• Elektrofysik

    Cellulær Elektrofysiologi

    Følgende undervisningsmateriale er under redigering, og nogle artikler vil da ikke være tilgængelige. 

    Læger og forskere har i mange år stået på bar bund, når de har skullet forklare, hvilke mekanismer der ligger til grund for udviklingen af mange kendte sygdomme som for eksempel epilepsi og cystisk fibrose. Manglende viden omkring sygdommenes opståen har gjort, at patienterne ikke kunne få en optimal behandling. Heldigvis er der i løbet af det sidste årti sket en stor udvikling inden for området, der viser, at mange af disse sygdomme skyldes en defekt i membrantransporten i kroppens celler.

    Den menneskelige krop styres af elektriske signaler der sendes mellem hjernen og nerve- og muskelceller i kroppen. Disse elektriske signaler styres af cellemembranen, som er den hinde der omslutter hver celle. Cellemembranen kan altså kontrollere hvilke signaler der sendes mellem hjernen og kroppen, og spiller en væsentlig rolle for funktionen af nerver og muskler, læring og hukommelse, kontrol af vand og salt balance og regulering af blodtrykket. Det er derfor tydeligt at defekter i denne membrantransport funktion vil have stor fysiologiske betydning.

    For at kunne forstå hvordan en defekt membrantransport kan føre til sygdomme, er det nødvendigt at have en forståelse for hvordan en celle er opbygget og hvordan den fungere. I de kommende artikler og tilhørende øvelser bliver cellen og cellemembranens funktion derfor gennemgået, vi ser på hvorledes de elektriske signaler udbredes i kroppen, og til sidst lærer vi om hvordan nogle sygdomme opstår og hvordan en cellemembran kan undersøges og nye lægemidler kan udvikles specifik mod bestemte sygdomme der har en defekt membranfunktion.

  • Teori

    Teori-materialet består af 6 artikler. Flere af artiklerne kan læses uafhængigt af hinanden, eller bruges som supplement til det traditionelle undervisningsmateriale.

    1. Cellen – kroppens fundament 
    2. Membrantransport – cellemembranens funktion og uddybning af membran kanaler
    3. Det elektriske kredsløb i fysiologiske rammer
    4. Aktionspotentiale og signaludbredelse i nervecellen
    5. Defekt membrantransport resulterer i sygdomme
    6. Målemetoder

    Med denne artikel laves der en kort opsummering af det elektriske kredsløb og hvorledes de forskellige komponenter i det afhænger og påvirker hinanden. Cellemembranens funktion er meget kompliceret men ved at sammenligne cellen med et elektrisk kredsløb er det muligt at forklare hvorledes cellerne kommunikere og fungere relativt enkelt.

    Elektricitet

    Vi kender elektricitet som noget der dagligt bruges til alt, lige fra at tænde lyset, fjernsynet og computeren. Men har du tænkt på at det faktisk også er elektricitet der styrer din hjerne og krop? Det er elektriske signaler der sendes mellem kroppens nerveceller der gør at du kan tænke og huske, samt udføre handlinger såsom at gå. Nervesystemet er i virkeligheden blot et elektrisk kredsløbs, som lader hjernen modtage signaler fra kroppens forskellige dele og sende andre signaler til arm, ben m.m.

    For at der kan løbe strøm kræver det et kredsløb der forener de forskellige komponenter, det er altså ikke nok kun at forbinde en pære med en strømkilde for at få den til at lyse, der skal også være en ledning der fører strømmen væk igen for at der skabe et sammenhængende kredsløb mellem pære, ledninger og batteri eller anden strømkilde.

    Strømstyrke

    Til at beskrive elektricitet bruges visse grundenheder. Strømstyrken betegnes amper (I). Strømstyrken vil være ens overalt i et uforgrenet kredsløb. Når f.eks. en pære er forbundet med et batteri i et simpelt kredsløb, og pæren er tændt og udsender lys, sker der en opvarmning af pæren, hvilket skyldes at pæren forbruger elektrisk energi. Energien som pæren bruger leveres af en spændingskilde, her batteriet. I takt med at pæren brænder tappes batteriet langsomt for energi, der overføres altså energi fra batteriet til pæren. Den energi bæres af den elektriske strøm der løber rundt i kredsløbet.

