammen ved enkeltbindinger, kaldes fedtsyren for en mættet fedtsyre. Hvis der er netop én dobbeltbinding mellem to carbonatomer i kæden kaldes fedtsyren for mono-umættet, og er der flere dobbeltbindinger kaldes den fler-umættet.

    Figur 1. Fedtsyrer. Til venstre ses en mættet fedtsyre, til højre en enkeltumættet

    I mælk er fedtsyrerne bundet i triglycerider. Triglycerider er kemiske forbindelser, hvor tre fedtsyrer er bundet til ét glycerolmolekyle, gennem esterbindinger, som det ses på figur 2.

    Navngivningen af fedtsyrer følger gældende IUPAC-regler. Dermed gives carbonatomet i carboxylgruppen –COOH nummer 1. Det tilstødende carbonatom bliver således nummer 2, og så fremdeles. Navnet på fedtsyren angives da på denne måde:

    Præfikset gives efter antallet af carbonatomer i fedtsyren.

    Antal C’er 1 2 3 4
    Præfiks Meth Eth Prop But
    Antal C’er
    5 6 7 8
    Præfiks
    Pent Hex Hept Oct
    Antal C’er
    9 10 11 12
    Præfiks Non Dec Undec Dodec
    Antal C’er
    13 14 15 20
    Præfiks Tridec Tetradec Pentadec Eicos

     

    De fedtsyrer vi arbejder med her, er udelukkende mættede. Der er derfor ingen dobbeltbindinger i dem. Når der kun er enkeltbindinger i et stof, begynder suffikset med –an. Suffikset er –syre, og således hedder en mættet fedtsyre med fire carbonatomer, but-an-syre, butanosyre. Fedtsyrer forekommer som regel med mellem 4 og 24 carbonatomer.

     

    Ketoner:

    Ketoner er – ligesom aldehyder – stoffer der indeholder et O dobbeltbundet til et C – en carbonylgruppe. Mens carbonatomet i C=O bindingen i aldehyder også er bundet til et hydrogenatom og en organisk radikalgruppe (R-gruppe), er carbonatomet i ketoner ”kun” bundet til to R-grupper, som det ses på figur 3.

    Figur 2. Triglycerid.

    Ketoner kan bl.a. dannes ved oxidation af en sekundær alkohol. Reaktionen er:

    Ketoner kan ligeledes dannes fra frie fedtsyrer – en reaktionsvej der gennemgås nedenfor. Carbonylgruppen C=O i ketoner er polær, og ketoner er derfor polære stoffer. De kan danne hydrogenbindinger med f.eks. vand, og er derfor opløselige i vand. Ketonerne er dog ikke i stand til at hydrogenbinde med dem selv, hvorfor ketoner er ret flygtige stoffer.

    Når en keton skal navngives, nummereres carbonatomerne fra den ende som C=O bindingen er tættest på. I eksemplet på figur 3, vil carbonatomet i C=O bindingen derfor have nummer 2:

    Ved navngivningen af dette stof, vil man inden præfixet placere nummeret på carbonatomet i C=O bindingen, dvs. ovenstående ketons navn vil starte med 2-. Præfixet gives på samme måde som ved fedtsyrerne, og da ovenstående keton har 7 carbonatomer vil dette være hep-. Suffikset for ketonenavne er altid –on, og her gælder ligeledes reglen, at suffikset begynder med –an, såfremt der kun er enkeltbindinger. Således vil en keton med syv carbonatomer uden dobbeltbindinger og med C=O bindingen på carbon nummer 2 hedde 2-heptanon.

    Proteiner:

    Proteiner er molekyler, der er opbygget af aminosyrer, der er mindre molekyler. Der findes tyve forskellige aminosyrer. Den generelle opbygning af dem er som ses på figur 4.

    Figur 4. Opbygningen af en aminosyre.

    Peptidbindinger er kovalente bindinger, der dannes mellem en aminosyres aminogruppe, –NH2 , og en anden aminosyres carboxylgruppe, –COOH. Under bindingen fraspaltes vand.

    Bindingen kan ses på figur 5. Kæder af aminosyrer er da hvad man kalder et protein.

    Figur 3. Keton. Bemærk det dobbeltbundne O.

    Enzymer:

    Enzymer er proteiner der ”hjælper” (katalyserer) kemiske processer. Enzymer fremskynder en ellers naturlig reaktion mellem substrater. Enzymerne frigives igen, når reaktionen er bragt til ende. Enzymer kan også nedbryde kemiske bindinger. De enzymer, der tales om ved dannelsen af smags- og duftstoffer i osteproduktionen i dette materiale, er:

    Lipase, der nedbryder glycerider, f.eks. triglycerider som findes i mælken, ved at nedbryde esterbindingerne gennem en proces kaldt hydrolyse, se figur 6. Lipaser dannes af den benyttede svampekultur.

    Protease, der nedbryder proteiner ved at bryde peptidbindingerne mellem aminosyrerne, ved hydrolyse, som det ses på figur 6. Proteaser dannes af den benyttede svampekultur.

    Til osteproduktionen tilsættes osteløbe som beskrevet i afsnittet ”Osteproduktion hos Arla”. Osteløbe er en blanding af enzymer, hvoraf det vigtigste er rennilase, der ikke beskrives detaljeret her.

    I en blåskimmelost er det bl.a. ketoner og frie fedtsyrer, der bidrager til den karakteristiske ostesmag. Frie fedtsyrer dannes ved nedbrydning af triglycerider, der er naturligt til stede i mælken.

    Figur 5. Dannelsen af en peptidbinding.

    Disse fedtsyrer giver osten en del af den kendte smag, men en del af fedtsyrerne viderebehandles, således at der dannes yderligere smagsgivende ketoner. Først betragtes den generelle kemiske proces, der foregår, når et triglycerid bliver nedbrudt.

     

    Fra triglycerid til frie fedtsyrer

    Et triglycerid består som nævnt af et glycerolmolekyle, hvorpå der er bundet tre fedtsyrer ved esterbindinger. Disse fedtsyrer kan både være ens og forskellige. Når triglyceridet nedbrydes, dannes frie fedtsyrer og glycerol. Nedbrydningen af hver enkelt esterbinding, sker ved hjælp af enzymet lipase, der dannes af svampekulturen. Svampene danner disse enzymer og sender dem ud – de udskilles – i mediet, hvor lipasen fungerer aktivt i nedbrydningen af esterbindingen. For hver enkelt esterbinding kræves et vandmolekyle, H2O. Når esterbindingen brydes, overføres et H fra H2O til glycerolmolekylet, således at dets -OH gruppes gendannes Det resterende –OH fra H2O overføres til fedtsyren, således at –COOH gruppen gendannes. Mekanismen kan følges på figur 7, og processen kaldes hydrolyse. Det er disse overførsler af atomer, som

    Til osteproduktionen tilsættes som beskrevet i afsnittet ”Osteproduktion hos Arla” osteløbe, der er en blanding af enzymer, hvoraf det vigtigste er rennilase. Da vi ikke kan beskrive alle enzymer her, er dette ikke noget vi vil gå videre i detaljer omkring.

    I en blåskimmelost, er det bl.a. ketoner og frie fedtsyrer der bidrager til den karakteristiske ostesmag. Frie fedtsyrer dannes ved nedbrydning af triglycerider, der er naturligt til stede i mælken. Disse fedtsyrer giver nu allerede osten en del af den kendte smag, men en del af fedtsyrerne viderebehandles, således at der dannes de smagsgivende ketoner. Først vil vi se på den generelle kemiske proces der foregår, når et triglycerid bliver nedbrudt.

    Fra triglycerid til frie fedtsyrer

    Et triglycerid består som sagt af et glycerolmolekyle, hvorpå der er bundet tre fedtsyrer ved esterbindinger. Disse fedtsyrer kan både være ens og forskellige. Når triglyceridet nedbrydes, dannes frie fedtsyrer og glycerol. Nedbrydningen af hver enkelt esterbinding, sker ved hjælp af enzymet lipase, der dannes af svampekulturen. Svampene danner disse enzymer og sender dem ud i mediet – de udskilles – hvor lipasen fungerer aktivt i nedbrydningen af esterbindingen. For hver enkelt esterbinding, kræves et vandmolekyle H2O. Når esterbindingen brydes, gøres dette nemlig ved at overføre et H fra H2O til glycerolmolekylet, således at dets -OH gruppes gendannes, samt at overføre det resterende –OH fra H2O til fedtsyren, således at –COOH gruppen gendannes. Mekanismen kan følges på figur 7, og processen kaldes hydrolyse. Disse overførsler af atomer, er dem lipasen hjælper til med.

    Det er ikke nødvendigvis alle fedtsyrerne der fraspaltes på en gang. Hvis det kun er den ene fedtsyre, ender man med en fri fedtsyre og et diglycerid. Fraspaltes to fedtsyrer, har man frie fedtsyrer og et monoglycerid. Fraspaltes alle tre, dannes frie fedtsyrer og glycerol.

    Efter denne omtale af fedtsyredannelsen, følger nu fedtsyrernes videre reaktionsvej til dannelsen af ketoner.

     

    Fra fedtsyre til keton

    Når fedtsyrerer optages af svampecellerne, gennemgår de en nedbrydningsproces. Første del af denne proces kaldes β-oxidation. Denne oxidation består af fem trin, som gennemgås nedenfor. De fleste af reaktionerne foregår med hjælp fra enzymer, men de præcise enzymmekanismer beskrives ikke her.

