Cellefabrikker

Naturen indeholder mange nyttige stoffer og proteiner, f.eks. medicin eller miljøvenlige enzymer, men ofte kan de ikke udvindes i tilstrækkelige mængder. Derfor bruges cellefabrikker. Cellefabrikker skabes ved at flytte gener, der koder for et interessant stof, til en mikroorganisme, som derefter producerer stoffet sikkert og i store mængder. Her gennemgås designet af en ny cellefabrik, som kan afprøves i Det Virtuelle Laboratorium.

Celler er eksperter i at producere biologiske stoffer

Genteknologi kan anvendes til at omdanne en mikroorganisme til en cellefabrik, som kan producere store mængder af et værdifuldt biologisk stof (Figur 5). Stoffet kan have medicinske eller miljømæssige fordele eller være et naturligt stof, som forskere har forbedret.

De celler, der bruges som cellefabrikker, er oftest gensplejsede med gener fra en fremmed organisme, som naturligt producerer det ønskede stof. Disse gener kan aflæses af værtscellen som instruktioner til at danne stoffet, da generne koder for de enzymer, der er ansvarlige for produktionen.

Figur 5. En cellefabrik omdanner simple næringsstoffer som f.eks. glukose til værdifulde produkter.

Cellefabrikker er attraktive, fordi mange værdifulde stoffer kun dannes naturligt i meget små mængder eller under ekstreme forhold, når der ikke bruges cellefabrikker. Samtidig kan kemisk produktion være både dyr og miljøbelastende, da den ofte kræver oliebaserede råstoffer og høje temperaturer. Ved at designe en cellefabrik kan celler i stedet producere stoffet under milde betingelser, hvor de blot skal have ilt, næring og passende temperatur. Et kendt eksempel er penicillin, som produceres af en svamp. Siden 1930’erne har kemisk produktion været forsøgt, men cellefabrikker er fortsat den mest effektive metode og er blevet yderligere forbedret med genteknologi. Genet for produktet transkriberes i cellen fra DNA til mRNA og translateres til et protein, som om det var cellens eget. Derfor er cellefabrikker særligt velegnede til at producere komplekse proteiner og biologiske stoffer og er i nogle tilfælde den eneste realistiske løsning.

Rekombinant produktion

Cellefabrikkers arbejde kaldes rekombinant produktion, fordi de anvendte organismer har fået ændret deres genetiske sammensætning. Siden midten af 1980’erne har teknologien haft stor betydning, blandt andet ved produktion af insulin, som tidligere blev udvundet fra svin og køer. Denne metode var både besværlig og kunne give allergiske reaktioner, da animalsk insulin ikke er identisk med humant insulin.

I dag producerer gensplejsede mikroorganismer insulin, væksthormon og mange andre proteiner sikkert og i store mængder. Et andet eksempel er hormonet erythropoietin (EPO) (Figur 6), som stimulerer dannelsen af røde blodceller og bruges i behandlingen af blodmangel. Rekombinant produktion har også stor betydning for forskning, da den gør det muligt hurtigt at fremstille store mængder af specifikke proteiner. Det giver forskere bedre mulighed for at undersøge proteiners struktur og funktion.

Figur 6. 3D-struktur for det menneskelige protein erythropoietin (EPO) fundet efter rekombinant produktion i bakterien Escherichia coli. Kilde: RCSB PDB (1BUY) og Cheetham, J.C. et al. 1998, se referenceliste. Udforsk proteinet i 3D her.

Ruten til design af en cellefabrik

Trinnene vises i figur 7 og beskrives nærmere i de følgende afsnit. Tryk på de enkelte trin for at læse mere om de forskellige skridt og teknikker.

Figur 7. Oversigt over design og brug af cellefabrikker: Genet for det ønskede produkt bestemmes (1) og indsættes i en ekspressionsvektor (2), som transformeres ind i en passende celletype (3). Korrekt gensplejsede celler udvælges, dyrkes i fermentering, og det færdige protein oprenses, så produktets renhed sikres (4). Trinnene beskrives nærmere i det følgende afsnit.

