• Immunforsvaret og biologisk krigsførelse

    Symphogen A/S og Institut for Systembiologi byder Jer velkommen til dette undervisningsmateriale. Formålet er først og fremmest at formidle den del af naturvidenskaben vi synes er mest spændende, nemlig bioteknologien. Men det er samtidigt også vigtigt for os at vise, at det at læse ingeniør ligeså godt kan dreje sig om medicin, bakterier, øl osv. som det kan dreje sig om stærkstrøm og computerprogrammer. Vi tror på, at undervisningen bliver langt mere spændende, når naturvidenskaben bliver pakket ind i den nyeste teknologi, og vi håber at I er enige efter at have læst dette materiale!

    • Velkommen

    • Teori

      • Immunforsvaret

      • Immunisering
      • Bakterier og virus

      • Syntetiske antistoffer
      • Antistoffer som lægemidler
      • Immunkemiske metoder

      • Variation af antistoffer
    • Øvelsen

    • Artikler

      • Ingeniøren

      • Andre

    For at navigere i projektet bruges menuen ude til venstre.

    God fornøjelse med projektet!

  • Velkommen

    Velkommen til en verden af immunologi!

    Ordet ”immunologi” kommer af det latinske ord ”immunis”, som betyder ”fri for”- en meget logisk anvendelse af ordet, idet immunforsvaret netop beskytter os imod en lang række angreb fra fremmede organismer. Disse angreb kaldes infektioner. Immunsystemet har været kendt i mange år – det første skriftlige bevis på dette kan dateres tilbage til 430 f.Kr. Her vidste man, at folk der tidligere havde været smittet med pest kunne pleje pestramte patienter uden selv at blive syge. Det er dog først i vores tidsalder, at man begyndte at udvikle immunologi fra mundtlige overleveringer til en egentlig videnskab. Denne videnskab spænder over en lang række områder som infektionsbiologi, epidemier, sygdomme som følge af et manglende eller overaktivt immunforsvar samt diagnostik. Der indgår således en høj grad af tværfaglighed i emnet.

    Den klassiske anvendelse af immunforsvaret har tidligere været at vaccinere for at forebygge sygdomme som følge af en virus- eller bakterieinfektion. Der har igennem verdenshistorien været adskillige epidemier som pest, kopper, kolera og flere forskellige influenza-typer, hvor store dele af befolkningerne blev udryddet. Det er sygdommene “Ebola” og ”kopper” et eksempel på. Den skyldes en virusinfektion og har gennem historien kostet utallige menneskeliv men blev, som følge af et vaccinationsprogram for alle småbørn, erklæret for udryddet i 1980 af WHO. Den sygdomsfremkaldende virus findes nu officielt kun opbevaret i små mængder på to lagre i verden, et i USA og et i Rusland, til brug for eventuelle fremtidige videnskabelige formål.

    En række genetiske sygdomme, hvor dele af immunforsvaret ikke fungerer, ikke eksisterer eller angriber harmløse celler – selv vores egne – kan give anledning til sygdom. Der eksisterer en meget fin balance under dannelsen af immunforsvarets celler, hvor cellerne ”lærer”, hvilke celler der er fremmede og skal udryddes, og hvilke der ikke er fremmede og altså ikke skal angribes. Immunforsvaret har med andre ord en indbygget tolerance over for kroppens egne celler. Går selv en lille ting galt i denne proces, risikerer man, at eksempelvis organer bliver angrebet og tilintetgjort af immunforsvaret. Dette kaldes autoimmunitet, og ses ved Multipel sclerose, diabetes, leddegigt og mange andre sygdomme. Ligeledes er mange allergier en unødvendig overreaktion af immunforsvaret på ellers harmløse komponenter som pollen.

    Rent videnskabeligt har immunologiens historie skabt grobund for en fantastisk bioteknologisk udvikling. Immunologien er bl.a. blevet et vigtigt redskab til diagnosticeringen af en lang række sygdomme. Når du tager til lægen med ondt i halsen, er det en immunreaktion, der anvendes til hurtigt at give svar på, om der er tale om en bakterie- eller virusinfektion. Immunologien anvendes også til at diagnosticere mere alvorlige sygdomme som kræft, leverbetændelse (hepatitis) og HIV. Også inden for kræftforskningen har immunologi også de seneste år vist sig at give nye muligheder for behandling. Det skyldes fx at immunsystemets komponenter kan bruges som effektive transportører af cellegifte, og der bliver hele tiden nye cancervacciner tilgængelige.

    Fremstilling af biologiske våben er også en konsekvens af  fremskridt inden for immunologien. Biologisk krigsførelse har fundet sted i årtusinder. Allerede i antikken havde man kendskab til bevidst forurening af mad og drikkevand. I middelalderen under pestepidemierne kastede russiske soldater afhuggede legemsdele fra døde pestramte soldater ind til fjenden. Under den europæiske ekspansion til det amerikanske kontinent blev store dele af de indfødte befolkninger udryddede bl.a. i det nuværende USA, hvor indianerne menes at have modtaget tæpper befængt med koppevirus.

    Under den kolde krig blev der forsket intensivt i biologisk krigsførelse. Nogle mener, at bl.a. USA har investeret mange penge i at udvikle biologiske våben. I nyere tid er et af de mest kendte eksempler på biologisk terror fra 2001, hvor flere medlemmer af den amerikanske kongres og nogle medieselskaber modtog breve indeholdende meget resistente former af bakterien Bacillus anthracis, som forårsager miltbrand.

    Som præsenteret ovenfor indeholder immunologien en masse spændende aspekter. Immunforsvaret er en meget vigtig del af vores hverdag. Uden dette ville vi formentligt hurtigt bukke under for diverse sygdomme.

    I dette undervisningsmateriale kan du finde mere information om immunologien og om biologisk krigsførelse. Ligeledes vil områder som mikrobiologi og genetik blive berørt, men fælles for det hele er, at det vil omhandle flere af de teknologier, som den danske virksomhed Symphogen A/S har udviklet.

    Efter at have læst vores spændende teoriartikler om de forskellige sider af immunologien, har du mulighed for at løse en række opgaver og lave praktisk arbejde i laboratoriet sammen med din lærer. Hvis du skulle få lyst til at vide mere om dette område, er der også nogle forslag til yderligere læsning.

  • Teori

    Introduktion til teori

    I de seks artikler i venstre side finder du baggrundsmaterialer inden for emnet immunologi. Der er taget udgangspunkt i virksomheden Symphogen A/S’s teknologi og herfra draget paralleller til biologisk krigsførelse. Derfor finder du også her teori omkring mikroorganismer (bakterier og virus).

    I hver artikel er der links til sider, hvor du kan finde live-animationer og spændende figurer samt yderligere information. Der er også givet forslag til yderligere læsning på nettet med links til forskellige sider.

    Rigtig god fornøjelse med den teoretiske del af materialet!

    Immunforsvaret er den del af vores krop, som hjælper os med at bekæmpe infektioner forårsaget af bakterier og virus. Det består af to komponenter, der begge har mange navne: (1) det medfødte eller uspecifikke immunforsvar og (2) det adaptive, erhvervede eller specifikke immunforsvar.

     

    Det medfødte immunforsvar

    Det medfødte, eller uspecifikke, immunforsvar virker mod næsten alt, som er fremmed for vores krop, og det skelner ikke mellem forskellige sygdomsfremkaldende organismer. Det består af visse celletyper samt fysiske barrierer som hud og hår. Derudover er muligheden for at ændre kropstemperaturen, som man kender det fra feber, en del af det uspecifikke immunforsvar. Den højere kropstemperatur gør det sværere for bakterier og virus at overleve. Samtidigt udskiller kroppen konstant en række kemiske stoffer som dræber bakterier, fx i spyt og tårer.

    Man tænker måske ikke så meget over det i hverdagen, men i tilfælde hvor man eksempelvis får en splint i fingeren, opstår der en række fysiske tegn, som viser, at ens immunforsvar er på stedet og arbejder hårdt, uden man selv behøver at gøre noget. Når området omkring splinten hæver, samt bliver rødt og varmt, er det fordi der sker en øget blodtilstrømning til stedet og derved bliver celler fra blodet transporteret hen til splinten. Her kan cellerne dræbe invaderende bakterier ved fagocytose.

    Figur 1. Fagocytose og drab af bakterier fra en splint. Man ser, at den blå fagocyterende celle træder ud af blodkarret og begynder at fagocytere det fremmede materiale (rødt), der er trængt ind med splinten.

    Disse begivenheder kaldes samlet for et inflammatorisk respons. De immunologiske celler, der først møder de invaderende organismer, er makrofagerne. Mange af de reaktioner man ser såsom hævelse og rødmen samt feber og andet, er altså ikke ”farligt”, men er ganske naturlige tegn på, at vores immunforsvar er aktivt og virker, som det skal.

    Det erhvervede immunforsvar

    Det erhvervede immunforsvar kaldes også det adaptive immunforsvar, da det er den del af immunforsvaret tilpasser sig de omgivelser man befinder sig i. Det kan reagere mod fremmede organismer, typisk bakterier og vira, når de kommer ind i kroppen. Det er også den del af immunforsvaret, som husker, hvordan fremmede organismer ser ud, når de først er mødt en gang. Når en fremmed organisme først er mødt, så vil det adaptive immunforsvar kunne udføre et mere effektiv respons, hvis organismerne skulle komme ind i kroppen igen. Denne del af immunforsvaret består blandt andet af en slags huskeceller, der bærer på information om de forskellige bakterier og vira, som kroppen har mødt. Møder huskeceller de igen de samme organismer, så aktiveres de hurtigt, og immunforsvaret bliver straks sat i gang. Immunsystemet tilpasser sig (adapterer) således til de bakterier og vira, der findes i omgivelserne.

    Det adaptive immunforsvar er forskelligt fra person til person og afhænger af, hvilke organismer kroppen har mødt. Immunforsvarets celler bruger specifikke overfladeområder på de fremmede organismer til at genkende dem. Det kan fx være proteiner eller kulhydrater, der sidder på deres membran. Disse overflademolekyler kaldes også antigener, og den adaptive del af immunforsvarets sammensætning afhænger altså af, hvilke antigener immunforsvaret har mødt. Navnet antigen kan være en smule forvirrende, idet det ikke dækker over gener, som navnet ellers antyder.

    Det adaptive immunsystem består af lymfocytter. Det er en undertype af kroppens hvide blodlegemer. De hjælpes derudover af såkaldte ”antigen præsenterende celler”, som er de celler, der kan aktivere lymfocytterne ved at præsentere dem for et ”antigen” (fx resterne af en nedbrudt bakterie). Makrofager er et eksempel på en antigen præsenterende celle, og disse således aktive i både det medfødte og det adaptive immunsystem. Lymfocytter cirkulerer i blodet og bliver, som alle andre af blodets celler. dannet ved hæmatopoiese i knoglemarven. Lymfocytterne opdeles i B- og T-celler, og det er disse celler, der varetager det adaptive immunforsvars funktioner. Det foregår via antistoffer (B-celler) og det cytologiske immunforsvar (T-celler).

    Figur 2. Figuren viser, hvordan antigener bliver præsenteret på MHC-I-molekylerne (øverst) og på MHC-II-molekylerne. MHC-I præsenterer antigener, der findes inde i (endogent) cellens cytoplasma (fx fra en virus), mens MHC-II præsenterer antigener, som er indtaget (exogent) fra omgivelserne (fx ved fagocytose af et protein).

    Lymfocytter og MHC-molekylerne

    T-cellerne er inddelt i T-hjælperceller (TH-celler) og cytotoksiske T-celler (TC-celler). T-cellerne har på deres overflade en T-cellereceptor (TCR), der bruges til at genkende antigener. Antigenerne bliver kun genkendt, hvis de er bundet til et Major Histocompability Complex (MHC). MHC-molekyler findes i alle celler.