    Figur 7. Hydrolyse af triglycerid.

    1. Fedtsyren bindes kovalent til molekylet Coenzym A (CoA) på en carboxylgruppe. Coenzym A skrives sædvanligvisHSCoA. Enzymet er vist på figur 8.

    Når CoA bindes til carboxylgruppen –COOH, fraspaltes H’et på CoA og –OH gruppen på –COOH. Således fraspaltes totalt et vandmolekyle. Det dannede molekyle med fedtsyre og CoA, kaldes acyl-CoA.

    • Ved hjælp af enzymet acyl-CoA dehydrogenase, fjernes nu to hydrogenatomer fra molekylet. Et hydrogenatom fra carbon nr. 2, og et fra carbon nr. 3 i fedtsyrekæden. Således dannes en dobbeltbindingen mellem carbon nr. 2 og 3.
    • Enoyl-CoA hydratase enzymet hjælper nu til, at et H2O molekyle føjes til fedtsyren. Dette H2O molekyle benyttes til at reducere dobbeltbindingen mellem carbon nr. 2 og 3 til en enkeltbinding. Det sker ved at tilføje et H til carbon nr. 2, og en –OH gruppe til carbon nr. 3.

    Figur 8. Coenzym A

    • Nu fjernes begge H’er, der er tilknyttet carbon nr. 3, således at der her kun er O’et tilbage. Der er nu en dobbeltbinding mellem carbon nr. 3 og O’et. Denne fjernelse foregår ved hjælp af enzymet β-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase. Stoffet, der er dannet nu, er en β-ketoacyl-CoA, og det er dette stof, der arbejdes videre fra i dannelsen af ketoner.
    • Acyl-CoA acyltransferase (thiolase), sørger for, at bindingen mellem carbon nr. 2 og 3 brydes. Derved fraspaltes stoffet acetyl-CoA. Samtidig påsættes et nyt CoA-molekyle på carbon nr. 3. Fedtsyren er nu reduceret med to carbonatomer og er klar til at gennemgå en β-oxidation igen.

    Denne reaktionsvej, der fører til dannelse af ketonerne, skyldes især β-oxidationen, nemlig β-Ketoacyl-CoA stoffer, se punkt 4. β-Ketoacyl-CoA er betegnelsen for alle de fedtsyrer, der er nået til dette punkt i β-oxidationen. Således er acyl blot en fællesbetegnelse. Afhængigt af længden af fedtsyren, sættes det tilsvarende navn ind i stedet for acyl. Således gælder det, at hvis fedtsyren β-Ketoacyl-CoA’en havde ottecarbonatomer, så hedder den β-Keto-octanoyl-CoA.

    På vejen fra β-Ketoacyl-CoA til keton er der to trin.

    1. Bindingen mellem S-CoA og carbon nr. 1 i β-Ketoacyl-CoA brydes, ved hjælp af tilsætning af H2O. Det ene H atom overføres til -S-CoA, således at der dannes coenzym A igen (HSCoA). OH gruppen overføres til carbon nr. 1 på fedtsyren, således at der dannes en carboxylgruppe. Ved denne proces er enzymet thiohydrolase. Produktet af denne reaktion er en β-keto acid, der er en carboxylsyre, hvorpå der er en keton-gruppe (C=O) på carbon nr. 3.
    2. Den dannede β-keto acid kommer nu i kontakt med et enzymet decarboxylase, som fjerner CO2 fra COOH gruppen på β-keto syren. Således dannes en keton, som det ses på figur 9.

    Figur 9. Ketondannelse.

    Hele cyklussen fra triglycerid til keton kan ses på figur 10, samt på nedenstående animation.

    Herunder kan I da se hvordan fedtsyren reduceres med to carbonatomer ved dannelsen af acetyl-CoA, for hver omgang af ovenstående reaktioner.

    Figur 10. Betaoxidation af palmitoyl CoA

    Da fedtsyren mister et carbonatom undervejs mod dannelsen af ketonen, vil den keton, der dannes ud fra octanoic acid være heptanone og så fremdeles.

    Disse beskrevne generelle processer er gældende for både blåskimmeloste, hvor P. roqueforti benyttes, samt ved hvidskimmelosten camembert, hvor P. camemberti bruges. Der er forskelle på de to oste. Derfor er der også forskelle både på de ketoner og fedtsyrer, der indgår i processerne, og på de mere specifikke dele af produktionsprocessen.

    Desuden er der en række fysiske forhold som lagringstid, temperatur m.m. der gør sig gældende i vejen mod forskellige oste. Det blev beskrevet i afsnittet “Osteproduktion hos Arla – fra mælk til skimmelost“.

     

    Penicillium roqueforti

    Ved produktion af blåskimmeloste, benyttes som nævnt P. roqueforti til at frembringe den karakteristiske smag, duft og farve. I og med at P. roqueforti vokser inde i selve osten, modner denne indefra. I blåskimmeloste produceret med P. roqueforti, har det vist sig at være følgende methy ketoner der er flest af, og således dem der giver osten denskarakteristiske smag:

    · 2-heptanon

    · 2-nonanon

    · 2-pentanon

    · 2-undecanon

    Grunden til at disse ketoner har et to-tal foran deres navn, er at ketongruppen er placeret på carbon nr. 2. Bemærk at alle ketonerne har et ulige antal carbonatomer fordi de fedtsyrer, som de er dannet ud fra, alle mister carbondioxid fra en fedtsyre med et lige antal carbonatomer.

     

    Penicillium camemberti

    Ved produktion af hvidskimmelosten camembert, benyttes som nævnt P. camemberti til at frembringe den karakteristiske smag, duft og farve. Svampen vokser her på overfladen af osten, dom derfor modner udefra. I camembert har følgende methylketoner vist sig at være dominerende:

    · 2-nonanon

    · 2-undecanon

    Ud over fedtsyrer og methylketoner, har frie aminosyrer også indvirkning på, hvordan osten smager og føles. Frie aminosyrer kommer fra nedbrydningen af proteiner . Denne nedbrydning kaldes proteolyse, og varetages af de før beskrevne proteaser, samt af enzymer fra mælkesyrebakterier. Aminosyrerne er med til at sikre baggrundssmagen i osten, og endvidere forhindrer proteolysen, at osten bliver tør og smuldrende. Det protein, der er mest af i mælk, er kasein. Ca. 80 % af det samlede proteinindhold er kasein. Det er derfor primært kasein, der bliver nedbrudt, når de frie aminosyrer dannes.

    De metabolitter en svamp danner, afhænger blandt andet af det medie, den vokser på. Nogle vækstbetingelser resulterer i gavnlige stoffer som f.eks. methylketoner. I andre tilfælde kan udskilles giftige stoffer, nemlig de såkaldte svampetoksiner. Det er ekstremt vigtigt at undgå dannelsen af giftige eller på anden vis uønskede stoffer. Derfor er det nødvendigt at vide, på hvilke medier svampene udskiller hvad, således at der kun udskilles ønskede stoffer. Denne viden kan man bl.a. få ved at undersøge, hvordan svampenes metabolisme fungerer.

    Metabolismen bestemmer, hvordan svampene omdanner de stoffer, de optager fra mediet. Udover at forhindre dannelsen af giftige stoffer fra en svamp, vil man også gerne sikre, at svampen vokser så hurtigt som muligt, og at der ikke er giftige svampe til stede på ens medie, osten Det gør man ved at optimere vækstbetingelserne for den ønskede svamp, dvs. ved at benytte den mediesammensætning, der er bedst for den pågældende svamp.

    Der er rigtig mange faktorer at tage hensyn til, når man skal lave det bedst mulige medie. Faktorer som mælkens sammensætning, temperatur, pH og vandaktivitet indvirker alle på svampens vækst. Derfor finder man som oftest et gennemsnitligt optimum, hvor man tager mest muligt hensyn til alle faktorer. Som det kan læses, er der rigtig mange overvejelser og eksperimenter der skal laves, før man kan opnå den bedst mulige osteproduktion.

    Skimmelsvampe som  P. roqueforti og P. camemberti udgør ikke nogen fare for mennesker, når de vokser på ost. De producerer således ikke giftstoffer i farlige mængder. Andre svampe derimod kan være giftige at spise, når de vokser på ost. Det er derfor ekstremt vigtigt, at det er de rigtige svampe der bruges i osteproduktionen. P. commune er en skimmelsvamp, der er en frygtet kontaminant i osteproduktionen ved Arla. Den danner sekundære metabolitter, der er giftige for mennesker, og det er derfor vigtigt at undgå denne svamp. Men de svampe der er gode, når de vokser på ost, er ikke nødvendigvis gode, når de findes andre steder. Hvis P. roqueforti f.eks. vokser på rugbrød i stedet for ost, er den lige pludselig giftig. Det skyldes, at den bruger sammensætningen af stoffer i rugbrødet til at danne giftstoffer.