1. Find det proteinkodende gen, som koder for det ønskede produkt (tryk for at udvide)

Design af en cellefabrik går ud på at indsætte et fremmed gen i en celle, så den effektivt kan producere et bestemt protein. Udgangspunktet er proteinets aminosyresekvens, som ved hjælp af den genetiske kode kan omsættes til en mulig DNA-sekvens. Den genetiske kode angiver, hvilke codons – tripletter af tre nukleotider – der koder for de enkelte aminosyrer; for eksempel koder codonet GTG for aminosyren valin (se figur 8). Da der findes 64 forskellige codons, men kun 20 aminosyrer, kan flere codons kode for den samme aminosyre. Det betyder, at et protein kan være kodet af flere forskellige DNA-sekvenser. Når genomet for en organisme allerede er kortlagt, kan man derfor ofte finde det naturlige gen direkte i DNA’et, men ved syntese af et gen kan man også vælge mellem forskellige codons uden at ændre proteinets aminosyresammensætning.

Det første codon i et gen skal være startcodonet ATG, som fortæller cellen, hvor proteinkoden begynder. Når proteinet er færdigt, stopper syntesen ved et stopcodon, for eksempel TAG. Start- og stopcodons, sammen med genets protein-kodende område, aflæses til mRNA under transkriptionen, inden proteinet dannes. Ud over start- og stopcodons findes der regulerende DNA-sekvenser på genets ydersider, som hjælper med at aktivere transkriptionen. Disse regulerende sekvenser koder ikke for selve proteinet (se Figur 9).

Figur 8. Et proteins aminosyresekvens (med ét-bogstavsforkortelser) øverst slås op i den genetiske kode, hvorefter det kan oversættes tilbage til det DNA, der koder for det. ATG er f.eks. startcodon og koder for aminosyren methionin (M), mens TAG er stopcodon (koder ikke for nogen aminosyre, men stopper translationen).

Figur 9. Et gen er bygget op af forskellige områder. Codons består af tre nukleotider. Det protein-kodende område består af mange codons.

2. Tilføj DNA-sekvenser, der aktiverer og regulerer genet (tryk for at udvide)

Genets proteinkodende område (fra start-codon til stop-codon) er, som nævnt, ikke tilstrækkeligt til at få cellen til at producere det kodede protein. Foran dette område skal der være et aktiverende element, og efterfølgende et element, der afslutter genets aktivitet. Disse regulerende områder kaldes promoter, ribosombindingssted (RBS) og terminator (se nærmere i artikel 3 Genetisk tuning).

For nemt at kunne koble et nyt gen sammen med disse nødvendige hjælpesekvenser findes der en række færdiglavede ekspressionsvektorer. De er cirkulære DNA-molekyler (plasmider) og indeholder netop de ekstra sekvenser, der passer til den valgte produktionsorganisme og sikrer et effektivt genudtryk. Genet skal derfor blot indsættes i ekspressionsvektoren (figur 10).

I det virtuelle laboratorium skal du selv designe det DNA, der skal indsættes i ekspressionsvektoren, og indsætte de forskellige regulerende hjælpesekvenser.

Figur 10. En ekspressionsvektor er et cirkulært DNA (plasmid), der indeholder de nødvendige elementer til at udtrykke et ønsket gen i en celle. Det blå element viser genet samt regulerende sekvenser som promoter, ribosombindingssted (RBS) og terminator. Selektionsmarkør og replikations-origo (ori) sikrer henholdsvis udvælgelse og kopiering af plasmidet. De enkelte dele forklares nærmere i artikel 3 Genetisk tuning.

3. Vælg en celletype, der kan producere proteinet korrekt (tryk for at udvide)

Når man laver en cellefabrik, skal man vælge en celle, der skal producere proteinet. Ofte bruges enten bakterier, svampe eller pattedyrsceller, og hver type har sine fordele og ulemper.