    MHC-molekyler findes i to former: MHC-I, der findes på alle vores celler, og MHC-II, der kun findes på de såkaldte ”professionelle antigen præsenterende” celler (og som har fået deres navn pga. MHC-II-molekylet). Man siger, at disse MHC-molekyler præsenterer antigenerne ved at binde til dem og transportere dem til cellemembranen. Det foregår på to forskellige måder, alt efter om det er MHC-I eller MHC-II som illustreret i figur 2.

    For MHC-I-molekylerne gælder det, at de antigener, der præsenteres, er dannet inde i cellen fx som følge af en virusinfektion, men også andre celler, som en kræftcelle kan præsentere antigener i MHC-I-molekyler og derved signalere til immunforsvaret, at cellen bør destrueres.

    MHC-I og et bundet antigen (MHC-I-kompleks) genkendes hovedsageligt af TC-cellernes TCR, og dette fører til en aktivering af cellerne. TC-cellerne indeholder en masse granula (små sække i deres cytoplasma). Disse granula indeholder giftige substanser, som frigives ved TC-cellens aktivering, og som ødelægger den aktiverende celle vha. MHC-I-receptoren. På den måde fjernes de celler, der fx er virusinficerede eller har muterede proteiner. Se Figur 3.

    Læs mere om dette på nettet og se en kort video om dette her.

    For MHC-II-molekylerne gælder det, at de præsenterer (eller har bundet) antigener, som er trængt ind i cellen ved fagocytose af eksempelvis makrofager. Inde i cellen bliver antigenerne nedbrudt til mindre dele, som binder til MHC-II-molekylerne og derved transporteres til cellemembranen.

    MHC-II-molekylerne på cellemembranen vil hovedsageligt binde til TH-celler. Det medfører, ligesom for TC-cellerne, at TH-cellerne aktiveres. TH-cellerne har fået deres navn, fordi de virker som hjælperceller. De udskiller specielle stoffer, cytokiner, som er med til at stimulere hele immunforsvaret, herunder B-cellerne. B-celler producerer en tidlig form for antistoffer der er bundet til B-cellens membran. Det tidlige antistof kan genkende et specifikt antigen på en bakterie og virus. Før B-celler producerer rigtigeantistoffer, der ikke er membranbundne, kræves det, at de membranbundne antistoffer genkender et antigen – dvs. at cellen fx møder en bakterie.

    Du kan se en kort video om aktiveringen af B- og T-cellerne her.

    Figur 3. Figuren viser, hvordan en Cytotoksisk T-celle (CTL-celle) dræber inficerede celler. Hvis en celle har atypiske proteiner bundet på sine MHC-I-molekyler, vil proteinerne blive genkendt som fremmede af T-cellen, som herefter stimulerer cellen til at dø ved at frigive giftige molekyler.

    Antigener og antistoffer

    Antistoffer er vigtige immunologiske molekyler, der indgår i bekæmpelsen af infektioner. Det område, der genkendes af antistoffet, er dog kun en lille del af det samlede antigen og kaldes for epitopen. Det er altså ikke hele molekylet, der genkendes. Dette er illustreret i figur 5, som vha. computeranimationer viser epitopen på et større molekyle hos tuberkulosebakterien.

    Figur 5. Billedet viser et stort, foldet protein, hvor en lille del af det (den blå proteinstruktur) fungerer som epitop for et antistof.

    Figur 4. Figuren viser, hvordan TH-cellerne aktiveres af en antigen præsenterende celle, der har bundet et antigen på sin MHC-II. Den aktiverede T-celle stimulerer B-celler, som også har optaget antigen og præsenterer det på deres MHC-II-molekyler. B-cellen aktiveres dermed og danner antistoffer og hukommelsesceller.

    Antistofferne (også kaldt immunglobuliner eller Ig), som binder til antigenernes epitoper, består af to par helt ens proteinkæder bundet sammen af svovlbroer.

    Alle antistoffer har en karakteristisk Y-formet struktur og består af to identiske lette kæder og to identiske tunge kæder. Hver af de fire kæder består af en variabel del, som er den del, hvortil antigenerne bindes, og en konstant del, som bestemmer hvilken af de fem antistofklasser, M, D, G, E eller A (IgM, IgD, IgG, IgE, IgA), som antistoffet tilhører. Hver af disse klasser findes i forskellige mængder i blodet, men har også forskellige funktioner og produceres på forskellige stadier af et immunrespons. IgM er det første antistof, der produceres som svar på fremmede antigener, mens IgG findes i de højeste koncentrationer i blodet. Du kan finde uddybende info om dette emne under afsnittet Variation af antistoffer.

    Figur 6. Skitse af et antistof. De lette kæder er farvet rød og de tunge kæder blå.

    Den øverste del af antistoffernes tunge og lette kæder kaldes Fab-delen, og det er hertil, at antigenernes epitop bindes. Den nederste del af de tunge kæder kaldes for Fc-delen, og denne del binder til særlige Fc-receptorer på nogle af immunforsvarets celler. Det kunne fx være makrofager, der ved stimulation af deres Fc-receptorer vil fagocytere en bakterie. På den måde bliver Fab-delens genkendelse af antigenet knyttet til en Fc-receptor, som kroppens celler kan genkende og reagere på.

    Antistofferne og antigenerne danner ikke-kovalente bindinger, men da disse er relativt svage, skal der en masse til for at give effektiv binding. Styrken af en binding benævnes affiniteten og er, sammen med specificiteten af antistofferne over for antigenerne, meget anvendt til at beskrive interaktionen.

     

    Videre læsning

    • Janeway C.A. Jr. et al (2001). Immunobiology., 5th ed., Garland Science

    Når man kan blive vaccineret og dermed beskyttet imod sygdomme, skyldes det immunforsvaret. Selve processen der sker i kroppen kaldes immunisering. Man lærer med andre ord kroppen, hvad den skal reagere imod og hjælper dermed immunsystemets tilpasning på vej. Immunforsvaret kan imidlertid også blive for aktivt. Det kan føre til en række sygdomme, hvor kroppen i virkeligheden angriber sig selv. Dette fænomen kaldes autoimmunitet.

    Immunisering og vaccinationer

    Immunisering er en overordnet betegnelse for processen at blive immun over for noget. Man kan blive immun efter man har haft en bestemt infektion, eller man kan blive immun ved at møde bestemte antigener fælles for den pågældende infektion, som det sker ved i vaccination. Der findes to måder, hvorpå man kan blive immuniseret: passivt og aktivt.

    Passiv immunisering foregår ved direkte overførsel af antistoffer til blodbanen. Det ses eksempelvis hos gravide, hvor antistoffer fra moderens blod overføres til fosteret via moderkagen. Serum fra immune eller nyligt vaccinerede individer, indeholder mange forskellige antistoffer, som kan oprenses/isoleres og anvendes til behandling af patienter med eksempelvis stivkrampe, difteritis og mæslinger. Det passive ligger i at immunsystemet ikke aktiveres, og virkningen er derfor begrænset til nogle uger eller måneder alt afhængigt af, hvor længe antistofferne overlever i kroppen. I serum-afledte produkter er det desuden kun en lille procentdel af de antistoffer, der overføres, som er specifikke mod det ønskede antigen. Det kan udbedres ved kunstigt at fremstille antistoffer som beskrevet i afsnittet om syntetiske antistoffer.

    Derimod er aktiv immunisering langvarig, idet der ud over et immunrespons, kan dannes nogle bestemte celler kaldt hukommelsesceller. Aktiv immunisering vil sige, at immunsystemet selv aktiveres og danner et immunrespons. Det kan ske ved kontakt med antigen fra en bakterie eller virus. Ud over at immunresponset nedkæmper infektionen, der kaldes det primære respons, danner det også hukommelsesceller. Fordelen ved disse hukommelsesceller er, at de ved gentagen kontakt med bakterien eller virussen lynhurtigt kan danne et nyt immunrespons, der nu bliver benævnt et sekundært respons. Det foregår ved at hukommelsesceller, fx hukommelses-B-celler, ved kontakt til antigen meget hurtigt omdanner sig til antistof-producerende plasmaceller.

    Opbygningen af det primære respons varer ofte omkring en uge. Det forklarer længden og forløbet af fx en influenzainfektion. Det sekundære respons er derimod så hurtigt og effektivt, at man ofte slet ikke bemærker, at man har været i kontakt med en bakterie eller virus. Denne forskel er illustreret i figur 1.

    Figur 1. Figuren viser, hvordan det primære og sekundære møde med et antigen varierer. Det sekundære vil resultere i et hurtigere og langt kraftigere immunrespons, da aktiveringen af immunsystemet er nemmere.

    Viden om immuniseringsprocessen udnyttes ved vaccinationer. Her provokerer man et kunstigt primærrespons ved at indsprøjte fx harmløse dele af en bakterie eller virus. Immunsystemet møder de indsprøjtede antigener, og starter et immunrespons imod dem. Hvis man siden kommer i kontakt med den rigtige bakterie eller virus, vil de samme antigener stimulere immunsystemet til at reagere hurtigt og effektivt som i et sekundært respons.

    Når man laver vacciner, må man sikre sig, at det, man sprøjter ind, er uskadelige stoffer. Det kan man gøre på mange måder. Et eksempel er den attentuerede organisme, der ikke kan vokse i mennesker, men stadig har mange overflademolekyler (=antigener) til fælles med den organisme, som man vil vaccinere imod. Ligeledes kan organismerne også være inaktiverede ved eksempelvis varme- eller kemisk behandling. Man kan også nøjes med at indsprøjte en lille del, også kaldt en sub-unit, af en organisme, eller endda ét enkelt antigen, som man ved findes på den organisme, som man vil vaccinere imod.

    Man kan dog risikere, at vaccinen er så uskadeliggjort, at immunsystemet ikke anser den for farlig eller fremmed og derfor ikke reagerer imod den. Det sikrer man sig imod ved at tilføre en adjuvant. En adjuvant er et stof, der provokerer immunsystemet til at reagere. Man kan med korrekt valg af adjuvant også sikre et B-cellerespons til fordel for et T-cellerespons – hvis man fx kun er interesseret i at danne antistoffer.

     

    Autoimmunitet

    Nogle gange virker immunforsvaret bedre, end det burde. Det kan nemlig finde på angribe den krop og de celler, som det er meningen, at immunforsvaret skal beskytte. Det sker, fordi immunsystemet ikke altid kan kende forskel på selv og fremmed. Normalt bliver selv genkendt af immunsystemets celler, og der findes forskellige tolerancemekanismer, der gør, at cellerne ikke aktiveres og dermed ikke angriber selv. Når disse tolerancer af forskellige grunde er utilstrækkelige, siger man, at selvtolerancen bliver brudt. Det medfører, at immunforsvaret kan angribe kroppens egne celler, og det giver sig udtryk i forskellige sygdomme, der betegnes autoimmune sygdomme.

    Leddegigt (reumatoid artritis) er et eksempel på en autoimmun sygdom, hvor immunsystemet angriber kroppens egne led. Man ved ikke præcist, hvordan immunsystemet aktiveres, men resultatet er en invaliderende lidelse med en unødvendig og skadende inflammation i leddene.