    Hvordan sikrer man sig så, at man har en ren svampekultur, der kun indeholder præcis den svamp, man skal bruge til sin osteproduktion? Som nævnt i afsnittet Velkommen dyrkede Marius Boel sine svampe frem på rugbrød og brugte dem derefter til at lave skimmelost med. Det er dog ikke en særlig god metode, da man ikke kan være helt sikker på, at man kun får den ønskede svamp med over på osten, når svampen tages direkte fra rugbrødet. Hvis man vil isolere en enkelt svamp, som man derefter kan bruge videre i en produktion, rendyrker man den. En rendyrkning betyder, at man isolerer svampen fra andre organismer, ved at flytte den til et rent medie. Dette gøres gentagne gange, indtil man er helt sikker på kun at have den ønskede svamp på ens medie.

    I dag ved man, at der skal benyttes P. roqueforti, når man skal lave blåskimmelost, og at man kan bruge P. camemberti i produktionen af hvidskimmeloste som f.eks. brie. Men hvad gør man, hvis man har brug for en svamp der kan lave et bestemt enzym, men ikke har fundet svampen endnu? Eller hvis man har fundet en svamp, og ikke ved hvad den kan lave?

    Først og fremmest findes der en række databaser på internettet, hvor man kan søge mellem flere tusinde svampe. Hvis man ved, at man skal bruge et enzym, der kan holde til meget høje temperaturer, kan man søge efter en svamp, der er fundet i et område med høje temperaturer, f.eks. i en varm kilde på Island. Derefter kan man skaffe denne svamp, og undersøge om de enzymer den producerer, kan bruges til det ønskede formål.

    Når man skal finde helt nye svampe, er det på med gummistøvlerne og ud i naturen. Verden rundt leder forskere efter nye organismer, der kan tages hjem i laboratoriet og isoleres. Når svampene er isolerede, kan man ved forskellige mikrobiologiske analyser finde ud af, hvilke stoffer svampen producerer, hvordan dens metabolisme er, og hvilke gener den har.

    Når man har brug for at identificere en svamp, kan det hjælpe at kigge på de sekundære metabolitter, den producerer. Alle svampe producerer et unikt mønster af metabolitter. Det kan undersøges vha. de analysemetoder, der er beskrevet i artiklen Kend din metabolit. Den undersøgelse skal I prøve i øvelsen, der hører til dette materiale. I praksis gør man det, at man dyrkersvampen frem på forskellige medier. Det fører til forskellig produktion af sekundære metabolitter. Så analyserer man de metabolitter svampen har produceret og sammenligner det i en database med analyseresultater fra allerede kendte svampe. I de fleste tilfælde vil den svamp, man har fundet være en, der allerede er kendt. Man vil derfor kunne se, om det mønster af metabolitter, som den har produceret, matcher et andet mønster i databasen. Hvis svampen imidlertid ikke er en, man allerede kender, kan man bruge metabolitmønsteret til at se, om den er i familie med nogle kendte svampe, eller om der simpelthen er tale om en helt ny art.

    Så selvom sekundære metabolitter ikke altid har en vigtig biologisk funktion, er de blevet et af vores vigtigste værktøjer i svampeidentifikation.

    Læs mere

    Hvis du vil læse mere om Penicillium stammernes taxonomi, kan du se denne artikel:
    Polyphasic taxonomy of Penicillium subgenus Penicillium – A guide to identification of food and air-borne terverticillate Penicillia and their mycotoxins
    af Jens C. Frisvad og Robert A. Samson

    Den store variation i smagen af forskellige oste skyldes som nævnt tilstedeværelsen af blandt andet methylketoner. For nøjagtigt at bestemme de stoffer der er til stede i en ost, og dermed hvilke molekyler der er skyld i ostens smag, kan oste-ekstrakter analyseres ved kromatografi. Kromatografi er et begreb der dækker over en række analysemetoder, der alle bygger på adskillelse af de molekyler, der er til stede i en prøve. Kromatografi blev oprindeligt anvendt i 1901 af botanikeren Mikhail S. Tsvet, der benyttede den til adskillelse af farvestoffer fra planteekstrakter. Ordet stammer fra græsk, chroma betyder farve og grafi skrive, hvorfor kromatografi betyder skrivning med farve.

    Tre vigtige former for kromatografi er – high-performance liquid kromatografi (HPLC), tyndtlagskromatografi (TLC) og gaskromatografi (GC). De bygger alle på samme overordnede princip, der involverer en stationær fase (fast stof) og en mobil fase (væske eller gas). Den mobile fase benyttes til at bevæge prøven gennem den stationære fase som illustreret i figur 1. Da de forskellige stoffer i prøven binder sig forskelligt til de to faser, vil de bevæge sig med forskellig hastighed, og derved bliver de adskilt. De forskellige bindinger, der findes mellem prøven og faserne, er beskrevet i afsnittet ”Intermolekylære kræfter”.

     

    Intermolekylære kræfter

    Polaritet:

    Elektronegativiteten af et atom, er et udtryk for, hvor godt stoffet kan tiltrække og holde på elektroner i kemiske bindinger. Jo højere elektronegativitet et atom har, jo bedre holder det så at sige på elektronerne. I en binding mellem to atomer med forskellig elektronegativitet, vil den delte elektronsky være forskudt mod det atom, der har den højeste elektronegativitet. Elektronegativitet angives som en tal-værdi, og et atoms elektronegativitet er bestemt relativt ud fra hydrogen, hvis elektronegativitet er sat til 2,2. Den benyttes da som reference, og et atoms elektronegativitet får en værdi i forhold til hvor elektronegativt det er, sammenlignet med hydrogen. I kan se en oversigt over atomer og deres elektronegativitet HER. Hvis forskellen i elektronegativitet er mere end 0,5, siges bindingen mellem de to atomer at være polær. Der vil da være en negativ og en positiv ende af bindingen. Hvis de intermolekylære bindinger ikke, på grund af symmetrier i molekylet, neutraliserer hinanden, vil stoffet udadtil være polært, og have hhv. en positiv og en negativ ende. Molekylet kaldes da en dipol. Den positive ende betegnes δ+ og den negative δ-. For en god ordens skyld skal forskellen på intermolekylære- og intramolekylære bindinger lige nævnes. Intermolekylære bindinger, og i øvrigt intermolekylære kræfter, betyder bindinger eller kræfter der virker mellem molekyler. Et eksempel er vand, der jo er bygget op af en masser H2O molekyler. De bindinger der bliver dannet mellem de enkelte H2O molekyler, er da intermolekylære.

    Intramolekylære bindinger derimod, er bindinger der er inde i selve molekylet, mellem de enkelte atomer. Bindingen mellem H og O i H2O er da en intramolekylær binding, fordi den er inde i et molekyle.

     

    Hydrogenbindinger:

    Hydrogenbindinger er de stærkeste intermolekylære bindinger. Svagt elektropositive hydrogenatomer, der sidder i polære bindinger, kan indgå i hydrogenbindinger med elektronegative atomer som O, N eller F enten intramolekylært eller intermolekylært. Hydrogenbindinger kan variere fra meget svage til ekstremt stærke. Styrken af en binding, vurderes ud fra hvor meget energi, der skal til for at bryde bindingen.

    London-kræfter:

    London-kræfter, eller dispersionskræfter som de også kaldes, er de svageste af de her beskrevne intermolekylære kræfter. Interaktionen sker mellem molekyler, der er midlertidige dipoler, i modsætning til ved dipol-dipol bindinger, hvor der er tale om permanente dipoler. En midlertidig dipol opstår, når et molekyles elektroner pludselig, på grund af den konstante bevægelse elektroner er i, befinder sig i den ene ”ende” af molekylet, som illustreret på figur 2,. Dette molekyle, der nu har dipol-status, kan frembringe en midlertidig dipol i et andet molekyle, som vist på figur 2. Vi har nu to molekyler der tiltrækker hinanden. Hvis dipolen i det ene molekyle skifter, således at der byttes om på δ- og δ+, frastøder de to molekyler nu hinanden. Dette kan føre til en ny induceret dipol hos det andet molekyle. Således skabes fluktuerendebindinger. Så længe molekylerne er tæt nok på hinanden, opretholdes disse bindinger.

    Figur 2. Induceret dipol.

    Tyndtlagskromatografi

    Tyndtlagskromatografi er den mest simple form for kromatografi. Den stationære fase består af en lille fast baggrundsplade af enten plastic, glas eller metal, dækket med f.eks. et tyndt, ensartet lag af enten silicagel eller alumina. Silicagel er silicium og oxygen i et kovalent bundet netværk. Da silicium er i hovedgruppe 4 i det periodiske system, har det fire elektroner i yderste skal. Atomet er derfor tetravalent og mangler fire elektroner for at opfylde oktetreglen. Denne kan opfyldes ved binding til fire oxygenatomer. Opbygning af silicagelen kan ses på figur 3. Det øverste lag af oxygen er bundet til hydrogenatomer, se figur 3, således at oktetreglen også er opfyldt for disse oxygenatomer.

    Figur 3. Opbygningen af en silica-gel.

    Når stofferne i en prøve skal adskilles, bliver en dråbe af prøven afsat på den ene ende af gelen. Ved at lade en væske – den mobile fase – trække op igennem gelen, bevæger stofferne i prøven sig gennem gelen,. De enkelte molekyler i prøven bevæger sig gennem gelen med forskellige hastigheder, pga. de forskellige intermolekylære kræfter mellem for det første stofferne i prøven og den mobile fase samt mellem stofferne i prøven og den stationære fase.