    Spændingsfald

    Energiomsætningen der finder sted i et kredsløb, kaldes spændingsfaldet (U), det måles i volt. Det er spændingsfaldet i kredsløbet der driver strømmen fremad. Lidt ligesom hvis man forestiller sig et højdefald der driver vandet i en å af sted ned ad en bakke. Der sker ikke et spændingsfald i ledningen men henover et element f.eks. pæren (da det er den der forbruger energien). Det typiske spændingsfald i almindelige husinstallationer er 230V.

    Hvis et materiale er godt til at lede en elektrisk strøm igennem det, betegnes det som elektrisk ledende, det er f.eks. gældende for alle metaller. Man kan derimod ikke drive en elektrisk strøm gennem papir og almindeligt plastik. Rent vand er i sig selv heller ikke en særlig god elektrisk leder, tilsætter man derimod salt (NaCl) til vandet, er det nemt at sende en elektrisk strøm gennem vandet. Saltet går i opløsning og der dannes Na+ og Cl- ioner. En sådan opløsning der kan drive strøm igennem kaldes også en elektrolytisk væske, den extracellulære og intracellulre væske er sådanne elektrolytiske væsker.

    Kirchhoffs knudepunkts lov

    En elektrisk strøm er en transport af elektriske ladninger. Når man forbinder spændingskilde (eksempelvis batteriet) og en pære i et elektrisk kredsløb og pæren lyser, sker det fordi spændingskilden pumper elektriske ladninger rundt i kredsløbet, som afsætter energi når de passere pæren og dermed lyser den. Da elektriske ladninger ikke bare kan opstå eller forsvinde af sig selv, ’bruger’ elementerne i kredsløbet ikke strømmen, men den elektriske ladning passere gennem komponenterne. Der er det der kaldes ladningsbevarelse, og der kan derfor kun ske en ændring af strømstyrken i et knudepunkt, altså der hvor en leder deler sig eller mødes med en anden. Der ophobes ingen ladning i et knudepunkt, og den samlede strøm indtil et knudepunkt er den samme som det der føres væk. Den her knudepunktsregel kaldes Kirchhoffs 1. Lov og er illustreret på figur 3.1.

    Figur 3.1 Kirchhoffs lov: Dette er en universel måde at beskrive hvorledes strømme og spændinger opfører sig i et almindeligt kredsløb. I et kredsløb med konstant strømstyrke, er den samlede strømstyrke ind mod et knudepunkt lig med den samlede strømstyrke væk fra knudepunktet, fortegnet regnes ud fra de selvvalgte pile der er afsat. Har strømmen samme retning som pilen, har den positivt fortegn. Er den forskellig fra pilens retning har den et negativt fortegn.

    Modstand

    Hvis der er noget der forhindrer de elektriske ladninger, snakker man om en modstand (R). Når elektroner møder en modstand afsætter de energi, i form af f.eks. varme. Da der afsættes energi, sker der altså et spændingsfald.

    Der er påvist propertonalitet mellem spændingsfaldet (U) og strømstyrken (I), man kan derfor skrive U=R*I, hvor R er konstant, denne egenskab kaldes en resistorer (modstand). Konstanten R er altså en måde at beskrive hele komponentens elektriske egenskab i ét tal, der benævnes med enheden Ohm. Denne sammenhæng benævnes Ohm’s lov og giver sammenhængen mellem elektrisk strøm, elektrisk spænding og elektrisk modstand.

    Man kan altså sige om en modstand eller resistans, at det er en egenskab alle elektriske ledere har, den vil medvirke til et tab af elektrisk energi (varmeudvikling) når en elektrisk strøm sendes igennem. Modstanden afhænger af 3 ting;

    • Lederens længde; jo længere leder jo større modstand.
    • Lederens tværsnitsareal, jo større areal jo mindre modstand.
    • Det stof lederen er lavet af; dets resistivitet.

    Resistansen R af en homogen leder er proportionel med lederens længde L, omvendt proportional med lederens areal, og materialets resistivitet ρ, hvilket er temperaturafhængig.

    Afhængigt af et materiales resistivitet betegner man det enten som være en leder (lille modstand) eller en isolatorer (meget høj modstand), imellem de to slags materialer er det der kaldes halvledere.

    Resistiviteten af et materiale kan sammenlignes med cellemembranens permeabilitet. Er membranen meget permeabel for et stof, vil den være ledende, og er permeabiliteten meget lille (membranen er lukket) er den isoleret.

