Udvikling af nye lægemidler

Introduktion

Brugen af medicin til behandling af sygdomme har været udbredt, næsten lige så længe som mennesket har eksisteret. Helt tilbage til 400 år f.Kr. benyttede den græske naturlæge Hippokrates ekstrakt udvundet fra piletræets bark til behandling af smerter. Det aktive stof i barken blev senere videreudviklet til acetylsalicylsyre, som er det aktive stof i bl.a. Ipren og Aspirin. Acetylsalicylsyre er i dag det mest anvendte smertestillende lægemiddel i verden.

Figur 1. Strukturformler for salicylsyre og det videreudviklede acetylsalicylsyre.

Et lægemiddel er et biologisk aktivt stof, som kan bruges til behandling af en sygdom eller bestemte symptomer. Lægemidler binder til biologiske targets i kroppen. Disse targets kan f.eks. kan være proteiner, sakkarider, nukleinsyrer eller lipider. Gode lægemidler virker specifikt og har derfor få bivirkninger. Lægemidler er som regel organiske molekyler, hvis strukturelle opbygning og sidegrupper har stor betydning for deres binding og effekt i kroppen.

At udvikle lægemidler er en stor udfordring, som ikke bliver lettere, når lægemidlet skal virke i hjernen. Hjernen er opbygget af komplekse neurale netværk, som benytter mange forskellige kemiske transmittersystemer, hvilket gør det kompliceret at forstå årsagen til sygdomme i hjernen. Hjernen er samtidige svær at ramme, da den besidder en naturlig, selektiv barriere, som bestemmer, hvad der kommer ind og ud. Der går ca. 10 til 15 år, fra man får ideen til et lægemiddel, og til det er færdigudviklet. At være drughunter er en udfordrende opgave, som kræver megen viden om lægemidler, og om hvordan de virker.

Når nye stoffer opdages

Tidligere i historien blev de fleste lægemiddelkandidater fundet tilfældigt. Et eksempel var, da Alexander Fleming i 1928 fandt ud af, at svampen Penicillium notatum producerede et stof, der effektivt slog bakterier i ihjel. Penicillin revolutionerede måden, hvorpå man behandlede infektioner. Udviklingen af penicillin er bare et af mange eksempler på, hvordan svampe, planter, bakterier og dyr danner biologisk aktive stoffer, der kan bruges som lægemidler. I dag benytter de fleste medicinalvirksomheder, som bl.a. Lundbeck, sig af samme metode, dog på lidt anderledes vis.

Figur 2. Alexander Fleming (1881-1955). Strukturformel for penicillin.

Nye lægemiddelkandidater findes i dag ved at bruge store robotter, som screener kemiske biblioteker efter ”trial and error”-princippet. Ved en screening undersøges stofferne i de kemiske biblioteker for deres medicinske effekt på forskellige cellekulturer. Bibliotekerne kan både være tilfældigt syntetiseret med kombinatorisk kemi, eller kan være stoffer oprenset fra naturen. Som beskrevet tidligere er naturen rig på stoffer med biologisk aktivitet. Ved at screene kan mange stoffer hurtigt undersøges for deres bindingsegenskaber til biologiske targets. Nye potentielle lægemidler med de ønskede farmakologiske virkninger identificeres som hits. En enkelt screening giver tit flere hits, men der er stadig et stykke vej til et endeligt lægemiddel.

I dag laves der ofte en tredimensionel model, af den receptor eller det enzym, man ønsker at ramme med et lægemiddel. Dette kunne f.eks. være NMDA-receptorerne i hjernen. Disse receptorer har central betydning, når man behandler Alzheimers sygdom (se fokusboks om NMDA- receptoren). Ved hjælp af røntgenstrukturanalyse og kemiprogrammer til tredimensionel analyse kan forskerne modellere organiske molekyler på baggrund af viden om targets tredimensionelle struktur. Modellen kan bruges til at afprøve lægemiddelkandidater på target. Disse undersøgelser omtales ofte som in silico tests.

Figur 3. 3D model af et enzym target. I firkanten ses et tværsnit af proteinlommen, hvor lægemidlet binder. Modellen kan bruges til at afprøve og designe nye lægemidler.