    Mulige intermolekylære interaktioner ved TLC:

    Hvis nogle af stofferne i prøven er dipoler, kan der dannes dipol-dipol bindinger med gelen, fordi Si-O bindingen er polær. På den måde bliver molekylet bremset, når det bevæger sig gennem gelen sammen med den mobile fase. Da dipol-dipol bindingerne er ikke-permanente, bliver molekylet ikke stoppet fuldstændigt, men bremses gentagne gange på vej gennem gelen. Først dannes en dipol-dipol binding med én binding i gelen. Denne brydes, og molekylet kan bevæge sig lidt op gennem gelen. Så dannes der måske endnu en binding, der igen tilbageholder molekylet lidt tid, inden den brydes, og sådan fortsætter molekylets vej gennem gelen.

    Elektronegative atomer fra visse komponenter i en prøve kan danne hydrogenbindinger med hydrogenatomerne på af silicagelen. Herved forsinkes molekylerne på vej gennem gelen, ligesom ved dipol-dipol bindingerne.

    London-kræfter bidrager også til en svag forsinkelse af molekylerne gennem en silicagel.

    Molekyler med mulighed for mange hydrogenbindinger vil naturligvis blive stærkere bremset end molekyler, der kun har mulighed for London-kræfter. Derfor skabes der et unikt mønster for hvert enkelt molekyle hvad angår bevægelsen.

    Den specifikke mobile fase, der bruges i TLC’en, har også betydning for, hvordan stofferne i prøven bevæger sig. Forskellige løbevæsker (=den mobile fase) har forskellige grader af polaritet, og derfor vekselvirker de forskelligt med de forskellige stoffer i prøven. Det betyder, at det er individuelt for de enkelte prøver, hvilke blandinger der er bedst at benytte som mobil fase.

    For at beslutte hvilken løbevæske der er bedst til at adskille stofferne i en prøve, kan man lave en række TLC-kørsler af prøven med forskellige blandinger af polære og ikke-polære opløsningsmidler, hvor graden af polaritet varierer.

    Det er yderst usandsynligt at to stoffer har fuldstændig samme muligheder for hydrogen-, dipol-dipol- og London-bindinger. Da stofferne heller ikke vekselvirker på samme måde med solventen, bør der ikke være problemer i at adskille komponenterne på en TLC plade, hvis man har fundet den optimale løbevæske.

    Da det ikke er alle molekyler, der kan ses på silicagelen med det blotte øje, er de fleste geler behandlet med et UV-fluorescerende stof. Når man lyser på pladen med UV-lys, vil stofferne ses som mørke pletter, der da kan afmærkes.

    For at identificere de molekyler der er i prøven, og dermed hvilke molekyler der giver pletten på TLC pladen, måles den strækning, hver enkelt komponent har bevæget sig. Dette divideres med den afstand løbevæsken har bevæget sig, og giver da Rf-værdien (Retentions faktoren):

    Den strækning en komponent har bevæget sig

    Rf= Den strækning løbevæsken har bevæget sig

    Da Rf-værdien er unik for et bestemt molekle, kan hver komponent sammenlignes med Rf-værdierne for en række standarder kørt under præcis samme betingelser.

    Det gælder nu, at de mindst polære stoffer vil have bevæget sig den længste vej på gelen, fordi de har bundet sig mindst til TLC-pladen.

    Hvis man kun er interesseret i at undersøge, om et enkelt stof er til stede i en prøve, kan man med fordel sætte en prøve af dette stof, en standard, yderst på den plade hvorpå ens undersøgelse foretages. Da Rf-værdien i høj grad afhænger af de betingelser, prøven er kørt under (temperatur, koncentration af dampe fra løbevæsken i den omgivende luft m.v.) kan prøven herved direkte sammenlignes med standarden.

    Figur 4. HPLC apparat

    HPLC

    I industrien bruger man ofte High-performance liquid kromatografi (HPLC). Koblet til en passende detektor (se herunder) er det ofte en meget følsom metode, og man kan derfor opdage og identificere meget små mængder af et enkelt stof i prøven. En simplificeret model af et HPLC-apparat kan ses på figur 4.

     

    Den mobile fase er på væskeform, og den stationære fase er placeret i en kolonne, som er et rør, indeholdende den stationære fase.

    Prøven, som man ønsker at analysere, bliver automatisk sprøjtet ind i apparatet, hvor den blandes med den mobile fase, Med et tryk på op til 400 atmosfære, bliver det hele derved presset gennem den stationære fase. I den stationære fase bliver de enkelte komponenter i prøven adskilt efter samme princip som i TLC. Endelig kommer stofferne gennem en detektor, der ved hjælp af UV-belysning skaber et unikt billede for alle de stoffer, som kan absorbere lyset. Stofferne kan således ses som en række toppe i et kromatogram. Den tid, det tager for hvert molekyle, fra det bliver sprøjtet ind, til der detekteres maksimalt signal for stoffet, kaldes retentionstiden.

    Der findes to forskellige former for HPLC, ”Normal phase HPLC” og ”Reverse phase HPLC”. Reverse phase (omvendt fase) kromatografi er den mest benyttede, men her beskrives princippet bag dem begge.

    Normal fase HPLC:

    I denne type HPLC, er solventblandingen en ikke-polær væske. Denne væske vekselvirker derfor kun med komponenter i prøven gennem London-kræfter. Den stationære fase derimod, består ofte af meget små polære silica-partikler, dvs. det stof der også benyttes som stationær fase ved tyndtlagskromatografi. Disse partikler er bygget op af atomer af grundstoffet silicium, der er sat sammen via oxygen atomer, i et kovalent bundet netværk. Silicium er i hovedgruppe 4 i det periodiske system, og har således fire elektroner i yderste skal. Atomet er derfor tetravalent og mangler fire elektroner for at opfylde oktetreglen. Den kan opfyldes ved binding til fire oxygenatomer. Opbygning af silicagelen kan ses på figur 3. Det øverste lag af oxygen er bundet til hydrogenatomer, se ligeledes figur 3, således at oktetreglen også er opfyldt for disse oxygenatomer.

    Eftersom silica-partiklerne er polære, er det stoffernes molekylære egenskaber, der afgør, om de helst vil ”opholde sig” i den mobile fase eller bliver ”bremset” af den stationære. Det bestemmer, hvor hurtigt komponenter fra ens prøve bevæger sig gennem kolonnen.

    Hydrogenatomerne på overfladen af silicagelen kan indgå hydrogenbindinger med elektronegative atomer fra visse komponenter, der er til stede i den analyserede prøve. Det forsinker også molekylerne på vej gennem kolonnen.

    London-kræfter bidrager ligeledes til en svag forsinkelse af molekylerne gennem kolonnen.

    Molekyler med mulighed for mange hydrogenbindinger vil naturligvis blive stærkere bremset end molekyler, der kun har mulighed for London-kræfter. Derfor vil retentionstiden være unik for hver enkelt komponent. Eventuelle vekselvirkninger mellem solventen og ens prøve vil også have indflydelse på retentionstiden for et stof, hvilket yderligere bidrager til unikke retentionstider for de forskellige molekyler.

    Omvendt fase HPLC:

    I denne type HPLC, benytter man stadig silica i den stationære fase, men den er gjort upolær ved at binde lange carbonhydrid-kæder til silica-overfladen. Der er nu ikke længere nogen større mulighed for vekselvirkninger med polære stoffer. Da den mobile fase i denne type HPLC er polær, vil de polære molekyler bevæge sig hurtigt gennem kolonnen, idet de følges med den mobile fase.

    Ved omvendt fase kromatografi er basiseluenten vand. Hvis vand alene udgør den mobile fase bliver analysetiden dog for lang. Derfor tilsættes flere organiske væsker for at formindske eluentens polaritet. Typisk anvendes stoffer som methanol og acetonitril.

    Derimod vil ikke-polære stoffer i prøven have mulighed for at vekselvirke med carbonhydrid-kæderne via London-kræfter, og det bliver derfor disse stoffer, der bremses gennem kolonnen.

    Figur 5. Carbonylgruppe

    Når stofferne er kommet gennem kolonnen, når de til slut til detektoren. Her benyttes ofte UV-bestråling til at detektere de komponenter, der passerer. En række organiske stoffer har den egenskab, at de kan absorbere UV-lys af forskellige bølgelængder. Egentlig er det ikke hele stoffet der absorberer UV-lys, men kun de forskellige funktionelle grupper molekylet indeholder. Således vil en carbonylgruppe (se figur 5) fra ét stof absorbere UV-lys ved samme bølgelængde som en carbonylgruppe siddende i et andet molekyle.

    Rent praktisk foregår detekteringen ved at der udsendes UV-lys af en bestemt bølgelænge på den ene side af den passerende mobile fase. På den anden side er monteret en fotodetektor. Fotodetektoren måler, hvor meget lys der er tilbage, efter det har passeret prøven. Den bestememr således mængden af absorberet lys. Dette omsættes til signal-toppe på et kromatogram, hvor signal-toppen viser den pågældende retentionstid. Mængden af absorberet lys afhænger af, hvor mange molekyler der passerer til en given tid. Det kommer til udtryk ved arealet af den tegnede top. Der vil altså være en sammenhæng mellem dette areal og koncentrationen af stof i prøven. Det er som nævnt er de enkelte funktionelle grupper i et molekyle, der absorberer lys. Derfor kan det såkaldte UV-spektrum for det enkelte stof, sagtens være en række toppe af forskellig størrelse, placeret op af hinanden, såfremt molekylet indeholder flere funktionelle grupper. Unikke stoffer kan derfor give anledning til meget karakteristiske UV-spektre.

