Genetisk tuning af cellefabrikker

Celler regulerer, hvilke gener der er aktive, og denne genregulering kan udnyttes til genetisk at tune cellefabrikker til øget produktion af et ønsket stof. Indsatte gener kan udtrykkes med meget forskellig styrke, men øget viden om genregulering gør det muligt at skrue op for ønskede gener og ned for uønskede. Her gennemgås, hvordan gener kan reguleres, samt hvordan produktionen også kan forbedres ved at optimere vækstbetingelser som temperatur og næringskoncentration. I praksis kombineres disse metoder ofte.

Genetisk optimering handler grundlæggende om at øge proteinproduktionen fra det kodende gen ved at påvirke reguleringen af både transskription og translation. Da celler er komplekse systemer, kræver optimering løbende overvejelser og eksperimenter.

Genregulering – Genernes tænd/sluk-knapper

Mange gener er kun nødvendige i særlige situationer og kræver derfor en stram regulering af deres ekspression. Nogle bakterier bærer for eksempel selvmordsgener, som naturligvis ikke må udtrykkes under normale forhold, mens andre gener indgår i forsvar mod varmechok og derfor kun aktiveres ved høje temperaturer.

I flercellede organismer styrer genregulering også cellernes specialisering. Det iltbærende protein hæmoglobin dannes for eksempel i røde blodceller, men ikke i hudceller, hvor det ikke har nogen funktion.

Som figur 12 viser, vil DNA’et for ét gen typisk indeholde mange flere elementer end blot den proteinkodende region. Også de omkringliggende elementer deltager i genreguleringen.

Figur 12. Oversigt over nødvendige, regulerende dele for gen-ekspression. RBS: Ribosombindingssted. ATG: Startcodon. TAG: Stopcodon.

Promoter

Når et gen skal udtrykkes, aktiveres transkriptionen fra DNA til mRNA, som derefter oversættes til protein. Foran den proteinkodende sekvens ligger en promoter, som hjælper med at starte transkriptionen. Nogle gener har stærke promotere og er altid aktive, mens andre kun aktiveres under særlige forhold, f.eks. varmechok.

Promotere virker ved at binde transkriptionsfaktorer, som guider RNA-polymerase til DNA’et, så transkriptionen kan begynde. En sådan faktor kaldes også en aktivator.

I genetisk optimering af en cellefabrik vælges ofte en kraftig promoter for høj proteinproduktion.

  • En konstitutiv promoter er altid aktiv, men kan belaste cellen i vækstfasen.

  • En inducibel promoter aktiveres kun under bestemte fysiske eller kemiske forhold og er nyttig, hvis proteinet er giftigt eller ressourcetungt.

Terminator

En terminator er en DNA-sekvens, der markerer afslutningen på et gen. Den får RNA-polymerase til at stoppe transkriptionen og frigive det færdige mRNA. Terminatoren sikrer dermed, at genet aflæses korrekt og ikke fortsætter ind i efterfølgende DNA-sekvenser.

Ribosombindested (RBS)

Translationen af mRNA til protein kan også øges genetisk. Foran den proteinkodende sekvens på mRNA’et, dvs. før startcodonet, findes et ribosombindingssted (RBS). Selvom RBS’er er forskellige hos prokaryoter og eukaryoter, har de samme funktion: at binde ribosomet, så proteinsyntesen kan begynde. Ved at vælge et passende RBS kan ribosombindingen forbedres, hvilket øger effektiviteten af translationen og dermed mængden af produceret protein.

Start- og stopcodon

Det første codon, der translateres til et protein, er altid startcodonet med mRNA-koden AUG. AUG koder for aminosyren methionin (i mRNA erstattes T i DNA af U), og i princippet begynder alle proteiner derfor med methionin. Tre af de 64 mulige codons koder ikke for en aminosyre, men fungerer som stopcodons. Codonerne UAG, UGA og UAA får ribosomet til at afslutte translationen af mRNA’et og dermed proteinsyntesen (figur 19). Start- og stopcodons fortæller altså ribosomet, hvor proteinsyntesen skal begynde og slutte.

Øget genudtryk med flere kopier

Hvis et gen findes i flere kopier i cellen, kan der dannes mere mRNA, hvilket øger den endelige proteinproduktion. Når genet sidder i en ekspressionsvektor, bestemmes antallet af kopier af Ori-sekvensen (Origin of replication) i vektoren. DNA-replikation starter ved Ori, og der findes både svage og stærke Ori-sekvenser. Nogle giver kun én kopi pr. celle, mens stærke Ori kan give op til omkring 200 kopier.

Man skal dog være opmærksom på, at produktion af mange kopier kan hæmme cellens vækst, så en kraftig Ori-sekvens ikke nødvendigvis fører til højere proteinproduktion.

Andre optimeringer

Der findes mange måder at optimere en cellefabrik på, og adskillige faktorer kan reguleres eller ændres for at forbedre produktionen. To eksempler er codon-optimering, hvor genets codons tilpasses værtscellens præferencer for at øge proteinproduktionen, og brugen af HIS-tag, som gør proteiner lettere at oprense.

Codon-optimering

 

Optimering til oprensning: His-tag

Genetisk optimering for at lette efterfølgende oprensning kan være en fordel, da gevinsten ved højt DNA-udtryk kan gå tabt, hvis proteinet er svært at oprense. I bakterien Escherichia coli og andre prokaryoter kan man tilføje et His-tag til proteinet. Et His-tag består af mindst seks histidin-aminosyrer, som sættes på som en hale på proteinet og gør det lettere at isolere under oprensningen. Codons for histidin-halen indsættes i DNA’et, så tagget automatisk kobles til proteinets ene ende.

Histidin binder til metalioner som Ni²⁺ eller Zn²⁺, og en række histidiner i enden gør det muligt at fastholde proteinet på et net af nikkel-ioner i oprensningsvæsken, som illustreret i Figur 13.

Figur 13.Oprensning af protein med His-tag. His-tagget binder proteinet til et nikkelgitter, mens resten af væsken passerer igennem. Produktet frigives derefter ved at tilsætte fri histidin, som konkurrerer om bindingen til nikkelgitteret.