NMDA-receptoren

NMDA-receptoren har stor betydning for den excitatoriske neurotransmission i hjernen. Receptoren findes i nervesynapser, som sender signaler med glutamat. Receptoren aktiveres af både glutamat og aspartat. Asparatat virker dog ikke lige så kraftigt som glutmat. Glycinbinder også til receptoren og sikrer en optimal åbning af receptorens ionkanaler. Glutamat er det primære excitatoriske neurotransmitterstof, som bruges i alle områder af hjernen. I modsætning til glutamatreceptoren, AMPA, er NMDA-receptoren også permeabel for Ca²⁺ ioner (se figur 6). Ca²⁺ strømningen igennem NMDA-receptorens ionkanal gør den helt speciel, da Ca²⁺ kan igangsætte mange forskellige processer i cellen. Forskere mener bl.a., at indstrømningen af Ca²⁺ er skyld i de molekylære ændringer, der har betydning for lagringen af langtidshukommelsen.

Figur 4. Strukturformler for aminosyrerne glutamat, aspartat og glycin.

Når enten glutamat eller aspartat binder til NMDA-receptoren, vil ionkanalen åbnes, og Ca²⁺ og Na⁺ strømmer ind i cellen, mens K⁺ strømmer ud. Ionstrømmene fører til en depolarisering af cellens membran, som ved tilstrækkelig stimulering kan skabe en nerveimpuls i neuronet. NMDA-receptoren er et primært biologisk target for stoffet memantin, som bruges til behandling af Alzheimers sygdom.

Figur 5. Ved aktivering åbnes NMDA-receptorens ionkanal, hvorefter calciumioner og natriumioner strømmer ind i cellen, mens kaliumionerne strømmer ud. Ionstrømmen medfører en depolarisering af cellens membran.

Hvordan virker lægemidler?

De fleste lægemidler påvirker helt bestemte biokemiske processer, som har indflydelse, på hvordan kroppens celler virker. Ofte vil man designe lægemidler, så de binder til det biologiske target i sådan grad, at det har betydning for targets normale funktion. Stoffer, der binder til en receptor og aktiverer receptoren, kaldes agonister, mens stoffer, der hæmmer aktiveringen af receptoren, kaldesantagonister (se figur 6). De fleste lægemidler virker som enten agonister eller antagonister.

Figur 6.Til venstre ses virkningen af en agonist, og til højre ses virkningen af en antagonist.

Da lægemidler tit ligner kroppens egne signalstoffer, skal de ofte konkurrere med et eller flere af disse om at binde. Hvis target er et enzym, kan lægemidlet f.eks. binde til enzymets regulatoriske centereller enzymets aktive center. Hvis target er en receptor, vil lægemidlet typisk blokere de bestemte dele af receptoren, som binder signalmolekyler eller på anden måde har central betydning for receptorens funktion (se om NMDA- receptoren).

Figur 7. Enzym med aktivt og regulatorisk center.

Struktur, intermolekylære kræfter og inhibering af et biologisk target

Kendskabet til den rumlige opbygning og de kemiske egenskaber af proteinlommen på enten receptoren eller enzymet har stor betydning, når man skal udvikle et lægemiddel. Som eksempel kan lægemidlet ses som en nøgle, der skal passe i proteinlåsen for at lægemidlet virker (se figur 8).

Figur 8. Lægemiddel der vekselvirker med et aktivt center på et biologisk target.

Lægemidler binder som regel i en lomme på proteinets overflade. Bindingen kan både være covalent og ikke-covalent. Ved ikke-covalente bindinger binder lægemidlet gennem svage intermolekylære kræfter. Der findes fire typer intermolekylære kræfter, som normalt kan opstå mellem lægemiddel og target:

• Hydrogenbinding: Bindingen mellem et svagt elektropositivt hydrogenatom og et elektronegativt atom som oxygen (O), nitrogen (N) eller fluor (F). Bindingen kan f.eks. opstå mellem en NH-gruppe og en C=O-gruppe.
• Hydrofob vekselvirkning: Vekselvirkningen mellem upolære grupper. Mange proteiner er meget hydrofobe i deres aktive center. Lægemidlet vil derfor skulle være det samme.
• Saltbro: Den svage binding mellem to modsat ladede sidegrupper.
• Kompleksbinding: Bindingen mellem metalion og en sidegruppe med et ledigt elektronpar.

