Illumina sekventering

DNA-sekventering vil sige at aflæse rækkefølgen af nukleotiderne (A, T, C og G) i et stykke DNA.

DNA-sekventering er kortlægningen af den nøjagtige DNA-sekvens, altså rækkefølgen af nukleotiderne A, T, C og G.

Siden forskere i halvfemserne gik i gang med den enorme opgave at sekventere al DNA på et menneskes kromosomer (det humane genom), er teknikken udviklet kraftigt, så prisen og tiden er markant mindsket. Derfor kan et menneskes 3 mia. nukleotider DNA i dag sekventeres på uger modsat de over 10 år, som det første humane genom tog! DNA-sekventering kan også bruges fx til at kontrollere en DNA-sekvens, forskere selv har sat sammen i laboratoriet.

Ud over det humane genom er en lang række organismers genomer i dag sekventeret, og de store længder DNA-sekvens er tilgængelige på særlige websites. Eksperter forventer, at prisen inden for 10 år vil falde nok til, at vi alle får råd til at kende vores personlige genom og dermed tilbøjeligheden til visse sygdomme m.m.

Der sker i øjeblikket en kraftig udvikling i nye teknologier til DNA-sekventering for at imødekomme behovet for hurtig og præcis sekventering af de store længder DNA i et genom. En ny teknologisk generation er derfor i færd med at afløse de tidligere metoder, som fx Sanger-metoden (med dideoxy-nukleotider), der er for dyr og langsom til store længder DNA.

Her beskrives én af de førende, næste generations-metoder:
Illumina-metoden

Forberedelse af skabelon til sekventeringen

DNA’et, der skal sekventeres, skæres først i kortere længder, som skilles fra hinanden og bliver sekventeret hver for sig. De skal først kopieres op i antal, så de senere kan give et tydeligt signal i sekventeringen. Denne forstærkning af DNA’et minder om en slags PCR og sørger for, at de kopierede sekvenser er fæstnet til bunden ved siden af hinanden i ens grupper. De er nu klar til at blive aflæst i selve sekventeringen (se øverst i figur 21).

 

Sekventering

Sekventeringen er en utrolig blanding af kemi og biologi, hvor specialdesignede nukleotider og det DNA-replicerende enzym DNA-polymerase indgår i en særlig reaktion. I denne sekventeringsteknik bruges cyklisk reversibel terminering (CRT).

Overordnet går CRT-metoden ud på, at DNA-polymerase sættes til at replicere (kopiere) det bundfæstnede, enkeltstrengede DNA, der er forberedt til sekventeringen. Men i stedet for at bygge en ny kopi af DNA-strengen med de naturlige nukleotider, er der tilsat nogle kemisk forandrede udgaver af nukleotiderne (figur 22), som gør det muligt at aflæse hvilke nukleotider, der indsættes i kopien.

Figur 21. DNA-sekventeringen foregår ved en særlig kopiering af DNA’et, hvor de brugte byggesten (nukleotiderne) bærer en fluorescerende gruppe. I aflæsningsresultatet er hver farveplet et område, hvor en gruppe af ens DNA-strenge sekventeres. Der nås til den næste nukleotid i sekvensen for hvert billede, og ved brug af farvekoderne, kan sekvenserne derfor afkodes.

Når enzymet DNA-polymerase i en celle replicerer en DNA-streng, aflæser den sekvensen og indsætter det komplementære nukleotid overfor i den nye streng. Dette princip bruges også her, men ved CRT-sekventering, indeholder nukleotiderne også en blokerende kemisk gruppe, samt en fluorescerende gruppe (figur 22), der både giver et farvet, fluorescerende signal og blokerer DNA-polymerasen i at fortsætte til næste nukleotid. Dette stopper DNA-polymerase i dens fremfærd og betyder, at den kun kan sætte ét nukleotid på.Hver af nukleotiderne har sin fluorescerende farve, og derfor kan en laser-læser afkode præcis, hvilket nukleotid, der nu er sat på DNA-strengene i hver af grupperne, som er fæstnet på bunden (nederst figur 21).
Det specielle nukleotids blokerende og fluorescerende grupper, kan nu kløves af, og DNA-polymerase kan dermed fortsætte videre til næste nukleotid – deraf navnet cyklisk reversibel terminering. Hele denne proces sker i en næsten svimlende hastighed, der svarer til at ca. 50 nukleotider afkodes i sekundet (2010). Som nævnt sekventerer man DNA’et i mindre fragmenter ad gangen. Disse DNA-fragmenter sættes bagefter sammen til fulde sekvenser ved at sammenligne overlappende sekvenser i fragmenterne med computerprogrammer.

Flere andre teknologier til DNA-sekventering, der bygger på andre principper, er også i udvikling i den skarpe konkurrence om høj hastighed og lav pris. Interessen i at kortlægge DNA forventes nemlig kun at stige.

Figur 22. Eksempel på et af de særlige nukleotider, der bruges til at kopiere en DNA-streng under sekventeringen. De fire forskellige baser har hver deres fluorescerende farve, så en laser kan aflæse hvilket nukleotid, der er sat på. Hvis der fx sættes et C (cytosin) på, må der således sidde et G (guanin) dette sted i den sekventerede streng. Når farven er aflæst, skæres de to grupper af, så den næste komplementære nukleotid kan påsættes og dermed aflæses

Eksempler på brug af DNA-sekventering:

Genom-kortlægning

DNA-sekventering bruges til at kortlægge samtlige gener (genomet) i efterhånden rigtig mange organismer. Det første humane genom blev offentliggjort i 2003 og var 13 år undervejs! I mellemtiden er teknologien blevet så hurtig og relativ billig, at fx heavy metal-ikonet Ozzy Osbourne i 2010 fik sit genom fuldt sekventeret, og det hele tog under fire måneder. Andre stjerner har også fået deres fulde genom sekventeret, og eksperterne spår, at fremtiden kun vil gøre kortlægning af vores genomer mere udbredt.

Se en oversigt her fra det amerikanske National Center for Biotechnology Information over det voksende antal sekventerede genomer fra forskellige organismer.

Gentest for sygdomme:
En fuld genom-sekventering er stadig dyr, så i stedet tilbyder firmaer fra bl.a. USA og Island at sekventere særlige gener ud fra en indsendt spytprøve. Resultatet kaldes en gentest og kan vurdere sandsynligheden for at udvikle visse sygdomme m.m. Gyldigheden af disse gentests diskuteres dog stadig, da flere eksperter ikke mener, det er muligt at udregne disse sandsynligheder særlig troværdigt i øjeblikket.

Arbejdsspørgsmål:

  1. Hvad vil det sige at sekventere DNA?
  2. Hvilke fordele kan det have at kende DNA-sekvensen i fx et menneske?
  3. Hvad gør DNA-polymerase normalt i en celle, og hvad er forskellen, når enzymet bruges i sekventering?
  4. Hvad er grunden til, at der kommer et farvet signal, hver gang et af nukleotiderne i en DNA-sekvens aflæses?