Western blotting
Western blotting kan bruges til at måle, om et bestemt protein er til stede.
Forudsætter: Gelelektroforese (af protein)
Western blotting bruges til at bestemme, om specifikke proteiner er til stede i en prøve. Metoden udnytter binding med bestemte antistoffer, der er lavet, så de netop genkender specifikke områder i proteinet og derfor binder sig. Efterfølgende tilsætning af nye antistoffer med et påkoblet signal kan afsløre binding af de første antistoffer og dermed det søgte protein.
Western blotting minder om ELISA pga. begge teknikkers måling af proteiner ud fra antistof-binding.
Sådan foretages Western blotting
Proteinerne, der skal undersøges, adskilles først i en gelelektroforese efter deres længde (SDS PAGE). Disse udspredte proteiner overføres nu til en membranplade, som kan fastholde proteinerne i deres position (figur 39).
Specifikke antistoffer påføres nu. Antistoffer har den egenskab, at de binder til det undersøgte protein. Membranen skylles bagefter, så ubundet antistof bliver vasket af. Nye antistoffer, der kan binde til de første antistoffer, påføres herefter. Disse er påkoblet et målbart signalstof, der fx er radioaktivt. Det betyder, at der efter skylning vil sidde radioaktive stoffer tilbage på pladen, der hvor det søgte protein eventuelt er til stede. Det kan dermed afsløres ved radiografi.
Antistoffer kan skabes, så de er specifikke overfor (binder til) lige præcis en særlig proteinstruktur. Strukturen kan fx findes på proteiner forbundet med sygdomme som fx leverbetændelsen hepatitis C.
Der bruges to forskellige antistoffer, så det første er et specifikt over for proteinet, der måles på. Det andet, signalkoblede antistof binder mere generelt til de brugte, specifikke antistoffer, og kan derfor bruges som antistof ved måling af forskellige proteiner.
Figur 39. Western blotting.
Western blotting minder om Southern blotting, hvor det er en specifik DNA-sekvens, der søges efter, i stedet for protein.
Navnet hentyder ikke til nogen geografisk ‘vestlig’ retning, men er et lille molekylærbiologisk ordspil, da ideen til teknikken kommer fra Southern blotting, opfundet af Edwin Southern. Der eksisterer i dag også Northern blotting, Southwestern blotting m.fl.
Eksempler på brug af teknikken
- I designet af en ny cellefabrik kan der være tvivl om det rigtige protein faktisk bliver dannet, hvilket Western blotting vil kunne hjælpe med at afklare.
- Den sjældne hjernesygdom kogalskab rammer også mennesker i form af Creutzfeldt-Jakobs. Sygdommen skyldes en særlig form for skadelige proteiner (prioner). Som diagnose af sygdommen kan Western blotting bruges.