Figur 9. Her illustreres de fire forskellige former for intermolekylære kræfter.

Lægemidlets mange svage bindinger til target gør den samlede binding stærkere. Hvis target f.eks. er et enzym, findes der flere måder, hvorpå lægemidler kan hæmme de forskellige processer i cellen. Lægemidlet kan binde i det aktive center og forstyrre funktionen af enzymet ved at kæmpe om pladsen med substratet (kompetitiv inhibering). Lægemidlet kan også binde til den regulatoriske del af enzymet og inaktivere det helt (ikke-kompetitiv inhibering). Lægemidler virker på samme måde på receptorer.

Lægemidler kan enten være reversible inhibitorer (ibuprofen) eller ikke-reversible inhibitorer(acetylsalicylsyre). Ikke-reversible inhibitorer forårsager kemiske ændringer og ødelægger target ved at binde sig covalent til target. Reversible inhibitorer danner mange svage bindinger til target, men forårsager ingen kemisk ændring. Bindingen er derfor reversibel – heraf navnet. Reversible inhibitorer bruges ofte som lægemidler, da de i langt mindre grad giver bivirkninger.

Chirale lægemidler

Som tidligere omtalt, har lægemidlers rumlige opbygning stor betydning for deres effekt i kroppen. Det skyldes, at lægemidler er chirale. Chirale molekyler har samme funktionelle sidegrupper, men er spejlbilleder af hinanden, og kaldes spejlbilledisomere (se figur 10). Det bedste eksempel på spejlbilledisomere er vores hænder. Lige meget, hvordan man vender og drejer dem, vil de altid være spejlbilleder af hinanden.

Figur 10. Den rumlige opbygning af carbonmolekylets sidegrupper kan optræde i forskellige former. De to molekyler er spejlbilleder af hinanden og kaldes spejlbilledisomere.

Et chiralt molekyle kan indeholde et eller flere carbonmolekyler med bindinger til fire forskellige sidegrupper. Disse carbonmolekyler er stereocentre i molekylet. Hvis molekylet indeholder flere stereocentre, kan molekylet findes som flere stereoisomere. Stereoisomere kan enten være spejlbilleder af hinanden, hvilket kaldes enantiomere. Eller ikke spejlbilleder af hinanden, hvilket kaldes diastereomere (se figur 11).

Figur 11. På dette billede ses fire stereoisomerer af aminosyren threonin. Stereocentrerne er angivet med en rød stjerne.

De fleste stoffer, der oprenses fra naturen eller fremstilles kunstigt i et laboratorium, har stereocentre. Det har vist sig, at det tit kun er en stereoisomer, som har den ønskede medicinske effekt. To forskellige stereoisomerer kan pga. deres forskellige strukturer virke på to fuldstændigt urelaterede receptorer, som hver især igangsætter to vidt forskellige biologiske processer (se fokusboks om thalidomid-skandalen). Årsagen til dette er som omtalt orienteringen af de funktionelle sidegrupper (se figur 12).

Figur 12. Stoffet til venstre passer i receptoren, mens stoffet til højre ikke gør.

Betydningen af stereokemiske forhold i forbindelse med udviklingen af nye lægemidler har ført til, at der forskes meget inden for fremstillingen af den rigtige stereoisomer med den ønskede medicinske virkning. I 2001 gik Nobelprisen i kemi til William Knowles og Ryoji Noyori for deres arbejde med fremstilling af ste-reoselektive kemiske synteser. W. Knowles fremstillede katalysatoren RhDiAMP, som bruges til syntesen af den ønskede stereoisomer af lægemidlet DOPA, som bruges til behandling af Parkinsons sygdom.

Thalidomid-skandalen

Stoffet R-thalidomid lindrer morgenkvalme hos gravide kvinder, mens den anden stereoisomer forårsager alvorlige defekter på ufødte fostre.

Figur 13:Til venstre ses R-thalidomid, som er et sovemiddel, og til højre ses S-thalidomid, som er et teratogen.