    Da autoimmunitet skyldes en overaktivering af immunsystemet, består behandlingen af autoimmune sygdomme i at hæmme immunsystemet – en såkaldt immunsupprimerende behandling. En af måderne til dette er ved at hæmme de kemiske stoffer – også kaldt cytokiner – der fremmer inflammationen. Et af disse er TNF-alfa. TNF-alfa udskilles af makrofagerne, og hvis man hæmmer dette stof, vil inflammationen formindskes, og sygdomme som fx leddegigt vil derved lindres. Det betyder dog også, at det øvrige immunsystem bliver hæmmet, og man må derfor vægte behandlingen således, at sygdommen forsvinder mest muligt, samtidigt med at immunsystemet stadig kan reagere på infektioner. Læs mere i afsnittet antistoffer som lægemidler.

     

    Videre læsning:

    Janeway CA, Jr. et al (2001). Immunobiology., 5th ed., Garland Publishing

    Allergi opstår som følge af et overaktivt immunforsvar.

    Vaccinen blev opdaget af Edward Jenner.

    Oversigt over immunforsvaret fra Kræftens Bekæmpelse.

    For godt 3 milliarder af år siden havde liv på Jorden en anden betydning, end det har i dag, idet liv bestod af små encellede mikroorganismer – Prokaryoterne. Med evolutionen udviklede disse organismer sig langsomt og tilpassede sig ændrede forhold, og der opstod tre evolutionsgrene, som vi kender i dag.

    Den ene af disse grupper er bakterier, som også går under betegnelsen prokaryoter, der direkte oversat fra græsk betyder ”før-kerne”. Denne gruppe er encellede organismer, der er kendetegnede ved, at cellens arvemateriale, DNAet, flyder frit i cellen i stedet for at findes i en cellekerne. En anden gruppe er eukaryoterne, hvis navn betyder ”ægte kerne”. Det er den type celler, som mennesket er opbygget af. Cellerne indeholder en afgrænset cellekerne samt mange andre afgrænsede områder med specialiserede funktioner. Til denne kategori hører også planteceller, gær og svampe. Den tredje gruppe er archaebakterier, som er en slags midtergruppe, og i denne kategori findes ofte mikroorganismer, som kan leve under ekstreme forhold fx ved meget høje eller lave temperaturer.

    Bakterier og virus hører alle under den samlede betegnelse mikroorganismer. Svampe er den tredje store gruppe mikroorganismer. Hvis mikroorganismer er i stand til at gøre mennesker syge – de er sygdomsfremkaldende – kalder man dem patogener. Det er umuligt at leve en tilværelse uden at støde på mikroorganismer eller patogener. I denne artikel vil bakterier og virus blive beskrevet.

    Bakterier

    Vi møder konstant bakterier i vores hverdag, og det er heldigvis ikke alle, der er sygdomsfremkaldende. Mange af dem har vi endda god nytte af at leve sammen med, fx for at kunne fordøje mad ordentligt, og for at holde andre sygdomsfremkaldende bakterier væk.

    Selv om bakterier er så små, at der skal meget kraftige mikroskoper til, for at en enkelt bakterie skal kunne ses, foregår der en enorm fysiologisk aktivitet inde i bakterierne, og nogle typer har endda udviklet en metode til at kunne kommunikere med hinanden og kontrollere deres vækst – en metode kaldt quorum sensing.

    Bakterier beskrives oftest efter den slægt, de tilhører, og slægten er igen underinddelt i arter. Derfor har bakterier to navne som altid skrives med kursiv. Således tilhører miltbrandbakterien Bacillus anthracis (B. anthracis) en overordnet slægt med navnet Bacillus, som indeholder mange bakterier. Den miltbrandfremkaldende bakterie er af arten anthracis.

    Figur 1. Figuren viser opbygningen af en bakterie. Man ser det kerneløse cytoplasma omgivet af flere lag: cellevæg, kapsel og plasmamembran. Flagellen bruger bakterien til bevægelse.

    Som alle andre bakterier er denne bakterie opbygget af cytoplasma, hvori bakteriens DNA findes i en sammenrullet kromosomstruktur kaldt nukleoid. Cytoplasmaet består af en vandig del kaldt cytosol og af nogle uopløselige partikler, hvoraf ribosomerne, der laver proteinsyntesen, udgør den vigtigste del. Cytosolen er omkranset af cellemembranen, som muliggør begrænset ind- og udtransport af kemiske stoffer. I membranen sidder udvalgte transportproteiner, og bakterien kan på den måde selv bestemme, hvad der skal ind i cytoplasma, og hvad der skal holdes ude.

    Cellemembranens vigtigste funktion er at holde på cellens indhold af proteiner og DNA. Men i bakterier har den også en anden funktion, idet energien til cellevækst bliver genereret i membranen, da den indeholder en lang række ionkanaler som gør det muligt for specifikke ioner at krydse membranen.

    B. anthracis tilhører gruppen af grampositive bakterier.
    Gramfarvning 
    er en meget anvendt metode til inddeling af bakterier på baggrund af deres cellemembran. De grampositive bakterier har kun én cellemembran (plasmamembran). De er derudover omsluttet af et lag af peptidoglykan, som består af lange kæder af carbonhydrater bundet sammen af korte proteinkæder. Laget fungerer som en slags kapsel. Det er dette peptidoglykan-lag der bliver farvet af ”gramfarvning”. De gramnegative bakterier har både en indre og en ydre cellevæg. De har imellem de to lag også en peptidoglykan-lag men dette er langt tyndere end hos de grampositive, og bliver derfor ikke så godt farvet. Den yderste membran består hovedsageligt af sukkerholdige lipider (LPS) – se figur 2. LPS er en type molekyler, som mennesket ikke har. Det er med andre ord fremmed, og det kan derfor fungere som antigen for immunforsvaret. Det er endda så etaberet som antigen, at selv det uspecifikke medfødte immunforsvar kan genkende og reagere på det.

    Figur 2. Denne figur viser forskellen mellem gramnegative og grampositive cellers membran. Grampositive har kun én plasmamembran og en ydre peptidoglykan-cellevæg, mens de gramnegative har to plasmamembraner og kun en mindre peptidoglykan-væg i mellem de to.

    Som alle andre bakterier er denne bakterie opbygget af cytoplasma, hvori bakteriens DNA findes i en sammenrullet kromosomstruktur kaldt nukleoid. Cytoplasmaet består af en vandig del kaldt cytosol og af nogle uopløselige partikler, hvoraf ribosomerne, der laver proteinsyntesen, udgør den vigtigste del. Cytosolen er omkranset af cellemembranen, som muliggør begrænset ind- og udtransport af kemiske stoffer. I membranen sidder udvalgte transportproteiner, og bakterien kan på den måde selv bestemme, hvad der skal ind i cytoplasma, og hvad der skal holdes ude.

    Cellemembranens vigtigste funktion er at holde på cellens indhold af proteiner og DNA. Men i bakterier har den også en anden funktion, idet energien til cellevækst bliver genereret i membranen, da den indeholder en lang række ionkanaler som gør det muligt for specifikke ioner at krydse membranen.

    B. anthracis tilhører gruppen af grampositive bakterier.
    Gramfarvning 
    er en meget anvendt metode til inddeling af bakterier på baggrund af deres cellemembran. De grampositive bakterier har kun én cellemembran (plasmamembran). De er derudover omsluttet af et lag af peptidoglykan, som består af lange kæder af carbonhydrater bundet sammen af korte proteinkæder. Laget fungerer som en slags kapsel. Det er dette peptidoglykan-lag der bliver farvet af ”gramfarvning”. De gramnegative bakterier har både en indre og en ydre cellevæg. De har imellem de to lag også en peptidoglykan-lag men dette er langt tyndere end hos de grampositive, og bliver derfor ikke så godt farvet. Den yderste membran består hovedsageligt af sukkerholdige lipider (LPS) – se figur 2. LPS er en type molekyler, som mennesket ikke har. Det er med andre ord fremmed, og det kan derfor fungere som antigen for immunforsvaret. Det er endda så etaberet som antigen, at selv det uspecifikke medfødte immunforsvar kan genkende og reagere på det.

    Fra cellevæggen udgår ofte hårlignende strukturer, pili, som giver bakterien mulighed for at bevæge sig hen over en overflade. Samtidigt har mange bakterier også en slags hale eller propel kaldt en flagel, som gør, at bakterien kan svømme i flydende medier.

    Et særligt kendetegn ved B. anthracis, som også gør den særligt anvendelig som biologisk våben, er, at den har mulighed for at danne sporer. Dette er en særlig, hvilende form af bakterien, hvor der ikke foregår noget nævneværdigt stofskifte, men hvor den har mulighed for at overleve i flere tusinde år selv under meget ekstreme forhold bl.a. ved høje temperaturer og ved høje koncentrationer af ellers for bakterien giftige stoffer. Når forholdende igen bliver gunstige for vækst, vender sporerne tilbage til normal levevis og kan herefter fremkalde sygdommen miltbrand.

    I historien er der ofte beskrevet områder eller huse, som var forbandede, bl.a. de gamle Egyptiske gravkamre, hvor indtrængende personer tit blev dødeligt syge. Mange mener i dag, at denne ”forbandelse” ikke skyldes overnaturlige kræfter, men nok nærmere sporedannende bakterier, som har overlevet i århundreder.

    B. anthracis findes forholdsvis ofte i kvæg, men overføres kun herfra til mennesker gennem rifter i huden eller ved direkte indtag. Mange dyr bliver vaccineret mod miltbrand, men det er dog ikke alle steder i verden, dette er muligt, og her opstår der med jævne mellemrum pludselige dødsfald hos kvæg. På grund af bakteriens mulighed for at danne sporer, der har en lang levetid, har der været tilfælde med kontamineret landbrugsjord, der måtte renses for bakterien, da det ellers ville tage mange år før jorden kunne bruges igen.

    Hvis mennesker indånder sporer vil bakterierne genopvækkes og formere sig i lungerne. Her er det forholdsvis let for bakterierne, at blive overført til blodbanen og derved resten af kroppen. Det var på denne måde, at medie- og postarbejdere samt politikere blev syge eller døde i USA i 2001, hvor der blev sendt breve indeholdende B. anthracis sporer. Der døde 5 personer mens 17 blev syge.

    Bakterien dræber både dyr og mennesker ved at udskille et giftstof, som består af tre proteiner. Det interessante er, at disse tre proteiner er afhængige af hinanden og således ikke virker alene. Det ene protein bruges til at få de to andre ind i cellerne, hvor disse herefter kan gøre skade. Giftstoffet gør, at bakterien kan dræbe makrofagerne, der som nævnt har til opgave at fagocytere og tilintetgøre fremmede mikroorganismer. Herved har B. anthracis mulighed for at undslippe immunforsvaret. Ligeledes angriber bakterien også endotelceller, som er et tyndt lag flade celler, der dækker de indre overflader i blod- og lymfekar samt hjertet og andre væskefyldte hulrum. Dette fører til indre blødninger, og patienten dør i løbet af få dage.

    Miltbrand er frygtet som biologisk våben, da det er en infektion, der kan have dødelige følger for store dele af befolkningen. Det skete eksempelvis under krigene i det tidligere Zambia og Zimbabwe i 1970’erne, hvor mange mennesker og dyr døde som følge af smitte. Både den amerikanske og engelske hær tager jævnligt forholdsregler ved at lade deres soldater og andre militærfolk vaccinere.

     

    Antibiotika

    Antibiotika er medicin, der selektivt dræber mikroorganismer. Stofferne udnytter, at der er forskel på fx bakterier og menneskeceller således, at de kun rammer molekyler og processer, der er specifikke for bakterier. Derved forbliver stofferne i selv store koncentrationer ugiftige for mennesket men dødeligt for mikroorganismen. Antibiotika dækker også over anti-virale, anti-parasitære og anti-svampe midler.