    Kapacitor

    En kapacitor er en anden slags elektrisk komponent der har en evne til at opbevare en vis mængde elektrisk ladning, et slags genopladeligt batteri, en generel opbygning kan ses på figur 3.2. Den elektriske kapacitet (C) afhænger af 3 faktorer;

    • Arealet af de to ledende plader, jo større plader jo større elektrisk kapacitet.
    • Afstanden mellem de to plader, jo mindre afstand jo større kapacitet.
    • Den dielektriskekonstant for det isolerende stof der er imellem de to plader.

    Der er følgende forsimplede sammenhæng mellem, strømstyrke, spænding og kapacitet:

     

    Serie og Parallelkoblede kredsløb

    Når man analyserer et kredsløb, kan komponenterne enten sidde i serie, parallel eller en kombination af disse.

    Komponenter er seriekoblede hvis de sidder i samme uforgrenede leder, altså den samme strøm løber igennem dem. Det samlede spændingsfald U er summen af spændingsfaldene over hver enkelt komponent.

    Figur 3.2 En kapacitor består af to ledende plader (1), det isolerende materiale der er imellem pladerne (2) og afstanden mellem de to plader (3).

    Med udgangspunkt i Ohms lov gælder der altså:

    For resistorer:

    For kapacitorerne:

    Idet spændingsfald og strømstyrke er proportionale ifølge Ohms lov. Dvs , hvis man ser på kredsløbet udefra virker en seriekobling af resistorer altså som én resistor med resistansen R og kapacitet 

    Resistorer i seriekobling deler altså spændingsfaldet efter forholdet mellem resistorerne.

    Hvis komponenterne er anbragt i parallelkobling er der det samme spændingsfald U over dem, hvorimod strømmen I er forskellig gennem komponenterne. Strømmen følger altså Kirchhoffs lov og deler sig mellem de forskellige grene i parallelkoblingen. Ved at bruge Kirchhoffs 1.lov sammen med Ohms lov får man altså at der for parallelkoblinger gælder at:

    Spændingsfald og strømstyrke er altså også proportionale i denne slags kobling.

    Det Elektriske Kredsløb i Fysiologiske Rammer

    Fordi ionkoncentrationerne på hver side af cellemembranen ikke er speciel forskellig fra hinanden, vil den strøm der flyder igennem de åbne kanaler være bestemt af Ohms lov, I = U/R .

    I beskriver strømmen der løber igennem den enkelte kanal, U er spændingsgradienten over membranen og R er den modstand strømmen oplever gennem den åbne kanal (altså permeabiliteten). Da cellemembran sædvanligvis indeholder mange forskellige typer af ionkanaler, er den totale strøm der løber gennem alle cellemembranens kanaler summen af ion fluxen gennem hver enkelt kanal.

    Cellemembranen fungerer altså som en kombineret modstand og kapacitor. Den selektive permeable membran giver den dens modstands egenskaber. Når en lille mængde af positivt ladede ioner bevæger sig indad over cellemembranen vil dette medfører én ændret spændingsgradient kendt som en depolarisation – mere om dette i næste artikel. Amplituden af spændingsgradienten er bestemt af cellemembranens modstand, jo højere denne er, jo større er spændings responset, hvilket også stemmer overens med Ohms lov.

    En kapacitor dannes af en smal åbning mellem to konduktive plader. Fordi cellemembranen, som kan ses på figur 3.3, er meget tynd, er lavet af isolerende materiale og adskiller to kondukterende (ledende) opløsninger, opfører den sig som en kapacitor.

    Figur 3.3 Pga. cellemembranens opbygning opfører den sig som en isolerende kapacitor hvor der sker en ophobninger af ladninger på hver side af den. Membrankanalerne styrer transporten af ladede ioner henover membranen, og kan forstås som en modstand. Denne egenskab skaber en vandring af elektriske ladninger gennem membranen.

    En af egenskaberne ved en kapacitorer, er altså at den adskiller ladninger således at et potentiale forskel kan opretholdes mellem én side af kapacitoren og den anden. I det biologiske tilfælde er dette kendt som membranpotentialet, og sker da en ophobning af ladninger på hver side af cellemembranen fører til en elektronvandring af modsat ladede ioner over membranen. Tilstedeværelsen af de kapacitative komponenter betyder at et spændingsrespons ikke sker øjeblikkeligt, men derimod kun stiger langsomt. Jo større membranens kapacitet er jo langsommere er responset.