I 1956 blev Thalidomid lanceret til behandling af morgenkvalme og søvnbesvær hos gravide kvinder. I star-ten af 1960’erne blev der indrapporteret en lang række svære fødselsdefekter hos nyfødte som bl.a. manglende arme og ben. Det førte til, at den tyske producent Grünenthal i 1961 måtte fjerne lægemidlet fra hylderne. Skandalen skabte røre over hele verden og i 1968 indførtes et rapporteringssystem for bivirkninger i Danmark.

Lægemidlerne skal ramme deres molekylære mål i hjernen

Ud over at skulle binde til et target i hjernen, skal lægemidlet også passere en lang række forhindringer i kroppen, før det når sit mål. Der stilles derfor store krav til stoffets biologiske og kemiske egenskaber. Inden for farmakologien hentydes der ofte til stoffets ADME-egenskaber. Et aktivt stofs ADME-egenskaber udtrykker, hvor godt stoffet absorberes, distribueres, omsættes og udskilles fra kroppen som de engelske navne også antyder (Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion; ADME).

Absorption

De fleste lægemidler indtages oralt i form af piller. Det er derfor vigtigt, at det aktive stof i lægemidlet kan klare de kemiske forhold undervejs til target (som eksempelvis den lave pH i mave-tarmsaften). Stoffet skal også kunne diffundere over barrieren i mave-tarmkanalen, så det kan optages til blodbanen. I nogle tilfælde er det dog ikke muligt, og det er derfor nødvendigt at indgive stoffet anderledes, f.eks. ved indsprøjtning eller inhalering.

Figur 15. Illustration af kroppens naturlige barrierer. På figuren ses både mave-tarm-barrieren og blod-hjerne-barrieren.

I 1997 publicerede Christopher A. Lipinski en række egenskaber, som gennem hans arbejde havde vist sige at være vigtige for den orale biotilgængelighed af et givent lægemiddel. Disse regler kaldes Lipinski’s Rule of Five, da reglerne indeholder mange femtaller. For at opnå bedst mulig optagelse af et givent stof, skal det have følgende egenskaber.

• Molarmasse skal være mindre end 500 g/mol.
• Stoffets lipofilicitetsfordelingskoefficent skal være mindre end 5. Log P < 5.
• Antallet af hydrogenbindingsdonorer skal være mindre end 5.
• Antallet af hydrogenbindingsacceptorer skal være mindre end 10.

Morfin er et eksempel på et stof, som opfylder alle Lipinskis regler, men har moderat biotilgængelighed. Reglerne er ingen garanti for, hvorvidt et stof kan være en god lægemiddelkandidat. Et stof der ikke opfylder alle reglerne, kan sagtens have en tilfredsstillende biotilgængelighed. F.eks. hvis stoffet er meget potent, og det kun kræves i meget små koncentrationer for at have sin medicinske effekt.

Figur 16. Strukturformel og kemiskeoplysninger for morfin.

Distribution

Stoffer, som optages gennem epitelcellerne i tarmen, bevæger sig hurtigt over i blodbanen. Det er dog ikke alle molekyler, som opløses i blodet. Hydrofobe molekyler opløses ikke, men transporteres af forskellige transportproteiner. Fra blodbanen distribueres stoffet til leveren via portvenen og lymfen og derfra ud til de forskellige væv og organer. Stoffet distribueres ligeledes med lymfevæsken. Et stof siges at være effektivt, hvis det rammer målorganet i tilstrækkelig koncentration. Visse dele af kroppen er dog særlig svære at nå. Dette er f.eks. tilfældet med centralnervesystemet (CNS). På trods af den gode blodgennemstrømning i hjernen er den svær at nå med aktive farmakologiske stoffer på grund af blod-hjerne-barrieren (BBB). BBB er opbygget af endotelceller, som er tæt sammensnørede af tightjunctions, der forhindrer stofpassage mellem cellerne. Herved opretholder BBB et konstant ekstracellulært miljø i hjernen. Lipofile substanser diffunderer over BBB forholdsvis uhindret, mens hydrofile molekyler skal transporteres af specielle transporterproteiner (carrierproteiner).

Figur 17.Strukturformlen af serotonin.

Neurotransmitteren serotonin har stor betydning for menneskers sindsstemning. Det har vist sig, at mange depressive har for lidt serotonin i hjernen. Serotonin er et eksempel på et stof, som ikke kan krydse BBB. Depression behandles derfor med alternative stoffer, som godt kan krydse BBB og dermed øge mængden af serotonin i hjernen. Disse stoffer kaldes SSRI-præparater.