    Penicillin var det første antibiotika der blev produceret, og er et godt eksempel på hvordan antibiotika fungerer. Penicillin udnytter, at de grampositive bakterier skal opbygge et peptidoglykan-lag, som menneskeceller ikke har. Stoffet hæmmer denne cellevægs opbygning, hvorved bakterievæksten bremses. Pencillin virker af samme grund bedst på grampositive bakterier – som fx miltbrandbakterien.

     

    Virus

    Virus er nogle meget specielle mikroorganismer, idet de er utroligt simple. De består næsten ikke af mere end arvemateriale – enten i form af DNA eller RNA. De er derfor afhængige af, at inficere andre celler, da de ikke selv kan reproducere sig.

    Når virus inficerer celler, som både kan være dyre- og planteceller, reproducerer de sig inde i den inficerede celle ved at overtage cellens protein-produktionsapparat. Det betyder, at cellen udtrykker de proteiner, som virussens DNA eller RNA koder for, og derved dannes der nye virus-partikler. Når der er ophobet en vis mængde virus-partikler inde i cellen, vil cellen dø, og virus frigives igen til omgivelserne – fx til blodet, hvorefter nye celler kan inficeres. Antallet af viruspartikler i blodet kan bruges til at følge udviklingen af en virusinfektion.

    Infektion med virus sker først og fremmest ved, at viruspartikler overføres fra et menneske til et andet, oftest igennem luftvejene. Herefter er der flere trin, der i sidste ende transporterer viruspartiklen ind i værtsceller. Det første trin indebærer fastsættelse på værtsceller. Dette sker ofte ved en tilfældig kollision. Immunforsvarets celler samt fysiske barrierer som fx slimlag forhindrer til en vis grad en kollision. På kroppens celler findes en lang række receptorer. Det er overfladeproteiner, og nogle af disse modtager molekyler fra omgivelserne og flytter dem ind i cellen. Mange virus har udviklet sig til at genkende og binde disse receptorer. På denne måde kan de nemt blive transporteret ind i cellen. Når virussen er inde i cellen, smider den sin kappe, hvorved dens DNA (eller RNA) blottes. Dette gøres på mange forskellige måder alt afhængigt af, hvilken slags virus der er tale om. For nogen virus gælder det, at de indeholder deres egen DNA-oversætter (en RNA-polymerase), som danner et specielt protein, der er med til at fjerne dens kappe. Først herefter frigøres dens DNA til videre arbejde ved værtscellens maskineri.

    Ebola er et eksempel på en virus. Ebola menes at komme fra flagermus og består af en RNA-streng omgivet af fedtmolekyler, der hjælper den med at komme igennem værtscellernes cellemembraner. Hos en inficeret person, findes virussen i alle kropsvæsker, hvilket gør virussen ekstremt smitsom. Efter en inkubationstid på op til 25 dage præsenterer infektionen sig med feber, muskelsmerter, mavesmerter, kvalme og diarré. Den lange inkubationstid, hvor de inficerede ikke ved, at de er smittet, kombineret med en høj smitsomhed gør, at sygdommen hurtigt kan sprede sig. Infektionen med Ebola er meget farlig, da der endnu ikke eksisterer en god behandling. Dødeligheden er således på op til 90 % af de inficerede og skyldes organskader og blødningsforstyrrelser. Forskere over hele verdenen arbejder i øjeblikket intensivt på at finde en effektiv behandling enten i form af en vaccine (aktiv immunisering) eller virksomme antistoffer (passiv immunisering). Det er dog utænkeligt at sygdommen bliver helt udryddet, da den stadig vil eksistere i værten – frugtflagermus. Du kan selv prøve kræfter med at udvikle antistoffer mod Ebola i Biotech Academys virtuelle laboratorium.

    Et andet eksempel på en virus er koppevirus, der som naturligt forekommende mikroorganisme ellers er udryddet. Der findes to former for koppevirus: Variola major og Variola minor, hvoraf V. major er den mest dødelige med op til 50 % dødelighed. Den kan kun smitte mellem mennesker og overføres via dråber, som indåndes fra en anden person, fx fremkommet ved hoste eller tale. Infektion med koppevirus har en inkubationstid på ca. 4-14 dage, hvorefter der opstår almindelige influenzalignende symptomer som feber og hovedpine. Herefter går virussen over til at inficere celler i hele kroppen, hvor især hudceller angribes, hvilket giver anledning til væskeholdige blærer på huden. Kopper kan kun inficere mennesker og er et eksempel på en sygdom der er blevet udryddet af den moderne lægevidenskab. Efter et intensivt vaccinationsprogram kunne WHO erklære den for udryddet i 1979, og man er siden holdt op med at vaccinere imod den. Det siges af kopper-virus nu kun findes to steder i verden: Nemlig i amerikanske og i russiske laboratorier, og af samme grund frygter nogle, at den kan blive brugt som biologisk våben imod en ikke-vaccineret befolkning. De eneste der stadig får eller bliver tilbudt vaccine imod kopper er ansatte i den amerikanske hær.

    De fleste antibiotika virker ved at forhindre mikroorganismernes cellulære mekanismer i at virke, men eftersom virus ikke har deres eget stofskifte, er det kun muligt i ringe grad at bekæmpe virus med antibiotika. Dette gør virus til særligt farlige mikroorganismer. Derimod kan vaccination ofte være en effektiv forhindring af sygdomsudbrud. Du kan læse mere om Symphogen A/S’s rolle i sygdomsforebyggelse og under et potentielt terrorangreb i de følgende artikler.

     

    Læs mere:

    På netbiologen.dk kan du læse om virus.
    Du kan læse mere om miltbrand her.

    Du kan finde information om biologisk krigsførelse på disse sider:
    Om biologiske våben fra netdoktor.dk 
    Om miltbrandangrebene i det amerikanske i postvæsen 2001.

    Figur 3. Figuren viser, hvordan en virus replikerer sig selv inde i en værtscelles kerne (sorte cirkel). Ved at sætte sine DNA eller RNA (røde prikker) ind i værtscellens DNA, kan virussen udnytte cellens normale proteinproduktion til at replikere sit virale DNA gener og dermed danne nye viruspartikler.

    Eftersom sygdommen kopper er en virussygdom, der ikke kan behandles med almindelige antibiotika, er den bedste behandling en egentlig forebyggelse ved vaccination. Da Kopper er erklæret udryddet på verdensplan, vaccinerer man ikke længere befolkningen mod sygdommen. Der er dog i nyere tid opstået ny frygt for sygdomsudbrud. Det skyldes at der eksisterer frygt for, at nogle lande har sat produktionen af virussen i gang til et biologisk angreb. Med den høje dødelighed af sygdommen ville det have katastrofale følger, hvis dette fandt sted. I Danmark findes der nok koppevaccine på lager til at kunne dække den danske befolkning, men har et angreb allerede fundet sted, vil det være for sent for mange mennesker at blive reddet.

    Vaccination mod koppevirus blev kendt allerede i 1790’erne hvor Edward Jenner overførte koppevirus fra køer til mennesker. Koppevirus fra køer er en anden form end den, som inficerer mennesker, og resulterer sjældent i sygdom blandt mennesker. Denne overførsel førte blandt forsøgspersonerne til krydsimmunitet over for den koppevirus, som inficerer mennesker, formentlig på grund af den store lighed mellem de forskellige vira. Ko-typen af kopper hedder vaccinia (fra den latinske betegnelse for en ko ”vacca”), og deraf stammer ordet vaccination.

    Desværre kan der ved denne slags vaccination være alvorlige bivirkninger, som rammer omkring 1 ud af 1000 vaccinerede. Man kan reducere bivirkningerne ved at give anti-vaccinia antistoffer, altså antistoffer, som genkender antigener på vaccinia-virussen og dermed assisterer immunsystemet. Disse antistoffer kan isoleres hos tidligere vaccinerede individer, men eftersom denne gruppe af mennesker bliver mindre og mindre, er det blevet svært at anskaffe sig antistoffer på denne måde. Anti-vaccinia antistoffer ville også kunne anvendes ved et sygdomsudbrud, idet de kan gøre et sygdomsforløb mildere for en person, som er smittet med kopper uden at være vaccineret i tide. Det ville derfor være hensigtsmæssigt at kunne producere anti-vaccinia eller endda anti-kopper antistoffer.

    Før disse metoder vil blive beskrevet, er det nødvendigt at vide noget om DNA, og om hvordan det bliver til proteiner eller antistoffer. Du kan lære om dette eller få det genopfrisket ved at klikke her.

     

    Produktion af monoklonale antistoffer

    Den følgende gennemgang kan du efterprøve i Biotech Academys virtuelle laboratorium ved at klikke her. Opgaven hedder “Produktion af antistoffer”.

    Når man skal producere syntetiske antistoffer, udnytter man det kendskab, man har til immunforsvarets naturlige produktion af antistoffer. Det vil sige, at man stimulerer et immunforsvar med etantigen, så immunforsvaret selv danner antistoffer imod netop dette antigen. Antigenet kan på den måde være næsten hvad som helst, så længe det bliver opfattet som fremmed af det udsatte immunforsvar. Det sker ofte med tilsætning af en adjuvant for at sikre et tilstrækkeligt immunologisk respons, som beskrevet under Immunisering.

    Da antigener og adjuvant kan være farlige for mennesker, og da cellerne også er svære at isolere efterfølgende, bruger man ofte mus til at udvikle antistoffer. Når man har stimuleret musens immunforsvar, giver man det tid til at reagere og udvikle optimale antistoffer, hvilket ofte tager over en uge – det såkaldte primære respons. Man ”høster” derefter de udviklede plasmaceller ved at udtage musens milt. Milten er et organ fyldt med lymfoidt væv, og den har derfor også en stor koncentration af lymfocytter, herunder plasmaceller. I alt indeholder milten 15 % af kroppens B-lymfocytter, og man har derfor en stor chance for at finde en plasmacelle, der producerer antistoffer imod det ønskede antigen.

    Når man har udtaget milten, har man dog ikke kun fået fat i plasmaceller, og cellerne skal derfor sorteres. Derudover kan plasmaceller ikke overleve særlig længe uden for kroppen. Man løser disse problemer i to trin. Først fusionerer plasmacellerne med myelomaceller (cancer-plasmaceller) og danner såkaldte hybridomaceller – se figur 1. Disse cancerceller har næsten ubegrænset levetid. Derefter tilsætter man et vækstmedium – dvs. den næring som celler lever af – som kun korrekt fusionerede plasma-myeloma hybridomaceller kan overleve i. Dermed får man både isoleret plasmacellerne og sikret, at de kan overleve uden for kroppen, som hybridoma celler.

    Men de isolerede hybridomaceller stammer ikke alle sammen fra den antigen-adjuvant stimulering, som man startede ud med.

    Figur 1. Denne figur viser, hvordan musecellerne bliver fusioneret med opdyrkede cancerceller. Den endelig fusionerede celle kaldes en hybridomacelle. Denne celle har både en lang levetid og er i stand til at dele sig.

    Det er også andre plasmaceller, der producerer alle mulige forskellige antistoffer, som musen har haft brug for og derfor produceret i løbet af sit liv. For at finde frem til de hybridomaceller der producerer antistoffer specifikke for det ønskede antigen, må man derfor fordele cellerne enkeltvis i brønde på en mikrotiterbakke, så man kan teste de enkelte antistoffer – se figur 2. Her producerer cellerne antistoffer, og man kan så teste væsken (med antistof, uden celle) fra hver brønd i et indirekte ELISA – se Immunkemiske metoder. Hvis der er reaktion med det ønskede antigen i et indirekte ELISA ved man, at der findes antistof, som har bundet antigenet. Man kan så gå tilbage til mikrotiterpladen med plasmacellerne og finde den celle, som den positivt testede væske med antistof kom fra. Denne celle indeholder DNA for det antistof, som man er interesseret i at producere. Dette DNA kan sekventeres og bruges til at producere nye antistoffer i andre celler.