    Man vælger bølgelængden for UV-strålingen, så den ”passer” med de funktionelle grupper, der findes i de stoffer, man forventer, er til stede i prøven. Da den mobile fase også absorberer UV-lys, skal man som minimum benytte en bølgelængde, der er højere end den, solventen absorberer.

    Afhængigt af de substanser man ønsker at analysere, kan forskellige kolonner benyttes. Der findes dog en række forskellige måder at opbygge kolonner på, idet de kan variere i partikelstørrelse, kolonnediameter og længde, samt i det materiale der benyttes som stationær fase. Det samme gælder for solventer. Her kan også benyttes en række forskellige, og hvilken der er bedst for en specifik prøve, må bestemmes eksperimentelt. Retentionstiden for et givent molekyle varierer naturligvis, når der benyttes forskellige kolonner og solventer, samt forskellige temperaturer af kolonnen. Det er derfor ekstremt vigtigt at notere de betingelser ens HPLC-analyse er blevet udført under.

    For visse stoffer kan man finde deres retentionstider i standardtabeller. Det er her vigtigt at benytte en tabel, der knytter sig til den type HPLC, man ønsker at bruge. Det er dog altid en god idé at lave en standardprøve med de rene stoffer af de komponenter, man forventer at finde i prøven. Standardprøven skal analyseres under de samme betingelser som prøven. Kun da kan man være helt sikker på den retentionstid og det mønster et givent stof giver. En standard kan også benyttes, hvis man ønsker at kende koncentrationen af et bestemt stof i prøven. Der forberedes da en række standardprøver med kendte koncentrationer, f.eks. 1, 2 og 10 mmol/L. Ved at udregne arealet under signal-toppene for dette stof kan der laves en korrelation mellem signal-toppens areal og koncentrationen af stof i standarden. Denne korrelation laves ved at tegne en standardkurve med arealet under toppen som funktion af koncentrationen. Dette kan nu sammenlignes med signal-toppens areal for det samme stof i prøven. Koncentrationen af stoffet kan derpå findes ved simpel forholdsregning.

    Når resultatet af HPLC skal læses, ses der altså på kromatogrammet, som indeholder signal-toppene. Der sammenlignes med HPLC-resultater af prøver med rene stoffer, og man kan – ved at sammenligne retentionstid og mønster af toppene – nu identificere ønskede stoffer og mængder i ens prøve.

    Tabel: http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/Detectors/det_uvab.html

    Gaskromatografi

    Gaskromatografi (GC) benyttes meget i både industri og forskning. Der bruges stadig en mobil og en stationær fase, men modsat HPLC og TLC, er den mobile fase en gas, bæregassen, og ikke en væske. Den stationære fase er derimod en væske med et meget højt kogepunkt. Væsken er opsuget i et fast stof. Det overordnede princip for GC er følgende:

    En lille mængde prøve injiceres i GC-apparatet, hvor det opvarmes, så det går over på gasform. Derefter kommer det i kontakt med den mobile fase, en kemisk inaktiv gas som f.eks. helium. Den mobile fase bærer dernæst prøven ind i en kolonne, indeholdende den stationære fase. Kolonnen er placeret i en separat ovn, således at temperaturen kan kontrolleres. Nu bevæger den mobile fase sig gennem den stationære fase, hvorved de enkelte komponenter i prøven separeres. For enden af kolonnen er placeret en detektor, der observerer molekylerne, når de kommer ud af kolonnen.

    Figur 6. Gas kromatograf

    Det signal, der kommer når et stof observeres, viser sig som en række signal-toppe, der opstår på bestemte tidspunkter. Herved bestemmes den tid, der er gået fra prøven blev injiceret til den blev detekteret. Den tid kaldes også retentionstiden.

     

    Kolonnen:

    Kolonnen er et langt, fleksibelt rør med en længde på et par meter. Røret indeholder den stationære fase. De kolonner, der oftest benyttes, kaldes kapillærkolonner.

    Der findes to former for kapillærkolonner: wall-coated open tubular (WCOT) og support-coated open tubular (SCOT). I begge tilfælde er kolonne-diameteren et par tiendedele mm. En WCOT består af et rør, hvis inderside er dækket med den flydende stationære fase. En SCOT er ligeledes et langt rør, men her er indersiden først belagt med et tyndt lag materiale, f.eks. silica, på hvilket den flydende stationære fase er adsorberet. Kolonnen ligger rullet op inde i kolonneovnen, som vist på figur 6. Her kan temperaturen kontrolleres.

    Når en prøve bliver ”båret ind” i kolonnen af den mobile fase, er der en række faktorer, der medvirker til separationen af de enkelte komponenter.

    Først og fremmest er der opløseligheden af en komponent i den flydende stationære fase. Hvis komponenten er letopløselig, vil den befinde sig i væskefasen, og dermed ikke bliver båret med af gassen ligeså nemt som uopløselige stoffer. Dette vil resultere i en lang retentionstid.

    Også kogepunktet af en komponent er af betydning for retentionstiden. Hvis et stofs kogepunkt ligger over kolonnens temperatur, vil stoffet kondensere, når det kommer ind i kolonnen. Dermed vil stoffet være sværere at transportere med gassen, og derfor vil retentionstiden blive længere.

    Under en analyse er den typiske fremgangsmåde, at kolonnetemperaturen øges undervejs. Dermed får man først de stoffer igennem, som er svært opløselige i væskefasen, og som har lave kogepunkter. Senere kan man nå til en temperatur, hvor stoffer, der før var kondenserede, nu går på gasform, og derfor bæres igennem kolonnen. Desuden kan stoffer, der før var i væskefasen, opnå så høj en energitilstand ved forhøjet temperatur, at vekselvirkingerne med væsken ikke længere består, og de derfor vil bevæge sig over i gasfasen.

    Efter prøvekomponenterne har passeret kolonnen, når de til detektoren. Der findes en række forskellige detektorer, der alle benyttes ved forskellige formål. Nogle detektorer ødelægger komponenterne i prøven, hvilket ikke er så hensigtsmæssigt, hvis man gerne ville analysere videre på prøven, f.eks. ved massespektroskopi. Andre detektorer bevarer prøven. Der er også forskel på, hvor præcise forskellige detektorer er til at bestemme koncentrationer. Valget af detektor afhænger således af de krav man har til analysen.

    Fælles for mange detektorer er, at de reagerer ved at danne en strøm. Størrelsen af denne strøm vil afhænge af, hvor meget stof der er i prøven. Når der observeres en strøm i systemet, giver det udslag i form af en signal-top på et diagram, på tidspunktet for detekteringen. Dette signal kan enten vises via online måling på en computer, eller på en gammeldags grafskriver. Resultatet af gaskromatografien er derfor et diagram, hvorpå man kan aflæse retentionstider for detekterede stoffer. Ved hjælp af toppens størrelse kan man bestemme koncentrationen af et stof. Ved at sammenligne med en standardprøve indeholdende udelukkende det eller de stoffer, man ønsker at analysere for, kan sammensætningen af ens prøve bestemmes.

    Hvis man vil bestemme, hvor meget der er til stede i prøven af et specifikt molekyle, kan der analyseres en række standardprøver med varierende koncentrationer. Ønskes det at bestemme hvor meget ethanol, der er til stede i en prøve, laves først en standardrække, hvor prøver med f.eks. 1, 2, 5 og 10 mmol/L rent ethanol analyseres. For hver prøve vil der dannes en top på et diagram af en bestemt størrelse. Arealet under hver signal-top udregnes, og en korrelationmellem koncentration og signal-top arealet kan da findes. Dernæst analyserer man prøven, hvori man forventer at finde ethanol. Arealet af signal-toppen ved retentionstiden for ethanol udregnes. Via koncentration/areal-korrelationen kan koncentrationen af ethanol i prøven nu bestemmes ved simpel forholdsregning.

  • Øvelser

    Øvelse til Svampe laver din ost

    Der er en øvelse tilknyttet dette projekt. Det er en eksperimentel øvelse, kaldet Dyrkning af svampe fra ost, hvor eleverne arbejder med at isolere svampe fra skimmeloste indkøbt af underviseren. Disse vokses på YES medie og identificeres vha. en vejledning fundet i undervisningsmaterialet.

    Dyrkning af svampe fra ost

    Som I kan læse i undervisningsmaterialet ”Svampe laver din ost”, er det yderst vigtigt for osteproducenten Arla Foods, at der ikke er kontaminanter på de oste, der sælges i butikkerne. I skal derfor undersøge, hvilke svampe I kan finde på en ganske almindelig blåskimmelost. Det skal gøres ved at vokse dem i petriskåle og derefter undersøge deres farve, størrelse og sporer.

    Der er forskel på, hvor godt svampe vokser på forskellige medier. Derfor skal I prøve at dyrke svampene på to forskellige medier og finde ud af, om svampene gror bedre på det ene end på det andet, og hvorfor.

    Forberedelser

    Underviseren bedes indkøbe blåskimmeloste, gerne én pr. fire hold. Det er ligeledes nødvendigt at I har et 30 grader inkubatorskab til rådighed, da svampene skal dyrkes ved denne temperatur. Når der laves medie til dyrkningen af svampe, gøres dette jf. opskriften i nedenstående øvelsesvejledning eller se opskriften i menuen til venstre.