Figur 18. Blod-hjerne-barrieren (BBB). Barrieren har forskellige ionkanaler og transportere, som kan transportere ami-nosyrer, glucose og ioner over barrieren. Mange andre stoffer udelukkes dog.

Stofomsætning (metabolisme) og udskillelse

De fleste stoffer nedbrydes i leveren af forskellige enzymsystemer. Det sker derfor med forskellige hastighed. Der findes stoffer, som i mindre grad end andre nedbrydes i leveren. Disse stoffer kaldes metabolisk stabile stoffer. Metabolismen af stoffer i leveren er en afgørende faktor, når nye lægemiddelkandidater skal udvælges, da nedbrydningshastigheden har stor betydning for stoffets effektivitet i kroppen. Stoffer, som omsættes for hurtigt i kroppen, egner sig ikke særlig godt som lægemidler, da de måske ikke når deres target i tilstrækkelig høj koncentration. Stoffer, der akkumulerer og ikke nedbrydes, kan være farlige for kroppen, hvilket understreger vigtigheden af stoffers nedbrydning til CO2 og vand.

Test af lægemidler

Når forskere har fundet en lægemiddelkandidat, udføres der en lang række tests in vitro. Disse tests er både biologiske (se fokusboks om HeLa kræftceller og kinesiske hamster-ovarieceller) og kemiske assays, hvor man forsøger, at besvare spørgsmål som: Hvordan trænger molekylet gennem de biologiske membraner og barrierer? Er stoffet stabilt ud fra et kemisk synspunkt? Hvor fedtopløseligt er stoffet? Er stoffet let at syntetisere? Rammer stoffet det ønskede target specifikt nok? Metaboliseres stoffet for hurtigt eller for langsomt? Er stoffet giftigt? De mange tests, der udføres på lægemiddelkandidaten, fører ofte til, at kemikerne er nødt til at modificere stoffet mange gange.

Assays på HeLa kræftceller og kinesiske hamster-ovarieceller

HeLa kræftcellerne, som i dag bruges i en lang række biomedicinske sammenhænge stammer oprindeligt fra den 31-årige Henrietta Lacks, som i 1951 blev indlagt på Johns Hopkins Hospital med en cancer tumor. På trods af at hun døde få måneder efter, lever hendes tumor celler stadig i dag, hvor de bruges i mange forskellige biologiske assays. HeLa kræftceller omtales tit som udødelige, da de kan dele sig uendeligt mange gange.

Figur 19. HeLa kræftceller farvet med det fluorescerende stof Hoechst 33258. Cellerne har været dyrket i laboratorier siden 1951. Cellerne har hjulpet til at forstå mange mekanismer som bl.a. reproduktion i humane celler.

På Lundbeck bruger man både HeLa kræftceller og kinesiske hamster-ovarieceller i forskningen. Cellerne gensplejses med moderne bioteknologi, hvor forskerne indsætter DNA, som koder for helt bestemte biologiske targets. Både kinesiske hamster-ovarieceller og HeLa kræftceller egner sig specielt godt til denne form for assays, da de deler sig hyppigt og er lette at gensplejse. I nogle assays bruger forskerne også rekombinant HIV virus til at integrere udvalgte gensekvenser i cellekulturerne.

Prækliniske tests – Dyreforsøg og toksikologiske tests

Efter en lang række in silico og in vitro tests er det tid til, at teste lægemiddelkandidaterne på levende organismer in vivo. Inden lægemidlet gives til mennesker, gennemtestes kandidatens effektivitet og toksikologi på forsøgsdyr. Der bruges mange forskellige slags forsøgsdyr, dog oftest mus og rotter. I Danmark kræver det godkendelse for at arbejde med forsøgsdyr. De enkelte forsøg skal også godkendes af Dyreforsøgstilsynet, som hører under Justitsministeriet.