Bakterier er små, simple og hurtige at arbejde med. De mangler dog det nødvendige indre maskineri til avancerede proteinmodifikationer. Proteinet kan f.eks. foldes forkert, eller der kan mangle sukkergrupper (glykosylering), som ofte er vigtige for medicinske proteiner. Produktionen foregår intracellulært, hvilket betyder, at proteinet bliver inde i cellen og skal udvindes fra cellen, hvilket kan gøre oprensningen vanskeligere. Almindelige produktionsorganismer er Escherichia coli og Bacillus subtilis.
Svampe har mere komplekse celler med bl.a. et endoplasmatisk reticulum, hvor proteiner kan foldes korrekt og modificeres, f.eks. ved glykosylering. Proteinerne bliver sekreteret til mediet (extracellulært), hvilket gør oprensningen lettere. Et eksempel på en svampecelle, der ofte bruges som cellefabrik, er bagegæren Saccharomyces cerevisiae.
Mammale celler bruges til produktion af medicinske proteiner, som kræver meget komplekse glykosyleringer, f.eks. EPO. Mammale celler, f.eks. fra hamster, efterligner menneskelig glykosylering bedst. Proteinerne bliver også sekreteret til mediet, hvilket forenkler oprensningen. Mammale celler er dog mere skrøbelige, langsomme og kræver omhyggelig pasning, ofte med dyrt serum i vækstmediet.

4. Skab DNA-sekvensen og indsæt den i cellen ved gensplejsning (tryk for at udvide)

Det nye rekombinante DNA, der skal indsættes i cellen, findes ikke færdigt i naturen. De enkelte DNA-sekvenser, såsom selektionsgen, promoter og den proteinkodende region, skal derfor sammensættes ved hjælp af genteknologi. Der findes flere metoder til dette. For eksempel kan det proteinkodende DNA indsættes i en færdig ekspressionsvektor ved hjælp af restriktionsenzymer og ligase.

I forskning og udvikling, hvor tid ofte er en begrænsende faktor, er det siden slutningen af 2000’erne blevet økonomisk realistisk at bestille hele den færdigsamlede DNA-sekvens. Sekvensen syntetiseres kemisk af specialiserede firmaer. I det virtuelle laboratorium vil hele det designede DNA blive fremstillet på denne måde.

Indsættelsen af DNA i cellen kan ske på flere måder, men fælles for dem er, at cellemembranen gøres gennemtrængelig, så DNA’et kan diffundere ind i cellen. Optagelsen af fremmed DNA kaldes transformation. I det virtuelle laboratorium anvendes elektroporation som transformationsmetode, hvor cellerne udsættes for et kortvarigt, kraftigt elektrisk felt. Der findes dog også andre metoder til at få celler til at optage fremmed DNA.

5. Tjek, at gensplejsningen er korrekt ved selektion og screening (tryk for at udvide)

Det er sjældent muligt at se på en celle, om den er gensplejset. Derfor bruges selektion til at udvælge de korrekt transformerede celler, og DNA-sekventering kan anvendes for at sikre, at indsættelsen er sket som planlagt.

Kun meget få celler optager faktisk DNA’et efter en gensplejsning. For at undgå at arbejde videre med upåvirkede celler efterfølges transformationen derfor af en selektion. Selektion betyder, at kun de gensplejsede celler kan overleve. Dette opnås ved hjælp af et selektionsgen, som sidder i ekspressionsvektoren (figur 10). Selektionsgenet giver de korrekt transformerede celler en overlevelsesfordel, f.eks. resistens over for et antibiotikum. Ved selektion med antibiotika udplades cellerne på en petriskål med antibiotikaholdigt medium, hvor kun de transformerede celler kan vokse. En cellekoloni, der vokser frem, er derfor med stor sandsynlighed gensplejset (figur 11).

Selektionsgener bruges ikke kun til at udvælge transformerede celler, men også til at sikre, at cellerne bevarer DNA’et. Det kan nemlig ske, at ekspressionsvektoren ikke videregives til alle datterceller, da den replikeres uafhængigt af kromosomerne. Celler uden vektoren vokser ofte hurtigere, fordi de ikke belastes af produktion af overflødige proteiner, og kan derfor udkonkurrere de gensplejsede celler. Ved fortsat tilsætning af antibiotikum dør de celler, som har mistet DNA’et og dermed selektionsgenet.