    Klik herunder for at downloade øvelsesvejledningen.

    ØVELSESVEJLEDNING TIL ØVELSEN “DYRKNING AF SVAMPE FRA OST”

    Hvis du har spørgsmål af enhver art til øvelsen, er du meget velkommen til at kontakte Biotech Academy ved at sende en mail på biotech@bio.dtu.dk. Så vil vi forsøge at hjælpe bedst muligt, hurtigst muligt.

    Rigtig god fornøjelse!

    Her er en oversigt over de to medier vi benytter i forsøget, YES og CYA, og deres komponenter.

    Yeast extract – sucrose agar                                       YES


    Yeast extract…………… 20.0 g [DIFCO, 0127-01-7]

    Sucrose………………… 150 g [BDH, 10274]

    MgSO4·7H2O……………. 0.50 g [MERCK, 5886]

    Agar……………………… 20.0 g [Bie & Berntsen, BBB 10030, SO-BI-Gel, Agar-Agar]

    Spor metaller……………. 1.0 ml

    Destilleret vand………. 885 ml

    Reguler pH til 6.5 ± 0.1

    Czapek yeast ex­tract agar                                         CYA


    Yeast extract……………………………. 5.0 g [DIFCO, 0127-01-7]

    Czapek Dox Broth (se nedenfor)….. 35.0 g [DIFCO, 0338-01-2]

    Agar……………………………………… 15.0 g [Bie & Berntsen, BBB 10030, SO-BI-Gel, Agar-Agar]

    Spor metaller……………………………. 1.0 ml

    Destilleret vand……………………… 1000 ml

    Czapek dox broth (til 1L)

    Sucrose…………….. 30.0 g [BDH, 10274]

    NaNO3……………….. 3.0 g [MERCK, 6537]

    K2HPO4……………… 1.0 g [MERCK, 5099]

    KCl…………………… 0.50 g [MERCK, 4936]

    MgSO4·7H2O……….. 0.50 g [MERCK, 5886]

    FeSO4·7H2O ……….. 0.010 g [MERCK, 3965]

    NB! Spormetaller:

    Vi kommer altid 1 ml spormetalopløsning i vores medier, så svampene udvikler sig normalt. Dette gør vi fordi man ofte bruger dobbeltdestilleret vand. Derfor tilsættes lidt kobbersulfat og zinksulfat. Det var ikke nødvendigt i gamle dage, da man brugte vand med kobber- og zink-ioner i pga. brugen af kobberrør og forzinkede rør i vandledningssystemet. Svampe har brug for bl.a. kobber ioner for at katalysere polymeriseringen af 1,8-dihydroxynaphthol til melanin, der er det grønne pigment, der beskytter sporerne mod UV lys.

    Spormetallerne er som følger:

    I 100 ml vand opløses 0.5 g CuSO4 5H2O og 1 g ZnSO4, 7H2O. Af denne opløsning bruge 1 ml til hver liter agar medium.

    Når I skal identificere de svampe I har vokset frem, kan det gøres både ved hjælp af deres udseende og de metabolitter de producerer. Brug oversigterne herunder til at finde jeres svamp.

    Oversigt over Penicillum stammer

    Identificer svampen vha. dens udseende

    Identificer svampen vha. dens sekundære metabolitter, fundet ved TLC


    Oversigt over 
    Penicillium stammer

    Her finder I en oversigt over en række Penicillium stammer. Stammerne er nummererede, og det givne nummer benyttes videre på siden, hvor I kan finde information om deres udseende på forskellige medier, de metabolitter de producerer m.m.. Oversigten viser nummer, svampens navn og hvem der har opdaget den og hvornår.

    1.                   P. aethiopicum Frisvad 1989

    2.                   P. atramentosum Thom 1910

    3a.                 P. aurantiogriseum Dierckx 1901

    3b.                 P. polonicum Zaleski 1927

    3c.                 P. melanoconidium (Frisvad) Frisvad & Samson 1999

    3d.                 P. neoechinulatum (Frisvad, Filtenborg & Wicklow) Frisvad & Samson 1999

    3e.                 P. viridicatum Westling 1927

    3f.                 P. freii Frisvad & Samson 1999

    3g.                 P. aurantiovirens Biourge 1923

    3h.                 P. tricolor Frisvad, Seifert, Samson & Mills 1994

    3i.                  P. cyclopium Westling 1927

    4.                   P. brevicompactum Dierckx 1901

    5a.                 P. camemberti Thom 1906

    5b.                 P. commune Thom 1906

    5c.                 P. palitans Westling 1911

    6a.                 P. chrysogenum Thom 1910

    6b.                 P. dipodomyis (Frisvad, Filtenborg & Wicklow) Frisvad 1997

    6c.                 P. nalgiovense Laxa 1932

    7.                   P. clavigerum Demelius 1922

    8.                   P. confertum (Frisvad, Filtenborg & Wicklow) Frisvad 1989

    9.                   P. coprophilum (Berk. & Curt.) Seifert & Samson 1985

    10.                 P. coprobium Frisvad 1989

    11.                 P. crustosum Thom 1930

    12.                 P. digitatum (Pers.:Fr.) Sacc. 1832 (Predominantly one-stage branched)

    13a.               P. echinulatum Fassatiová 1977

    13b.               P. discolor Frisvad & Samson 1997

    14a.               P. expansum Link 1809

    14b.               P. formamosanum Hsieh, Su & Tzean 1987

    16a.               P. glandicola (Oud.) Seifert & Samson 1985

    16b.               P. concentricum Samson, Stolk & Hadlok 1976

    17a.               P. griseofulvum Dierckx 1901

    17b.               P. dipodomyicola (Frisvad, Filtenborg & Wicklow) Frisvad 1999

    18a.               P. hirsutum Dierckx 1901

    18b.               P. albocoremium (Frisvad) Frisvad 1999

    18c.               P. allii (Vincent & Pitt) Frisvad 1989

    18d.               P. hordei Stolk 1969

    18e.               P. venetum (Frisvad) Frisvad 1999

    19a.               P. italicum Wehmer 1894

    19b.               P. ulaiense Hsieh, Su & Tzean 1987

    20.                 P. solitum Westling 1911

    21.                 P. mononematosum (Frisvad, Filtenborg & Wicklow) Frisvad 1989

    22.                 P. olsonii Bain. & Sart. 1912

    23a.               P. roqueforti Thom 1906

    23b.               P. carneum (Frisvad) Frisvad 1996

    23c.               P. paneum Frisvad 1996

    24a.               P. nordicum Dragoni & Cantoni ex Ramírez 1986

    24b.               P. verrucosum Dierckx 1901

    25.                 P. vulpinum (Cooke & Massee) Seifert & Samson 1985

    26.                 P. sclerotigenum Yamamoto 1955 (Predominantly one-stage branched)

    27.                 P. oxalicum Currie & Thom 1915 (Predominantly one-stage branched)

    Identificer jeres svamp

    Først ser vi på hvordan svampene ser ud. Når I har målt deres diameter, kan I gå ind i oversigten herunder, og finde ud af hvilke mulige svampe det er I har vokset frem. Herefter ser I på hvilke farver svampene har, og benytter oversigten “Makromorfologiske kendetegn og farver” ligeledes herunder, til igen at pejle jer ind på hvilken svamp I har. Endelig skal I se på mikromorfologiske kendetegn og metabolitter produceret.

    Fysiologiske kendetegn

    Her er størrelsen af svampene præsenteret efter 7 dages vækst ved 25 grader. En svamp kan være repræsenteret i flere forskellige størrelses-intervaller.

    Koloni diametre (efter 7 dage ved 25°C):

    På CYA:

    < 15 mm:                    7, 3i, 24a, 24b

    15-19 mm:                   3a, 3e, 3f, 3g, 3i, 4, 5a, 5b, 6c, 7, 9, 10, 12, 14b, 16a, 16b, 17a, 20, 21, 24a, 24b

    20-24 mm:                   2, 3a, 3c, 3e, 3f, 3g, 3i, 4, 5a, 5b, 5c, 6a, 6c, 7, 8, 9, 10, 12, 13b, 14b, 16a, 16b, 17a, 18e, 19a, 20, 21, 24a, 24b, 25

    25-29 mm:                   1, 2, 3a, 3b, 3c, 3e, 3f, 3g, 3i, 4, 5a, 5b, 6a, 6b, 6c, 8, 9, 10, 12, 13a, 13b, 14b, 16a, 16b, 17a, 18a, 18b, 18c, 18d, 18e, 19a, 20, 21, 22, 25

    30-34 mm:                   1, 2, 3a, 3b, 3e, 3f, 4, 5a, 5b, 5c, 6a, 6b, 6c, 9, 11, 12, 13a, 13b, 14a, 14b, 16a, 18a, 18b, 18c, 18d, 18e, 19a, 20, 21,  22, 23a, 23b, 25

    35-39 mm:                   1, 2, 3b, 3e, 5b, 5c, 6a, 11, 13a, 13b, 14a, 14b, 16a, 18a, 18b, 18c, 18d, 19a, 22, 23a, 23b, 23c, 25