En af metoderne, der kan bruges til at undersøge et lægemiddels indvirkning på hukommelse og indlæring, er forsøg i Morris water maze (Morris vandlabyrint). Morris water maze ville kunne være relevant til test af lægemidler mod sygdomme som f.eks. Alzheimers sygdom og skizofreni, hvor der ses tab af hukommelse og indlæringsevne. I forsøget sættes en rotte i en stor vandtank fyldt med mælket vand. Under overfladen i den ene del af karret er der en lille platform, som giver rotten mulighed for at undgå at svømme. En normal rotte vil svømme rundt, indtil den finder platformen. Anden gang rotten bliver placeret i bassinet, vil den svømme direkte hen til platformen.

Figur 20. PCP blokerer ionkanalen i NMDA-receptoren.

Figur 21. Morris vandlabyrint. En normal rotte vil hurtigt lære, hvor platformen befinder sig i tanken, og derfor vil den have let ved at finde den anden gang, forsøget udføres. Den PCP-påvirkede rotte vil bliver ved med at have problemer med at finde platformen, også anden, tredje og fjerde gang forsøget udføres. Dette skyldes PCPs påvirkning af rottes indlæring. (Kør musen henover billedet og se forskellen på de to rotters adfærd).

Tests i mennesker og der fire kliniske faser

Når nye lægemidler udvikles, skal de naturligvis også testes i mennesker. I Danmark kræver myndighederne, at nye lægemiddelkandidater først er gennemtestet for toksikologi og bivirkninger i forsøgsdyr. Herefter kan lægemiddelkandidater blive godkendt af Lægemiddelstyrelsen og Den Centrale Videnskabsetiske Komité til at gå over i de fire kliniske faser. De kliniske faser er langt den dyreste del i udviklingen af nye lægemidler. Ud af måske 5.000-10.000 stoffer er der kun fem, som går videre til de kliniske faser, og heraf er der kun et stof, som bliver et lægemiddel.

• Fase 1 (Sikkerhed): I første fase gives lægemidlet til en lille gruppe af raske frivillige (10 til 100 perso-ner), og der igangsættes en undersøgelse af, hvordan den menneskelige organisme optager og reagerer på stoffet. I løbet af forsøget modtager forsøgspersonerne flere forskellige doser af stoffet. Dog meget mindre doser end en normal dosis, idet der holdes skarpt øje med tegn på forgiftning. I denne fase fokuseres der primært på, om lægemidlet har en giftig virkning i mennesket. Effektiviteten af stoffet evalueres ikke nødvendigvis.
• Fase 2 (Sikkerhed, effektivitet, dosering): I anden fase gives lægemidlet til en lidt større gruppe af frivillige (50 til 300 personer), som vil kunne have gavn af lægemidlet. Gennem denne fase undersøges forskellige doser for deres effektivitet og bivirkninger. Som regel udføres der sideløbende kontrolforsøg, hvor kontrolgruppen modtager placebo i stedet for det rigtige lægemiddel. Hverken forskere eller forsøgspersoner ved, hvilke grupper som får hvad. Til sidst i forsøget sammenlignes doser og bivirkninger fra de to grupper, og de bedste doser bestemmes.
• Fase 3 (Sikkerhed, effektivitet, bivirkninger): I tredje og sidste fase udføres forsøg i stort omfang med mange frivillige (1500-4000 personer), som vil kunne have gavn af lægemidlet. Lægemidlet gives i de doser, som man tidligere har fundet passende. I løbet af forsøget går forsøgspersonerne løbende til kontrol hos deres egen læge, hvor de rapporterer om bivirkninger. Denne undersøgelse giver mulighed for at se, om lægemidlet giver sjældne bivirkninger, dvs. bivirkninger hos nogle få af forsøgspersonerne.
• Fase 4: I denne fase er lægemidlet blevet godkendt af myndighederne og vil nu kunne bruges til be-handling af sygdommen. I denne fase laves der tit forsøg, hvor lægemidlet sammenlignes med allerede eksisterende behandlinger.

Figur 22. Oversigt over faserne i lægemiddeltest.

De meget omfattende undersøgelser, som skal udføres gennem de kliniske faser, gør det meget kostbart at udvikle lægemidler. Udviklingen af et nyt lægemiddel er estimeret til at koste omkring 800 mio. dollars. Selv om et lægemiddel kommer på gaden, kan det stadig blive taget af hylderne, hvis det ikke fungerer efter hensigten. Ligesom det var tilfældet med thalidomid.