    Selv om immunforsvaret i klodens forskellige pattedyr i store træk er forbløffende ens, så er der stadig små forskelle i de proteiner, vi producerer. Det antistof, som en hybridomacelle producerer, vil stadig være muse-antistoffer – eller murine antistoffer. 

     Figur 2. Denne figur viser, hvordan plasmacellerne er fordelt i hver sin brønd, hvor de producerer hver deres specifikke antistof.

    Hvis man giver dem direkte til mennesker, så vil menneskets immunforsvar opfatte muse-antistofferne som fremmede og reagere imod dem. En sådan reaktion vil modvirke antistoffets funktion som lægemiddel.

    Reaktionen kan begrænses ved, at man sammensætter menneskeligt DNA med DNA fra de isolerede museantistoffer. Det foregår ved genetisk rekombination. På den måde formindsker man det fremmede element af antistoffet, og dermed formindskes immunforsvarets tendens til at anse det for fremmed. Resultatet bliver et kimærisk antistof (opkaldt efter et sagndyr i den græske mytologi), hvor de menneskelige konstante regioner og de variable regioner fra musen er sammensat. For en beskrivelse af antistoffers forskellige regioner se under Variation af antistoffer.

    Figur 3. Figuren viser, hvordan man kan sammensætte et antistof af både menneskets og musens DNA. På den måde skabes et kimærisk antistof.

    Når man har rekombineret DNAet fra menneske og mus, kan man indsætte det i produktionsceller vha. af en vektor. En ofte anvendt vektor er et plasmid. Det er et lille cirkulært DNA, som mange bakterier indeholder naturligt. Dette plasmid kan optages i en celle, og under de rigtige forhold kan der finde udskiftning af gener sted mellem vektoren og det kromosomale DNA. En vektor kan også være en virus, da disse, som beskrevet i afsnittet ” Bakterier og virus”, indsætter deres DNA i værtscellens.

    Det har vist sig, at disse produktionsceller skal være pattedyrsceller for at opnå den helt rigtige efterbehandling af antistoffet inde i cellen. Man har fundet ud, at CHO-celler – Chinese Hamster Ovarian cells – altså celler fra hamsteræggestokke er gode at bruge, og de er derfor de mest anvendte.

    Man kan fx få et plasmid ind i en produktionscelle ved elektroporation. Det er en proces, hvorved man får cellerne til at optage DNA – i dette tilfælde plasmidet – fra den omgivende væske. Ved at give plasmidet nogle promotorer, der bliver genkendt i produktionscellen, vil DNA’et på plasmidet blive aflæst og produceret.

    Figur 4.  Figuren viser et plasmid, som indeholder de gener, man fx kunne indsætte i en organisme for at producere antistoffer. Promotorerne og resistensmarkører muliggør produktionen, mens to tunge og to lette kæde tilsammen danner et funktionelt antistof.

    Produktion af polyklonale antistoffer hos Symphogen A/S

    Som nævnt i afsnittet om immunforsvaret, kan polyklonale antistoffer forventes at være mere effektive end monoklonale antistoffer over for komplekse antigener, som ses hos vaccinia og koppevirus. Det skyldes ganske enkelt, at flere forskellige mål, i form af antigener, på den invaderende mikroorganisme tillader, at flere antistoffer bliver bundet. Af samme grund af polyklonale antistoffer bedre beskyttet i mod resistensudvikling, hvor ét antigen ændrer sig følge af en mutation.

    Symphogen A/S bruger blodprøver fra vaccinerede britiske ambulance-chauffører som udgangsmateriale i deres anti-vaccinia virusprojekt. Fra disse blodprøver genererer de, bl.a. ved brug af genteknologi, rekombinante polyklonale antistoffer, som kan fremstilles industrielt, og som vil afspejle den sammensætning af antistoffer, der er dannet af immunforsvaret hos de vaccinerede donorer. Fordelen er, at man her får fuldstændigt humane antistoffer, men det er til gengæld også sværere at få fat i de rigtige plasmaceller, end hvis man fx udtager en milt.

    Symphogen A/S har som nævnt udviklet deres egen metode, hvormed de kan kopiere polyklonale antistoffer ved hjælp af genteknologi. Denne metode er kaldt Symplex-teknologien. Formålet er, at fremstille en blanding af antistoffer i mod forskellige antigener, der afspejler den blanding, der findes i en immun person. Denne naturlige immunitet kan være opstået efter sygdom eller efter vaccination og er fx rettet i mod flere antigener på samme bakterier. Denne metode er dyrere end at fremstille de monoklonale antistoffer men kan også forventes at være mere effektiv i bekæmpelsen af sygdom.

    Vaccinationer er én anvendelse af immunologien til sygdomsbekæmpelse. Men immunologiens andre facetter bliver i stigende grad også anvendt. Det drejer sig især om antistoffer, der både kan bruges i laboratoriearbejdet eller direkte som lægemidler uden om immunforsvaret. I det følgende afsnit vil nogle antistoffer, der bliver brugt som medicin i behandlingen af mennesker, blive beskrevet.

    Antistoffer er den dyreste medicingruppe, der bliver brugt i dag. Den høje pris for de antistoffer, skyldes bl.a. at en stor del af antistoffer stammer fra oprenset blod fra immune personer. Det kan være personer, der enten har overlevet en infektion, eller som er blevet vaccineret mod et bestemt antigen. Antallet af disse personer, der samtidig er villige til at donere blod, er begrænset, og prisen er derfor høj. Syntetisk udvikling af antistoffer er derfor et vigtigt fremskridt for videnskaben, og forhåbentlig kan man herigennem sikre en billigere forsyning af antistoffer i fremtiden.

     

    Anti-RhD

    Rhesus-antigener er en samlet betegnelse for omkring 50 forskellige antigener, som findes  på deres røde blodlegemer hos de fleste. De røde blodlegemer transporterer oxygen rundt i kroppen til alle vores celler. Rhesus-egenskaben blev opdaget i rhesusaber før 2. verdenskrig, og antigenerne har fået deres navn herfra. Rhesus-antigenerne er meget ”immunogene”, hvilket vil sige, at de har en stor evne til at aktivere immunforsvaret og stimulere dannelsen af anti-Rhesus-antistoffer.

    Den farligste type er Rhesus D, eller RhD-antigenet. Det skønnes, at ca. 85 % af den danske befolkning er RhD-positive. Det vil sige, at de alle bærer rundt på RhD-antigener på deres egne celler og vil derfor ikke producere antistoffer mod Rhesus D – de er tolerante over for RhD-antigenet.

    På grund af den kraftige immunogenicitet kan der opstå alvorlige komplikationer under blodtransfusion, såfremt der anvendes blod med de modsatte rhesus-egenskaber. En RhD-negativ person vil udvikle antistoffer mod RhD-antigener første gang, denne person modtager RhD-positivt blod ved eksempelvis blodtransfusion – et såkaldt primært respons finder sted.

    Ved en yderligere blodtransfusion med RhD-positivt blod vil de allerede dannede antistoffer, samt hukommelses-B-celler, hurtigt reagere imod de fremmede røde blodlegemer – et sekundært respons. Dette medfører såkaldt ”hæmolyse”, hvor de røde blodlegemer ødelægges og frigør stoffer, som får blodtrykket til at falde. Den RhD-negative patient vil altså både ødelægge de transfunderede blodceller og yderligere påvirke sit blodkredsløb i negativ retning. Det vil i mange tilfælde medføre døden, når der bliver givet forkert blod til en patient.

     

    Anti-RhD antistoffer

    Der udvises stor påpasselighed ved blodtransfusioner for at undgå rhesus-komplikationer, men også under en graviditet kan der opstå komplikationer. Det sker, når en RhD-negativ moder bærer et RhD-positivt barn (det er muligt, når faderen er RhD-positiv).

    Der kan nemlig ske blødning mellem moder og barn under fødslen, og herved blandes små mængder af deres blod. Ved den første graviditet sker der som regel kun det, at moderen får aktiveret sine B-lymfocytter til at danne antistoffer mod RhD. Dette skyldes hovedsageligt, at kontakten med de fremmede antigener oftest først finder sted ved fødslen, kombineret med at det tager uger før kroppen har udviklet immunforsvaret nok til at danne rigeligt med antistoffer.

    Komplikationerne opstår ved en efterfølgende graviditet med et RhD-positivt barn, hvor moderens RhD-antistoffer krydsermoderkagen og angriber fosterets røde blodlegemer. Cellerne ødelægges, og i yderste konsekvens forårsager det fosterets død. For at forebygge dette giver man så vidt muligt altid RhD-negative mødre, der bærer RhD-positivt foster, små mængder af anti-RhD antistof. De små mængder antistof binder sig til fosterets RhD-antigener, og forhindrer derved, at moderens eget immunforsvar har mulighed for at genkende antigenerne. Dette bevirker, at moderens immunforsvar ikke aktiveres, og hendes B-lymfocytter derfor ikke differentierer til antistofproducerende plasmaceller.

    Det skønnes, at der i USA og i Europa i alt finder omkring en million graviditeter sted hvert år, hvor det er nødvendigt at tilføre anti-RhD antistoffer. Dette har store økonomiske konsekvenser.

     

    Anti Respiratorisk Syncytial virus (RSV)

    Respiratorisk Syncytial virus er en virusinfektion, som hvert år gør mange spædbørn syge, og som kræver indlæggelse på hospitalet og behandling. RSV inficerer lungerne og luftvejene. Den smitter meget nemt gennem dråber fra en smittet person opstået ved hoste eller tale. Den kan endda overleve længe på eksempelvis dørhåndtag eller legetøj, hvorved man selv kan blive smittet. Det skønnes, at stort set alle børn tilegner sig sygdommen mindst en gang, før de fylder to år. Ny forskning inden for denne virusinfektion tyder på, at børn, der er særligt hårdt angrebet af virussen, risikerer at udvikle langvarige respiratoriske komplikationer i lungerne, fx astma.

    Til for tidligt fødte børn, som er særligt udsatte for at tilegne sig sygdommen under de årlige epidemier i vintermånederne, har man designet et monoklonalt antistof, der kan binde sig til virussen og neutralisere den. Antistoffet kan gøre symptomerne ved sygdom mildere eller helt forhindre et udbrud. Symphogen A/S har i en årrække forsket i at producere et polyklonalt antistof mod RSV, og det antages, at dette antistof vil have bedre virkning end det eksisterende monoklonale pga. de polyklonale egenskaber. En af ulemperne ved de monoklonale antistoffer er nemlig, at de kun er specifikke mod et bestemt antigen, og dette kan være med til at selektere for resistente mutanter, der således med monoklonalt antistof vil undslippe behandling. Det forventes, at når dette produkt kommer på markedet, vil flere børn få mulighed for at modtage profylaktisk behandling, hvilket vil betyde, at langt færre spædbørn vil opleve alvorlige udbrud af RSV. Derved vil færre børn lide af de respiratoriske følgevirkninger efter en alvorlig RSV, og man vil desuden kunne mindske omkostningerne til senere hospitalsindlæggelser.

     

    Anti cancer behandling

    Et område, hvor antistoffer som lægemidler er i kraftig udvikling, er kræft. Der er her udviklet flere monoklonale antistoffer, som har vist god effekt. Antistofferne binder sig til forskellige overfladeproteiner, der enten er specifikke for kræftceller eller udtrykt i særlig høj grad, og de kan derfor lokalisere kræftcellerne og aktivere immunforsvaret til at dræbe dem. Andre af de monoklonale antistoffer virker ved at blokere bindingssteder for forskellige vækstinducerende molekyler. Derved kan kræftcellen ikke vokse lige så hurtigt, som den ellers ville havde gjort. Der findes også antistoffer, der har bundet gift eller enzymer til deres Fc-region. Det uheldige ved kræftceller er, at de muterer. Hvis de molekyler, som antistofferne genkender (antigenerne), muterer, så mister antistofferne deres virkning, og man skal til udvikle nye antistoffer specifikke for en mutant, der samtidig kan variere fra patient til patient.