    40-45 mm:                   2, 3b, 6a, 11, 14a, 14b, 18b, 18d, 19a, 23a, 23b, 23c, 25, 26

    46-50 mm:                   6a, 11, 14a, 23a, 23b, 23c, 26

    > 51 mm:                    23a, 23b, 23c, 26

    På YES:

    < 20mm:                     7, 24a, 24b

    20-24 mm:                   3c, 3e, 3f, 4, 6c, 7, 16a, 24a, 24b

    25-29 mm:                   3a, 3c, 3e, 3f, 3g, 3i, 4, 5a, 5b, 6c, 8, 9, 10, 12, 16a, 16b, 17a, 21, 24a, 24b, 25

    30-34 mm:                   1, 2, 3a, 3b, 3c, 3e, 3f, 3g, 3i, 4, 5a, 5b, 6c, 7, 8, 9, 10, 12, 13a, 13b, 14b, 16a, 16b, 17a, 20, 21, 24a, 24b, 25

    35-39 mm:                   1, 2, 3a, 3b, 3c, 3e, 3f, 3g, 3i, 4, 5a, 5b, 5c, 6c, 8, 9, 10, 11, 12, 13a, 13b, 14b, 16a, 17a, 18b, 18c, 18d, 18e, 19a, 20, 21, 25

    40-44 mm:                   1, 2, 3a, 3b, 3e, 3g, 3i, 5a, 5b, 5c, 6a, 6c, 9, 11, 12, 13a, 13b, 14a, 14b, 16a, 18a, 18b, 18c, 18d, 18e, 19a, 20, 21, 22, 25

    45-50 mm:                   1, 2, 3b, 5b, 5c, 6a, 6c, 9, 11, 12, 13a, 13b, 14a, 14b, 16a, 18a, 18b, 18c, 18d, 18e, 19a, 20, 22, 23b, 25

    51-55 mm:                   1, 2, 6a, 11, 12, 13a, 13b, 14a, 14b, 18b, 18c, 19a, 22, 23a, 23b, 23c, 26

    56-60 mm:                   1, 2, 6a, 11, 12, 14a, 18b, 19a, 22, 23a, 23b, 23c, 26

    61-65 mm:                   2, 6a, 12, 14a, 18b, 19a, 23c, 26

    > 65 mm:                    18b, 19a, 23a, 23b, 23c, 26

    Makromorfologiske kendetegn og farver

    Mikromorfologiske kendetegn

    Hvis I vil se på svampene under mikroskop, følger her en liste over sporernes udseende på de enkelte svampe.

    Conidia:

    Cylindriske og rundede ender: 12, 19a, 19b

    Elliptiske:                               1, (3a), (3b), 4, (5b), (5c), (6a), 7, 8, 9, 10, 12, 14a, 14b, 16a, 16b, 17a, 17b, 19a, 19b, (20),21, 22, 25, 26, 27

    Echinulate:                             3d, 13a, 13b

    Let ru:                                   4, 18d, (20), 22,

    > 3.5 µm long:                       12, 19a, 19b, 26, 27

    Phialides:

    < 6.5 µm long:             17a, 17b

    Kort med bred tyk hals: 6a, 6b, 6c, 21

    Rami:

    Divergent:                  2, 6a, 6b, 6c, (8), (12), 17a, (18d), 21,

    Højt antal:                  22

    Få eller ikke til stede:  12, 26, 27

    Supplerende koloni-kendetegn for Penicillium

    P. aethiopicum: Stærkt pliceret revers på CYA og YES. Gult revers på CYA. Stængler typisk ru på MEA, men glatte på CYA.

    P. albocoremium: Hvide synnemata på MEA. Vatagtig koloni på CYA.

    P. allii: Korte meget ru stængler. Flade kolonier.

    P. atramentosum: Rødbrunt revers på CYA.

    P. aurantiogriseum: Tydeligt blå (grønne) konidier på MEA. Ofte grålige og ellipsoide konidier på CYA.

    P. aurantiovirens: Flokkøs på MEA, vattet mycelie-rand, mange exudat-dråber, blå (grønne) konidier på MEA.

    P. brevicompactum: Penicilli kompakte, opsvulmede for enden af stængel og metulae. Phialiderne spredt ud som en vifte, ligner overfladisk ligner en Aspergillus.

    P. camemberti: Hvide vattede kolonier på alle substrater.

    Pcarneum: Flødefarvet til lysebrunt revers på CYA. Kan gro på 0.5 % edddikesyre. Gror godt på nitrit agar. Lugter kraftigt af ‘mug’.

    P. chrysogenum: Ofte gule exudatdråber og revers på CYA. Tynde kolonier på MEA. Næsten altid store kolonier på alle substrater.

    P. clavigerum: Nåleformede indeterminate synnemata. Brungult revers CYA.

    P. commune: Oftest svag sporulation YES. Flødefarvet revers, der bliver brunt til sortbrunt med tiden på YES i mange, dog ikke alle isolater.

    P. concentricum: Blågrønne konidier på MEA, orange revers på MEA. Af og til tændstikformede synnemata på MEA.

    P. coprobium: Mørkegrønne konidier på CYA. Af og til små hvide sclerotier på MEA. Konidier i koncentriske ringe på CYA.

    P. coprophilum: Mørkebrunt revers CYA. Meget ujævn kolonimargen på især MEA.

    P. crustosum: Konidier dannes i så stort tal at der efter 7-14 dage dannes skorper.

    P. cyclopium: (grå)grøn på CYA, men blå grå grøn på MEA, stærkt gult obvers og flad koloni på YES.

    P. digitatum: Konidier (olivenfarvede) er usædvanligt store og af varieret form og størrelse. Penicilli er ofte fragmentariske med kun to delepunkter.

    P. discolor: Meget mørkegrønne konidier på alle substrater, revers på YES bliver orange til kraftig rødt efter 7-14 dage.

    P. echinulatum: Meget mørkegrønne konidier på alle substrater.

    P. expansum: Ret “høje” kolonier, lidt vatagtige. Ofte klare eller brune exudatdråber på CYA. Brunligt revers på CYA. Af og til synnemata (tændstikformede) på MEA.

    P. freii: Store klare exudat-dråber på CYA, særlig stærk sporeproduktion på CYA.

    P. glandicola: Rødorange revers på MEA, fjeragtige synnemata på MEA.

    P. griseofulvum: Meget små phialider (< 6.5 mm) med korte halse.

    P. hirsutum: Gulbrunt revers og exudatdråber på CYA. Ofte gule tændstikformede synnemata på MEA.

    P. hordei: Vatagtig på CYA med gult mycelium. Gule synnemata (fjeragtige) på MEA.

    P. italicum: Brunrødt revers på CYA. (P. ulaiense forekommer på citrus frugter,den vokser langsomt på CYA, har flødefarvet revers og tydelige hvide synnemata)

    P. melanoconidium: Mørkegrønne konidier på CYA, men blågr¢nne konidier på MEA. Gult revers på CYA.

    P. nalgiovense: Orange revers på MEA. Hvide eller lyst grågrønne konidier. Konidier kan dog også være mørkt grønne. Indtil videre kun fundet på salami.

    P. nordicum: Flødefarvet revers på YES. Langsomtvoksende på CYA og MEA. Rent grønne konidier.

    P. olsonii: Meget lange stilke med multiramulate penicilli. Ligner overfladisk en Aspergillus i stereomikroskop.

    P. palitans: Stærk sporulation på YES, grønne konidier. Gul til gulorange revers. Mørkegrønne konidier på CYA.

    P. paneum: Hurtigtvoksende på alle substrater. Flødefarvet til lysebrunt revers på CYA. Kan gro på 0.5 % edddikesyre. Gror godt på nitrit agar.

    P. polonicum: Stor flad koloni på CYA med blågrønne konidier

    P. roqueforti: Kan gro på 0.5 % edddikesyre. Gror godt på nitrit agar. Mørkegrønt revers på CYA. Spindelvævsagtig tynd kolonimargin på CYA og MEA.

    P. sclerotigenum: Sclerotier på MEA. Hidtil kun fundet på yams.

    P. solitum: Mørkegrønne konidier på CYA. Flødefarvet revers på CYA ofte med brun midte.

    P. venetum: Stærktfarvet brun + bananfarvet revers på CYA, blågrønne konidier. Ret lav væksthastighed.

    Pverrucosum: Gullig til flødefarvet revers på CYA, kraftig rødbrunt til violetbrunt revers på YES. Langsomtvoksende på CYA og MEA. Rent grønne konidier.

    P. viridicatum: Rent grønne konidier på alle substrater.

    P. vulpinum: Store tændstikformede synnemata på CYA og MEA.

    Sekundære metabolitter og TLC

    Produktionen af sekundære metabolitter detekteret ved TLC

    Herunder ser I en liste over sekundære metabolitter, og de svampe der producerer dem.