Alternativt kan DNA’et indsættes direkte i cellens kromosom. Når DNA’et først er integreret i kromosomet, er risikoen for tab mindre, og i industrielle cellefabrikker foretrækkes denne metode ofte for at undgå brug af antibiotika. Ekspressionsvektorer anvendes typisk i indledende forsøg, mens kromosomal indsættelse bruges i færdige cellefabrikker.

En genetisk variant af en organisme kaldes en stamme, transformant eller mutant. Det kan endeligt bekræftes, at det ønskede DNA er indsat korrekt, ved DNA-sekventering af det ændrede område. Southern blotting kan også anvendes, men da prisen på DNA-sekventering er faldet markant, er sekventering ofte det foretrukne valg.

Figur 11. Kun de gensplejsede celler vil kunne gro på næringsplade med antibiotikum, fordi de har opnået et resistensgen i gensplejsningen.

Proteiner eller metabolitter

Cellefabrikker kan producere forskellige typer stoffer:

Proteiner: Dannet direkte ud fra den indsatte DNA-sekvens
Metabolitter: Mindre stoffer, dannet via enzymstyrede biokemiske reaktioner. Cellens DNA bestemmer, hvilke metabolitter der produceres, ved at kode for de nødvendige enzymer. I nogle tilfælde er det ikke det specifikke produkt, men selve cellemassen, der udnyttes. Et eksempel er dyrkning af havalger til biobrændsel.

6. Dyrk de korrekt modificerede celler i en fermentering for at producere proteinet i større mængder (tryk for at udvide)

Den nye genmodificerede organisme er i princippet allerede klar til at producere det rekombinante protein eller metabolit i store mængder. Men for at opnå det højeste udbytte eksperimenterer man typisk først i mindre laboratorieskala for at finde de optimale forhold. Mikroorganismer kan være krævende producenter, der for eksempel kun producerer nok, hvis de får lidt næring ad gangen eller oplever en bestemt pH-værdi. Årsagen til dette ligger ofte i cellens indre mekanismer, som hele tiden styrer de forskellige biokemiske reaktioner. Selvom disse mekanismer kan være komplicerede, er det nødvendigt at forstå dem for at udvikle en effektiv “cellefabrik”.

Den produktion, der foregår, mens mikroorganismerne dyrkes, kaldes fermentering (eller gæring). Den sker som regel i tanke, der kan variere fra en halv liter i laboratoriet til op mod 200.000 liter i industrien.

7. Oprens og kontroller det færdige produkt for renhed og funktion (tryk for at udvide)

Når cellerne er færdige med at producere deres produkt, skal det værdifulde stof oprenses fra cellerester og andre dannede stoffer. Herefter skal det kvalitetstestes, inden det kan sælges.

Når en fermentering er afsluttet, høstes blandingen. Den består af tilbageværende næringssalte, celler og de metabolitter, cellerne har udskilt. Under fermenteringen kan produktet dannes enten intracellulært (inde i cellerne) eller ekstracellulært, hvor det bliver eksporteret ud af cellen. Derfor er det efter fermenteringen en vigtig udfordring at opnå en høj andel af produktet i tilstrækkelig renhed.

Kravet til renhed afhænger af produktet: Medicinske stoffer skal have meget høj renhed, mens industrielle produkter ofte kan accepteres med lidt lavere renhed. En lavere renhed kan være fordelagtig, fordi mindre produkt går tabt under oprensningen, og små urenheder ikke altid har betydning. Ved oprensning af enzymer kan eksempelvis op til 70 % gå tabt undervejs.

Design af en oprensningsproces kræver både viden om de biologiske og kemiske forhold for produktet og fermenteringsblandingen. Processen består typisk af flere trin, efter behov, hvor vigtige metoder er filtrering, centrifugering og kromatografi. Produktets renhed og kvalitet sikres til sidst med test, ofte ved kromatografisk udstyr.

Hvad sker der med cellerne (biomassen) efter fermenteringen?

Hvis de bliver slået ihjel med varmebehandling, kan de eksempelvis bruges som næringsrig gødning på markerne. Hvis produktet består kvalitetstesten, er det klar til pakning og salg, såfremt det har myndighedernes godkendelse.