    Figur 1. Figuren viser, hvordan antistofferne finder og binder den specifikke celle, der fx kunne være en kræftcelle. På den måde kan immunforsvaret angribe kræftcellen.

    På nedenstående figur vises, hvordan binding af antistoffer til en celle kan medføre, at denne dør. Binding af antistofferne tiltrækker Natural Killer celler (NK-celler) som indeholder en masse cellegifte pakket i granula. Disse giftstoffer frigives ved binding af NK-cellen til antistoffernes Fc-del. Antistofferne tydeliggør på den måde cancercellerne for immunforsvaret, der herefter angriber cancerceller på samme måde, som var den en virus- eller bakterieinfektion.

     

    Anti-TNF-alfa

    TNF-alfa, eller tumor necrotic factor alpha, er et inflammatorisk cytokin. Det vil sige, at det er et molekyle, der fremmer inflammation og betændelse. Det bliver udskilt af bl.a. aktiverede makrofager, hvis de ”opfanger”, der er fare på færde, fx hvis de kommer i kontakt med en bakterie eller et viruspartikel. Det er fx cytokinernes skyld, at man får feber, når man bliver inficeret med en virus eller bakterier.

    Hvis det derimod er en autoimmun sygdom, der ligger til grund for udskillelsen af TNF-alfa og andre cytokiner, så kan immunforsvaret finde på at angribe kroppens egne og raske celler. Det er fx tilfældet i leddegigt, psoriasis og mutipel sclerose, der alle er autoimmunesygdomme. Det er i disse tilfælde derfor en fordel at begrænse mængden af inflammatoriske cytokiner. Det gør man fx. ved at producere antistoffer imod TNF-alfa. Antistofferne indfanger og neutraliserer TNF-alfa, hvorved den inflammatoriske reaktion fra den autoimmune sygdom begrænses. Disse antistoffer kaldes Anti-TNF-alfa antistoffer og er blevet en fast behandlingsmetode af leddegigt og andre autoimmunesygdomme.

    Immunsystemet er skabt til at finde og bekæmpe infektioner og sygdomme, og det er derfor nærliggende at anvende immunologien til at udvikle nye behandlingsformer. Disse vil nemlig ligne og kunne bidrage mekanismer, som allerede foregår i kroppen. Men immunologien har også mange andre anvendelsesmuligheder, idet antistoffer kan bruges til diagnosticering og påvisning af stort set alle molekyler. Der er udviklet mange forskellige teknikker til anvendelse i laboratoriet, og i det følgende vil nogle af de vigtigste blive gennemgået.

    • Agglutinering og blodtyper
    • ELISA
    • Western blotting
    • Flow cytometri
    • Udfældning
    • Immundiffusion


    Agglutinering og blodtyper

    Agglutinering bygger på princippet om udfældning og anvendes til daglig inden for mange områder til diagnosticering og som led i andre tests.

    På vores blodlegemer sidder antigener, som også findes på resten af kroppens celler. Dette er bl.a. A- og B-antigenerne som er kendt i AB0-blodtypesystemet. En person, som har blodtype A, har A-antigener siddende på overfladen af de røde blodlegemer. En person, der har blodtype B, har B-antigener på overfladen, mens en person af blodtype 0 ikke har nogen af disse antigener.

    A/B-antigenerne findes også på mange bakterier, som vi møder til daglig, og vi bliver derfor stimulerede til at danne antistoffer mod disse antigener. Man bliver så at sige immuniseret mod antigenerne og dermed blod af den type. Således vil en person med blodtype A have B-antistoffer og modsat for en person med blodtype B, mens en person med blodtype 0 vil have såvel A- som B-antistoffer i blodet.

    Overførsel af blod af en type, som modtageren er immuniseret overfor, kan være meget farligt. Det medfører, at ens antistoffer angriber de transfunderede blodceller, som dermed ødelægges (hæmolyse). De ødelagte celler hjælper ikke på det, som var meningen med blodstranfusionen, og desuden kan de samtidigt være farlige, da der frigives en masse intracellulære molekyler til blodet. Der skal derfor udøves en stor påpasselighed ved blodtransfusioner, så man sikrer sig, at der er forlig imellem donor- og modtagertypen. Det er derfor nødvendigt at kunne teste, hvilken blodtype man hører til. Blodtypebestemmelse sker ved en agglutineringsreaktion, hvor man påfører blod af ukendt type til en plade, hvorpå der findes antistoffer mod enten A- eller B-antigener. Hvis der er antigener til stede på blodlegemerne i prøven, vil disse udfældes sammen med antistoffet på pladen, og man kan derved bestemme blodtypen. Hvis der ikke er udfældning, er type 0, og hvis der er udfældning på begge plader, er typen AB.

    ELISA

    ELISA er en forkortelse for Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay, og er en af de mest anvendte metoder. ELISA er en undersøgelse for tilstedeværelsen enten af antigener eller af antistoffer. Derfor findes der flere forskellige former af ELISA.

    En form er det indirekte ELISA, hvor man tester for tilstedeværelsen af antistoffer. Man kan på den måde opdage visse infektioner, hvor mængden af virus eller bakterier er så lav, at man ikke kan teste for dem direkte. Man  skal bare have en lille blodprøve for at kunne identificere eventuelle antistoffer mod en inficerende bakterie eller virus i patienten. Rent praktisk foregår det ved, at antigener, specifikke for det antistof man ønsker at teste for, sættes i bunden af en brønd, se figur 4. Herefter tilsættes den prøve, man ønsker at teste for indhold af antistof. Såfremt prøven indeholder de formodede antistoffer, vil disse binde til antigenerne i bunden af brønden. Herefter vaskes overskydende antistof væk, og der tilsættes nu et andet antistof, der kan binde sig til det antistof, man tester for – dette kaldes et sekundært antistof. Igen vaskes det overskydende antistof væk. Det sekundære antistof er bundet til et enzym, og når man tilsætter et substrat, som kan omdannes af dette enzym, skifter opløsningen farve. Jo mere farveskift, desto mere enzym og antistof.

    Denne test kan også vendes om til et direkte ELISA. I denne metode bruger man antistoffer fæstnet til brøndens bund til at undersøge for et formodet molekyle, se figur 1. Disse antistoffer er specifikke for et antigen på det molekyle, som man ønsker at teste for – fx et hormon eller et lægemiddel. Prøven man vil undersøge for pågældende antigen tilsættes, og hvis den indeholder antigen, vil det bindes til antistofferne. Der vaskes, og der tilsættes et antistof med samme antigen-specificitet, men som også er bundet til et enzym. Tilsætningen efterfølges af en vask, så kun de antistoffer, der er bundet til antigenet forbliver. Ved tilsætning af substrat vil der fremkomme en farvereaktion, som skyldes, at enzymet omdanner substratet til et farvet produkt. Jo mere farvereaktion, desto mere enzym og antigen.

     

    Western blotting

    Et western blot er en teknik, der gør det muligt at teste for tilstedeværelsen af et specifikt protein i en opløsning med mange forskellige proteiner. Teknikken bruges ofte til at teste for antistoffer ved diagnosticering af patienter. Behandler man et protein med et denaturerende stof, vil proteinet få en mere lineær form. Denne effekt udnyttes i western blot, hvor et denaturerende stof tilsættes den opløsning, der skal testes.

    Figur 1. Illustrationen viser ELISA-metoden, hvor en prøve kan undersøges for tilstedeværelsen af antigen eller antistof.

    Herefter påsættes de denaturerede proteiner en gele indeholdende det denaturerende stof, og der tilsluttes en spændingskilde. Da proteinet har en ladning, vil det bevæge dig i gelen.Små proteiner vil bevæge sig hurtigst. Denne forskel i hastighed vil resultere i, at proteinerne bliver adskilt efter størrelse. Metoden kaldes gelelektroforese. Efter at have bevæget sig ned ad gelen overføres proteinerne ved hjælp af en elektrisk strøm til en nylonmembran. Den negative pol placeres på gel-siden og den positive pol placeres på nylonmembran-siden. Herved vil de negativt ladede proteiner bevæge sig over på nylonmembranen og her befinde sig i samme mønster som på gelen.

    Nylonmembranen dyppes i en opløsning, der indeholder antistoffer mod et ønsket antigen. Til sidst tilsættes et sekundært antistof, der binder til det første antistof. Dette sekundære antistof er bundet til et enzym, der udvikler en farve, når dets substrat også tilsættes. Herved kan tilstedeværelsen at et bestemt antigen eller protein visualiseres.

    Figur 2. Når et protein denatureres, foldes det ud og bliver mere lineært.

     

    Herefter påsættes de denaturerede proteiner en gele indeholdende det denaturerende stof, og der tilsluttes en spændingskilde. Da proteinet har en ladning, vil det bevæge dig i gelen.Små proteiner vil bevæge sig hurtigst. Denne forskel i hastighed vil resultere i, at proteinerne bliver adskilt efter størrelse. Metoden kaldes gelelektroforese. Efter at have bevæget sig ned ad gelen overføres proteinerne ved hjælp af en elektrisk strøm til en nylonmembran. Den negative pol placeres på gel-siden og den positive pol placeres på nylonmembran-siden. Herved vil de negativt ladede proteiner bevæge sig over på nylonmembranen og her befinde sig i samme mønster som på gelen.

    Nylonmembranen dyppes i en opløsning, der indeholder antistoffer mod et ønsket antigen. Til sidst tilsættes et sekundært antistof, der binder til det første antistof. Dette sekundære antistof er bundet til et enzym, der udvikler en farve, når dets substrat også tilsættes. Herved kan tilstedeværelsen at et bestemt antigen eller protein visualiseres.

    Denne metode anvendes bl.a. til at teste personer for HIV. Proteiner fra HIV-inficerede celler separeres i gel-elektroforesen og overføres til nylonmembranen. Her tilsættes serum fra en blodprøve taget fra den person, der skal testes for HIV. Såfremt personen har HIV, vil der findes anti-HIV-antistoffer i prøven, og disse vil bindes til proteinerne på nylonmembranen. Tilstedeværelsen af anti-HIV-antistoffer påvises ved at tilsætte sekundære antistoffer, koblet sammen med et enzym, mod humane antistoffer, og ved tilsætning af substrat vil der ske en farvereaktion, såfremt der var anti-HIV-antistoffer i prøven. Metoden der anvendes, er i princippet den samme som i to andre tests, Southern blot og Northern blot, hvor der henholdsvis testes for DNA og RNA.


    Flowcytometri

    Flowcytometri gør det muligt at teste for flere forskellige celletypers tilstedeværelse i en prøve, samt at sortere cellerne efter de forskellige typer. Denne metode anvendes fx til at teste blodets celler for kræftceller, der ofte giver en uforholdsmæssig forøgelse af enkelte celletyper. Flowcytometeret er i forbindelse med en computer, hvortil data sendes om antallet af de forskellige celletyper opsamles.

    Figur 3. Figuren viser, hvordan man i western blotting kan vise tilstedeværelsen af forskellige proteiner i en prøve.