    3-methoxyviridicatin:              3b, 3d, 3f, 3g, 3i, 18b, 18c, 18e

    Aurantiamine:                         3a, 3f, 3d

    Brevianamide A:                     3e, (4)

    Chaetoglobosin C:                  14a, 13b

    Chrysogine:                             6a, 6b, 6c, 18b

    Citrinin:                                   14a, 18b, 24b

    Compactin A & B:                  18a, (20)

    Cyclopaldic acids:                   (5a), 5b, 21, (23b)

    Cyclopenin &  Cyclopenol:     3b, 3d, 3f, 3g, 3i, (5c), 11, 13a,13b,18b, 18c, 18e, 20, 25

    Cyclopiazonic acid:                 5a, 5b, 5c, (7), 17a, 17b

    Griseofulvin:                           1, 9, 17a, 17b, 26

    Isofumigaclavine A:                5c, 7, 23a, 23b

    Meleagrin:                               (2), 6a, 8, 9, 10, 16a, 16b, 18b, 18c, (25)

    Met O:                                     4, 22

    Mycophenolic acid:                 4, (23a), 23b

    Ochratoxin A:                         24a, 24b

    Oxaline:                                   2, 3c, 9, 16a, 25, 27

    Penicillic acid:                         3a, 3b, 3c, 3d, (3e), (3f), 3g, 3i, 18b,(23b)

    Penitrem A:                             3c, 7, 11, 16a, (16b), 18b, 23b

    Raistrick phenols:                    4

    Roquefortine C:                      (2), 6a, (7), 8, 9, (10), 11, 14a, 16a, 16b,17a,18a, 18b, 18c, 18e, 23a, 23b, 23c, 25, 26, (27)

    Rugulovasine A & B:              2, (5a), 5b

    Terrestric acid:                        3a, 3h, 11, 18a, 18b, 18d, 18e

    Territrems:                               13a

    Verrucosidin:                          3a, 3b, 3c

    Viomellein:                              (3c), 3e, 3f, 3h, 3i, (7)

    Viridamine:                             3e

    Viridicatin:                              (5c), 11, 13a, 13b, 20, 25

    Xanthomegnin:                       (3c), 3e, 3f, 3h, 3i, (7)

    Metabolitnøgle for Penicillium metabolitter

    Denne tabel viser Rf værdierne for en række forskellige metabolitter, når der benyttes hhv. TEF og CAP som løbevæske ved TLC’en. Herudover forklares plettens farve på TLC pladen under forskellige behandlinger.

    Metabolit

    Rf værdi: TEF/CAP

    Før spray

    AlCl3

    Ce(SO)4

    ANIS

    3-methoxyviridicatin

    154 / 88

    blå

    blå

    blå

    blå

    Aurantiamin

    31 / 80

    blå

    blå

    grå

    grå

    Brevianamide A

    71 / 86

    gul-grøn

    gul

    orangeVIS

    grå-gul

    Chaetoglobosin C

    111 / 80

    mørk

    mørk

    mørk

    brun

    ChrysoginY

    62 / 28

    blå254

    blå

    grå

    grå

    CitrininY

    126H / 15H

    gul-grøn

    gul

    gul

    lys gul

    Compactin A & BY

    54+94 / 54+104

    DI

    DI

    DI

    gul-brun

    Cyclopaldic acidsY

    77+146 / 54

    svag blå254

    turkis

    turkis

    lys turkis

    Cyclopenin

    111 / 94

    DI

    violetVIS

    grå

    grå

    Cyclopenol

    82 / 79

    DI

    grå-blåVIS

    grå

    grå

    Cyclopiazonic acid

    130H / 17H

    brun

    blå-brun

    lys

    lys brun

    Griseofulvin

    100 / 100

    blå

    grå

    grå

    lys blå

    (Iso)fumigaclavine A

    7 / 33

    grå

    grå

    grå

    brun

    Meleagrin/Oxaline

    4 / 74

    DI

    brun-gulVIS+365

    Met O

    120 / 125

    gul-grøn254

    gul

    gul

    gul

    Mycophenolic acid

    135 / 85

    blå254

    blå

    blå

    blå

    Ochratoxin A

    153 / 23

    blå-grøn

    blå-grøn

    blå-grøn

    blå-grøn

    Penicillic acidY

    103 / DI

    DI

    DI

    DI

    rød-blå

    Penitrem A

    189 / 120

    DI

    blå-sortVIS+365

    Raistrick phenols

    87/35

    blå254

    blå

    blå

    blå

    Roquefortine C

    0 / 46

    DI

    DI

    orangeVIS

    mørkVIS

    Rugulovasine A & B

    11 / 22+50

    grå-blå

    grå-blå

    grå

    grå

    Terrestric acidY

    106H / 100

    DI

    DI

    DI

    gulVIS

    Territrems

    85+115+140 /

    112+96+85

    blå

    blå

    blå

    blå

    Verrucosidin

    144 / DI

    DI

    DI

    DI

    brun-gul

    Viomellein

    106 / 104

    gul-brunVIS

    gul-brunVIS

    DI

    mørk

    Viridamine

    20 / 46

    lys blå

    blå

    blå

    blå

    Viridicatin

    154 / 77H

    svag blå254

    violet

    grå-blå

    grå-blå

    Xanthomegnin

    74 / 80

    gul-brunVIS

    gul-brunVIS

    DI

    mørk

    Y Metabolitterne dannes bedst på YES; H Metabolitterne ses ikke som veldefinerede pletter, men som haler.; DI Detekteres ikke under de givne betingelser; 365 Farven ses under UV lys 365 nm; 254 Farven ses under UV lys 254 nm; VIS Farven ses ved synligt lys.

    Kendte Penicillium metabolitter detekteret via TLC

    Denne oversigt beskriver hvilke metabolitter de enkelte Penicillium stammer producerer. Den kan også benyttes til at identificere svampe med.

    P. aethiopicum: Griseofulvin

    P. albocoremium: Citrinin, (penicillic acid), meleagrin, roquefortine C, terrestric acid, viridicatins, penitrem A

    P. allii: meleagrin, Roquefortine C, viridicatin

    P. atramentosum: (Meleagrin), oxaline, (roquefortine C), rugulovasine

    P. aurantiogriseum: Aurantiamine, penicillic acid, terrestric acid, verrucosidin

    P. aurantiovirens: 3-methoxyviridicatins, penicillic acid

    P. brevicompactum: Brevianamide, mycophenolic acid, met. O, raistrick phenols

    P. camemberti: Cyclopiazonic acid

    P. carneum: Isofumigaclavin A, (cyclopaldic acid), mycophenolic acid, (penicillic acid), penitrem A, roquefortine C,

    P. chrysogenum: Roquefortine C, chrysogine, meleagrin

    P. clavigerum: (Meleagrin), penitrem A, (roquefortine C), (viomellein)

    P. commune: Cyclopaldic acid, cyclopiazonic acid, rugulovasine

    P. concentricum: Meleagrin, (penitrem A), roquefortine C

    P. coprobium: Patulin, (roquefortine C), (meleagrin)

    P. coprophilum: Griseofulvin, meleagrin, oxaline, roquefortine C

    P. crustosum: Penitrem A, roquefortine C, terrestric acid, viridicatins

    P. cyclopium: 3-methoxyviridicatins, penicillic acid, xanthomegnin, viomellein

    P. discolor: Chaetoglobosins, viridicatins

    P. echinulatum: Territrems, viridicatins

    P. expansum: Roquefortine C, chaetoglobosins, citrinin

    P. freii: Aurantiamine, xanthomegnin, viomellein, 3-methoxyviridicatins

    P. glandicola: Meleagrin, oxaline, penitrem A, roquefortine C

    P. griseofulvum: Cyclopiazonic acid, fulvic acids, griseofulvin, roquefortine C

    P. hirsutum: Compactins, roquefortine C, terrestric acid

    P. hordei: Roquefortine C, terrestric acid, (viridicatins)

    P. melanoconidium: Oxaline, penicillic acid, penitrem A, verrucosidin, (viomellein), (xanthomegnin)

    P. nalgiovense: (Chrysogine)

    P. nordicum: Ochratoxin A, verrucolone

    P. olsonii: Met. O

    P. palitans: Cyclopiazonic acid, (viridicatins), isofumigaclavine A,

    P. paneum: Roquefortine C

    P. polonicum: Penicillic acid, verrucosidin, 3-methoxyviridicatins

    P. roqueforti: (Mycophenolic acid), isofumigaclavin A, roquefortine C

    P. sclerotigenum: Griseofulvin, roquefortine C

    P. solitum: Compactins, viridicatins

    P. venetum: Roquefortine C, terrestric acid, viridicatins

    P. verrucosum: Ochratoxin A, citrinin, verrucolone

    P. viridicatum: Brevianamide A, viomellein, viridamine, xanthomegnin

    P. vulpinum: Meleagrin, oxaline, roquefortine C, viridicatins

    Herunder ser I TLC billeder af en række Penicillium svampe ved forskelligt UV lys og fremkaldt med forskellige reagenter. Se teksten under billedet for at se omtalte betingelser. Billederne er venligst udlånt af mykologi gruppen ved DTU Systembiologi.

null

Kristian Fog Nielsen er lektor ved DTU Systembiologi og arbejder med mikrobiologi og analytisk kemi. Kristian har assisteret ved udarbejdelsen af projektet Svampe laver din ost.

Kristian Fog Nielsen

null

Jens Christian Frisvad er professor ved DTU Systembiologi og arbejder med svampe og deres kemiske diversitet. Jens har assisteret ved udarbejdelsen af øvelsen til Svampe laver din ost.

Jens Christian Frisvad

null

Institut for Systembiologi har Danmarks største biovidenskabelige og bioteknologiske forskning på universitetsniveau.
Instituttet har været partner og sponsor på projektet.

Institut for Systembiologi