    For at teste en prøve i et flowcytometer er det nødvendigt først at behandle prøven med antistoffer mod de antigener, der identificerer overflademarkører på de forskellige celler. Disse antistoffer er specielle, idet de er fluorescerende ved forskellige bølgelængder. Man kan således skelne i mellem antistofferne og dermed i mellem celletyperne. Prøven, der oftest vil være en blodprøve, suges ind i flowcytometeret. Det sker langsomt, så kun en enkelt celle ad gangen kommer ind i cytometeret. Nu sendes en laserstråle mod cellen, hvilket exciterer det fluorescerende antistof. Dette resulterer i udsendelsen af fotoner, der har forskellige egenskaber afhængigt af, hvilke stoffer der er brugt til at lave de fluorescerende antistoffer.

    Resultatet er, at der udsendes lys ved forskellige bølgelængder, afhængigt af hvilken celle der passerer igennem flowcytometeret, og maskinen kan herved skelne imellem celletyperne. Når cellerne har passeret igennem flowcytometeret, kan de sorteres og opsamles hver for sig, således at man kan lave videre undersøgelser på nogle af cellerne.

    Denne metode anvendes bl.a. når man skal producere antistoffer, og derfor ønsker at isolere de antistofproducerende celler. Se afsnittet om Syntetiske antistoffer.

     

    Udfældning

    Udfældning bygger på princippet om, at tunge molekyler kan fælde ud i en opløsning. Udfældning af antigener kan finde sted ved tilsætning af den rette mængde antistoffer.

    Antistofferne har to bindingssteder, og vil på den måde krydsbinde flere antigener. Der dannes herved et stort net af krydsbundet antigener og antistoffer. Dette vil på et tidspunkt nå en sådan størrelse, at det udfældes (se figur 4).

    Figur 4. Figuren viser, hvordan celler kan analyseres i et flowcytometer. Her bliver cellerne sorteret efter type.

     

    Dette fungerer bedst med polyklonale antistoffer da de vil have flere bindingssteder på det ønskede molekyle.

    For at udfældning sker optimalt, er det vigtigt, at hverken koncentrationen af antistof eller antigen er for stor. Er der for meget antistof til stede, vil manglen på frie bindingssteder gøre, at hvert antistof kun binder til ét molekyle. Der vil derfor ikke kunne krydsbindes imellem de enkelte molekyler, og udfældning vil ikke finde sted. Ligeledes, hvis der er for meget antigen til stede, vil der være for få antistoffer til at kæde molekylerne sammen, se figur 5.

    Der er yderligere lavet en udvikling af denne metode kaldt dobbelt immundiffusion, hvor både antistof og antigener tilsættes to brønde ved siden af hinanden og diffundere mod hinanden. Der, hvor diffusionen resulterer i ækvivalens af både antigen og antistof, vil der formes en linje mellem de to brønde, som kan visualiseres med farvestof.

    I begge tilfælde kræves det, at man har en standardprøve, således at man kan relatere diameteren af cirklen i immundiffusion og linjen i dobbelt immundiffusion til en bestemt koncentration af antistof. Standardprøven laves ved at lade kendte koncentrationer af antigen (eller antistof der kan bindes til de anvendte antistoffer) diffundere i gelen og tegne en graf over de målte diametre.

     

    Læs mere:

    Du kan læse om blodets AB0-system ved at klikke her http://www.netbiologen.dk/immum/abo.html

    Figur 7. Figuren viser princippet i dobbelt immundiffusion, hvor antigen og antistof diffunderer mod hinanden i en gel.

    Immundiffusion

    Immundiffusion benytter princippet om udfældning af store antigen-antistof-komplekser. I denne metode anvendes dog ikke flydende medier, men antistoffer inkorporeret i eksempelvis agar i en petriskål. I midten af skålen laves et hul, hvor agaren udtages, og i dette hul kan en farvet opløsning af antigen tilsættes. Antigenet vil nu diffundere ud i gelen og bindes til antistofferne.

    Der, hvor antigenerne er diffunderet ud, og koncentrationen er i antigen-antistof-ækvivalenszonen, vil store antigen-antistof-komplekser formes. Det vil kunne ses som en farvet ring omkring det hul, hvor antistoffet er tilsat. Denne ring er i figur 6 kaldt P.

    Figur 6. Figuren viser et immundiffusion-forsøg, hvor antigen er tilsat en brønd i midten. Antigenet vil diffundere ud i gelen, som indeholder antistof. Størrelsen af zonen (vist ved P) giver et indtryk af, hvor meget antigen, der var til stede i prøven.

    Figur 5. Figuren viser princippet i udfældningsreaktioner, hvor kun en passende mængde antigen og antistof vil give en høj udfældning.

    Indtil 1953 var det lidt af en gåde, hvordan hver af vores små celler kan opbevare al den information, som kræves for at danne alle de mange proteiner, enzymer, hormoner osv. der skal til for at forme et helt menneske. Men efter mange forskellige forsøg, hvor man langsomt nærmede sig en fyldestgørende ide omkring dette, lykkedes det for forskerne Watson og Crick at komme frem til en struktur for vores arvemateriale: DNAet.

    Hvis du har brug for at få opfrisket din viden om DNA og genetik, kan du klikke ind på følgende animationer, inden du læser om den måde, hvorpå immunforsvarets celler sikrer, at der bliver dannet en mangfoldighed af antistoffer.

     

    Dannelse af immunoglobuliner

    Inden de færdige antistoffer er dannede i cellen, sker der en masse modifikationer af DNA’et og RNAet. Eksempelvis klippes introns fra, da der findes mange af disse i hvert gen hos eukaryoter. Men under dannelsen af immunoglobuliner sker der også helt unikke reaktioner, som er grundlaget for, at der opstår en stor variation i antistofferne. Disse reaktioner er nødvendige for, at der kan eksistere tilstrækkelig mangfoldighed blandt antistofferne, således at alle tænkelige antigener kan genkendes og elimineres.

    For nogle årtier siden blev det opdaget, at i de celler, som ikke tilhører blodets hvide blodlegemer eller lymfoide celler, antistoffernes forskellige gensekvenser findes langt fra hinanden. I antistofproducerende celler blev det derimod vist, at de forskellige dele af antistofmolekylerne, de variable og konstante sekvenser, sidder meget tættere på hinanden. Det ledte videnskaben til den konklusion, at et sted der under transformationen til at blive en antistofproducerende celle, sker en omrokering af cellens DNA.

    B-cellerne, som er de antistofproducerende celler, dannes fra stamceller i knoglemarven og modnes heri. Når de forlader knoglemarven og bevæger sig over i lymfesystemet, findes de som umodne B-celler, der har et bestemt antistof siddende på overfladen. Ved mødet med det antigen, som genkendes af de membranbundne antistoffer, modnes cellen og aktiveres, hvilket er beskrevet i afsnittet om immunforsvaret.

    Inden B-cellerne forlader knoglemarven, sker der betydelige ændringer i deres DNA, som koder for antistoffer. Som det ses af figuren, består DNA’et for antistofferne af en lang række forskellige L-, V-, J-, D- og C-sekvenser. Hver type sekvenser befinder sig i såkaldte multigen-familier. For hvert antistof produceret, er det dog kun en af hver af disse sekvenser, der er tilbage i det RNA, som bliver translateret, og der må derfor foregå en lang række modifikationer. Tilstedeværelsen af disse multigen-familier gør, at der er mange kombinatoriske måder, hvorpå generne kan omarrangeres. Det skyldes, at hvert ”færdigt” gen kun indeholder en af hver af sekvenserne. Således estimeres det, at der for de tunge kæders variable del findes 51 V-sekvenser, 27 D-sekvenser og 6 J-sekvenser, hvilket bringer de kombinatoriske muligheder op på 8262. Der er også mange muligheder for de lette kæder, hvilket yderligere øger diversiteten, idet enhver tung kæde kan sættes sammen med alle de mange lette kæder.

     

    Omarrangering af gener for de tunge og lette kæder

    Generne for de tunge kæders variable dele er det første led i omarrangeringen af DNA’et. De tunge kæders gener består af L-, V-, J-, D- og C-sekvenser. L-sekvenserne er såkaldte leder-sekvenser, der fører begge kæder gennem det endoplasmatiske retikulum. L-sekvenserne fjernes, før antistoffet sammensættes og er derfor ikke at finde herpå. Se nedenstående videosekvens.

    Figur 1. Øverst er vist hvordan DNA’et for den korte kæde ser ud, og nederst er DNA’et for den lange kæde vist.

    Det første, der sker, er at en tilfældig D-sekvens sættes sammen med en J-sekvens, hvorefter denne D-J-sekvens sættes sammen med en tilfældig V-sekvens. Denne V-D-J-sekvens koder for den variable del af den tunge kæde og transkriberes til RNA sammen med generne for de konstante sekvenser (C). Hver af de fem typer af antigener har deres egen sekvens for de konstante dele af kæderne – disse transkriberes alle sammen med V-D-J-sekvensen, og det er først under RNA-forarbejdning, at alle, bortset fra en af C-sekvenserne, fjernes. De unødvendige C-sekvenser i RNA’et klippes fra, således at der kun translateres en sammenhængende V-D-J-C-sekvens.

    Generne for den lette kæde indeholder en sekvens mindre end den tunge kæde, idet D-sekvenserne ikke findes heri. Derved sættes først en tilfældig V-sekvens sammen med en tilfældig J-sekvens, og alt hvad der findes efter denne J-sekvens. Herefter transkriberes dette omarrangerede DNA til RNA. I RNA’et klippes overskydende J- og C-sekvenser ud, således at det færdigt mRNA-produkt indeholder en L-V-J-C-sekvens, hvor V-J-delen er den variable del, og C-sekvensen er den konstante del.

    Med de forskellige sekvenser, der eksisterer i genomet, og den omarrangering, der finder sted ved udvikling af cellerne, skønnes det, at der er mulighed for på denne måde at danne 8262 forskellige tunge kæder og 320 forskellige lette kæder. Antages det, at enhver kombination af let og tung kæde kan forekomme, giver det en samlet kombinatorisk diversitet på 2.644.240 forskellige antistoffer!


    Somatiske hypermutationer

    Der eksisterer yderligere en mekanisme, der er med til at skabe en endnu større diversitet af antistofferne. Det er somatiske hypermutationer, der som navnet antyder, er mutationer der forekommer med en særlig høj rate. Normalt sker der omkring 10-8 mutationer pr. basepar pr. generation, men for antistof-generne er det så mange som 10-3 pr. basepar pr. generation. Mutationerne er rettet mod de omarrangerede gener for de variable sekvenser, dvs. V-J og V-D-J-sekvenserne, og på baggrund af den kendte længde af disse gener estimeres det, at der introduceres mindst en mutation pr. to celledelinger.

     

    Ekskludering af allel

    Som alle andre af kroppens celler er B-celler diploide, dvs. de har to sæt af sine kromosomer. Det giver mulighed for, at der dannes to forskellige antistoffer fra en B-celle (et fra hvert kromosom der indeholder hvert sit antistof-gen). Der dannes imidlertid kun et enkelt antistof pr. B-celle. Dette sker ved allel ekskludering, som sikrer, at der altid kun omarrangeres én funktionel V-D-J-og V-J-sekvens. Det er altså de variable gener, der er underlagt denne ekskludering. Allel ekskludering sker formentligt også ved dannelsen af en funktionel tung kæde. Ved succesfuld omarrangering sendes et signal til B-cellen om at stoppe videre omarrangering af den tunge kæde fra det andet kromosom. Når en let kæde succesfuldt er omdannet, sendes ligeledes signal om, at der ikke skal ske yderligere omarrangering af de lette gener fra det andet kromosom. Sker der ingen succesfuld omarrangering af kæderne, vil cellen dø ved apoptose.

     

    Vil du læse mere?

    • Læs om Mendels forsøg, om DNA og om genetik her.

    • Du kan finde en oversigt over alle aminosyrerne her.

    • Du kan læse om nedarvning af gener fra sundhedsguiden her.

  • Øvelser

    Elevopgaver er: Dobbelt immundiffusion og ELISA.

    Lærervejledning til forsøg kan findes her: Lærervejledning.

    ELISA forsøg – Koppe-virus udbrud på dansk gymnasium

    Du befinder dig på et gymnasium hvor der er konstateret udbrud af kopper bland flere elever på mange klassetrin. Koppe-virus smitter, som du kan læse om i teoriafsnittet om virus og bakterier, ved dråbeinfektion. I fredags var der fest på skolen hvor du var med og delte drikkevarer med en masse af dine venner og generelt havde meget tæt omgang med en masse mennesker. Du har således været i kontakt med mange mennesker på en måde hvor sygdommen kan overføres. Er du blevet syg?

    Er man blevet smittet med koppe-virus kan en vaccination inden for 2-3 dage modvirke udbrud af koppe-virus så det er derfor nødvendigt med en metode der hurtigt kan undersøge for koppe-virus. Da der kan være bivirkninger ved vaccinationen er det vigtigt at man ikke giver den til personer som ikke er smittede.

    I dette forsøg skal din klasse ”blande kropsvæsker”, som er involverede i overførsel af sygdommen, og følgelig kontrollere hvem der er blevet smittet ved kontakt med hinanden. Herefter skal I forsøge, ved at afdække smittevejen, at finde frem til hvem der indførte sygdommen på skolen.

    Prøver fra hver person bliver undersøgt med en ELISA test som du kan læse mere om i teoriafsnittet om immunkemiske metoder. I skal teste for tilstedeværelsen af antigener fra koppe-virus i jeres prøver og dette gøres ved at I anvender antigener fra ”koppevirus” som er at finde i et test-kit I vil få udleveret fra jeres lærer.

     

    Dobbelt immundiffusions forsøg

    For et par dage siden var din klasse til fødselsdagsfest med fin middag og alt hvad der dertil hører. Til dessert blev der serveret en lækker chokolademousse som de fleste af jer spiste med stor fornøjelse.

    Men lige pludseligt bliver en af dine klassekammerater utilpas og hæver kraftigt op i svælget og får derved vejrtrækningsproblemer. Personen bliver straks kørt på hospitalet og senere bliver det her konkluderet, at personen lider af allergi overfor æg.

    Allergi overfor æg er blot en af de fødevareallergier mange danskere lider af. Fødevareallergi vil, ved kontakt med de indholdsstoffer som man ikke kan tåle, udløse en reaktion der kan have forskellige symptomer som kløe på hud og i øjne, astmasymptomer samt kraftige mavesmerter med opkast og diarré i slemme tilfælde.

    Der findes utroligt mange fødevarer der indeholder bestanddele fra æg og det er ikke altid helt åbenlyst hvilke det drejer sig om.

    I denne øvelse skal du derfor teste forskellige fødevarer for indhold af æg så din stakkels klassekammerat ved med sikkerhed, hvad der kan spises og hvad der bør udelades.

    Metoden du skal anvende er dobbelt immundiffusion, som er beskrevet i afsnittet om immunkemiske metoder. Her vil du anvende antistoffer overfor æg og direkte teste forskellige fødevarer på en agarose gel hvor antistofferne og antigenerne vil have mulighed for at diffundere mod hinanden og danne en udfældningslinie.

  • Artikler

    Den danske biotekvirksomhed Symphogen har udviklet en metode til at fremstille en ny type lægemiddel, der kan forebygge og behandle så komplekse sygdomme som cancer, allergier og infektionssygdomme.

     

    Forskerne har kigget miltbrand i kortene

     

    Genvåben spøger i kulissen

     

    Dansk chip kan slå alarm mod bio-terror

    Novi-selskabet Thomsen Bioscience har sammen med dansk, svensk og canadisk forsvar udviklet en chip, der kan detektere farlige sygdomme i luften. 5000 chip er tilstrækkeligt til at dække hele Danmark.

     

    Tarmsystemets bakterier beskytter sig mod angreb fra det menneskelige immunforsvar ved at camouflere sig med sukkermolekyler.

     

     

     

    Livet var hårdt på den tidlige Jord

     

    På denne side finder du forskellige videnskabelige artikler der har relation til teorien i dette projekt.
    Søger du selv på nettet vil du kunne finde al viden om immunologi og kunne læse om nyeste forskningsgennembrud.
    Kendetegnet for immunologien og biologi generelt er, at udviklingen går så stærkt, at man oftere søger information i publicerede artikler end i bøger.

    Kræft og Immunsystemet

     

    DNA pakning

  • Det Virtuelle Laboratorium 2.0

    Til dette projekt er der tilknyttet en laboratorieøvelse i Det Virtuelle Laboratorium 2.0: “Produktion af antistoffer”. Her kan du prøve kræfter med eksperimentel genteknologi i et laboratorium, der er bygget op ligesom et professionelt bioteknologisk laboratorium. Uddybende information om laboratoriet og procedurer kan findes her.

    Prøv laboratoriet her.

    Arbejde i klassificerede laboratorier

    Når der arbejdes i genteknologiske laboratorier er der en række regler der skal overholdes, for at sikre at genmodificerede organismer ikke kommer ud af laboratoriet. Bl.a. skal man altid bære kittel, bortskaffe affald i særlige affaldsspande og borde og materiale skal desinficeres efter brug. Samtidig er det meget vigtigt at de forsøg der udføres ikke bliver ødelagt ved at DNA eller de bakterier man har på fingrene og tøjet ikke blandes ned reagensglassene.

    Arbejde med gær/bakterier foregår ofte i sterilskab, men især ved brug af antibiotika er det fint på bordet. Når man arbejder med vækstmedium er det vigtigt at sørge for at omgivelserne er sterile, f.eks. ved at bruge et sterilskab. De bakterier man selv har på hænderne, i tøjet og alle andre steder gror lige så godt i vækstmedie og på agarplader som de bakterier eller gærceller man gerne vil dyrke i laboratoriet, og kan derfor nemt komme til at forurene kulturen. Hvis man tilsætter antibiotika til vækstmediet og agarpladerne, kan man slå alle de organismer ihjel som ikke er resistente over for netop dét antibiotika. På den måde sørger man for at kun de gensplejsede bakterier eller gærceller vokser på mediet, og det er ikke så vigtigt at bruge et sterilskab.

     

    Dyrkning af bakterier og gærceller

    For at undgå at få genmodificerede bakterier, som er resistente over for en eller flere former for antibiotika, spredt til resten af laboratoriet, holder man ofte bakterierne i et rum for sig selv.  Se arbejdstilsynets regler (LINK Se under “Arbejde med GMO’er”).

     

    Antibiotika i agarpladen

    De fleste antibiotika-typer støbes ind i agarpladen for at opnå ensartet koncentration i hele pladen. Enkelte andre spredes ud oven på den færdige plade og tørrer ind før man tilsætter bakterier eller gærceller. Man tilsætter aldrig celler og antibiotika samtidig – det er kun her og kun for at illustrere at der skal tilsættes antibiotika.

     

    UV-lampe

    Normalt holder man ultraviolet (UV) lys bag beskyttende plexiglas. UV lys er lys med en bølgelængde som er kortere end for synligt lys, men længere end for røntgenstråling, dvs. 10-400 nm. Selvom det ikke er synligt kender de fleste det fra sollys, hvor det kan forbrænde ens hud hvis man opholder sig for længe i solen uden solcreme eller dækkende tøj. Øjnene kan også tage skade. Det gælder også i laboratoriet, og det er derfor vigtigt kun at tænde UV lampen i kort tid og at beskytte hud og øjne imens den er tændt.

     

    Varmeskab versus rysteinkubator

    Når man opformerer bakterier eller gær i flydende medium, skal man sørge for at der kan komme luft til hele opløsningen. Derfor bruger stiller man normalt en lille maskine der kan ryste reagensglasset ind i varmeskabet, så opløsningen bliver iltet.

     

    Der er IKKE genmodificerede organismer i vaskepulver og insulin

    Selvom der anvendes genmodificerede organisme til at producere proteiner såsom insulin og vaskeenzymer, er der ingen genmodificerede organismer i det færdige produkt. Under proteinoprensningen fjernes alt andet end det ønskede protein fra opløsningen, og renheden af produktet testes meget grundigt. Se Arbejdstilsynets regler (LINK– se under ”Hvad er GMO?”)

     

    GMO-affald

    GMO-affald må ikke lægges i den almindelige skraldespand, men skal opsamles i særlige beholdere mærket så man kan se at der er GMO i. Både flydende og fast affald skal desinficeres eller autoklaveres, dvs. varmes op til mindst 121°C under højt tryk, før det må behandles som almindeligt affald, hvilket normalt sker på specielle anlæg. Se arbejdstilsynets regler (LINK) – se under ”Affald og spild”.

     

    Musebur i laboratoriet

    Det er bedst at holde alle forsøgsdyr i separate lokaler/dyrestalde, så man ikke risikerer at udvikle forsøgsdyrsallergi. Dyrene holdes derfor normalt ikke i de laboratorier, hvor man udfører andre slags forsøg.

     

    Test af lægemidler i dyr

    Når der produceres lægemidler til mennesker, er man nødt til at være helt sikker på at de ikke har uventede bivirkninger, og hvor meget af lægemidlet der er nødvendigt for at få den ønskede effekt. Man kan ikke få svar på dette ved kun at teste stoffet i cellekulturer. Derfor er det nødvendigt at teste al ny medicin i dyr, før det prøves på mennesker. For at kunne arbejde med dyr skal man leve op til lovens krav om uddannelse (https://www.retsinformation.dk/Forms/R0710.aspx?id=1138 og  https://www.retsinformation.dk/Forms/R0710.aspx?id=2629) og have tilladelse til det hos Dyreforsøgstilsynet, som hører under justitsministeriet. Samtidig skal loven om dyreforsøg overholdes (https://www.retsinformation.dk/forms/r0710.aspx?id=2862), der bl.a. skal sikrer at dyrene ikke har smerter eller er angste undervejs, og at forsøget ikke lige så godt kunne udføres i cellekulturer.

    Der er også specifikke lovkrav for at arbejde med eller fremstille genetisk modificerede dyr (https://www.retsinformation.dk/Forms/R0710.aspx?id=2116).

     

    Vaskemaskine

    Normalt ville man sætte vaskemaskinen i et andet rum for at undgå at den kommer i kontakt med genmodificerede organismer (GMO). Det færdige proteinprodukt indeholder som beskrevet ingen genmodificerede organismer, og det er derfor ikke nødvendigt at have en genteknologisk klassificeret laboratorium til at teste produktet. Se Arbejdstilsynets regler (LINK– se under ”Hvad er GMO?”).

null

Projektet er udarbejdet af Anne Louise Frost og opdateret af Anders Handrup Kverneland. Anders studerer medicin på Københavns Universitet.

Anders Handrup Kverneland

null

Ib Søndergaard er medlem af Research Council ved Institut for Systembiologi og har været sparringspartner på denne artikel.

Ib Søndergaard

null

Henriette Schjønning Nielsen har været sparringspartner på denne artikel.

Henriette Schjønning Nielsen

null

Peter Sejer Andersen er Senior Scientist hos Symphogen A/S og har været sparringspartner på denne artikel.

Peter Sejer Andersen

null

Martin Ørgaard har været sparringspartner på denne artikel.

Martin Ørgaard

null

Institut for Systembiologi har Danmarks største biovidenskabelige og bioteknologiske forskning på universitetsniveau.
Instituttet har været partner og sponsor på projektet.

Institut for Systembiologi