    Vi ser altså at det er muligt at betragte den komplicerede biologiske membranfunktion som et simpelt elektrisk kredsløb.

    Læger og forskere finder at et stadig stigende antal sygdomme skyldes defekter i cellemembranens transport mekanismer. Da ionkanalerne, hvoraf de fire hovedtyper er natrium, kalium, calcium og klor, spiller en signifikant rolle i at generere og regulere de elektriske signaler i kroppens væv, vil defekter i dem derfor påvirke evnen til optimalt at regulere vævets funktioner med det resultat at sygdomme opstår. Da ionkanaler jo findes i samtlige væv i kroppen vil defekter i dem også medfører vidt spredte symptomer og sygdomme, det kan således påvirke skelet muskulaturen, nyrerene, hjertet og mange andre organer samt nervesystemet. Disse sygdomme kan være midlertidige og evt. skyldes en bakterieinfektion, men det kan også være arveligt genetiske sygdomme der fører til en over- eller underekspression af kanalproteinerne (der er enten for mange eller for få kanaler i cellemembranen), eller til en defekt regulation af kanal aktiviteten pga. af for mange eller for få intra/extracellulært neurotransmitterstoffer.

    Diarre

    En forbipasserende lidelse er diarre, eller tynd mave, dvs. meget vandholdig afføring fremkaldt af giftstoffer fra bakterier. Dette er som oftest ikke en alvorlig sygdom, selvom den selvfølgelig er meget ubehagelig, på trods af dette er der desværre mange mennesker, primært i Ulandene, der dør af det hvert år. Dette skyldes i høj grad dårlige sanitære forhold og mangel på rent vand.

    Normalt pumpes Na+ioner under energiforbrug fra tynd- og tyktarmens hulhed via tarmcellerne ind i blodet. Samtidig følger druesukker (glucose) og Cl- – ioner med fra tarmen og ind i blodet. Pga. osmose følger vandmolekyler med natrium- & chlorid-ionerne med over i blodet – det betyder at vores afføring får en normal og fast konsistens. Ved forskellige bakterieinfektioner (Salmonella m.fl.) ”irriteres” tarmvæggen og den omtalte Na+ pumpemekanisme sættes ud af funktion. Derfor udskilles større mængder vand og salt (natrium- & klor ioner) via tarmen – afføringen bliver derfor tynd.

    Figur 5.1 Ved diarre er tarmvæggen blevet ’irriteret’ og Na/K pumpn er sat ud af funktion, dette betyder at der er en meget høj ionkoncentration i tarmrummet, og altså en lav vandkoncentration ift. vandkoncentrationen i blodet (på den anden side af cellevæggen). Det betyder at osmotiske kræfter trækker vand ud i tarmhulrummet og afføringen bliver meget vandholdig.

    Hvis den tabte væske ikke erstattes, bliver personen dehydreret. Dette påvirker alle organer i kroppen, da vedvarende diarre medfører at kroppen taber store mængder af vand, næringsstoffer og elektrolytter (såsom Na+ og K+) som kroppen har behov for for at fungere optimalt. I værste tilfælde kan man få nyresvigt og dø af det.
    Denne slags osmotisk diarre kan også opstå som resultat af en dårlig diæt, der forårsager at noget i tarmen trækker vand fra kroppen ind i tarmen. Dette kan for eksempel være et overforbrug af tyggegummi, hvor sødemidlet sorbitol ikke optages af kroppen men suger vand fra kroppen ind i tarmen og dermed forårsager diarre.

     

    Cystisk Fibrose

    Cystisk Fibrose (CF) er en arvelig og medfødt ionkanal sygdom og skyldes en defekt i Cl- kanalerne der betyder at salttransporten i visse celletyper i lungerne, bugspytkirtlen og svedkirtlerne ikke fungerer. Denne defekte salttransport gør blandt andet at slimet i luftvejene er meget tykt og sejt hvilket resulterer i at luftvejene bliver mere modtagelige over for bakterieinfektioner.

    Patienter med CF har en mutation på det gen der koder for transport membranproteinet kaldet cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), og som kontrollere transporten af klorid ioner gennem cellemembranen i epitelceller (altså en Cl- kanal). Der er en nedsat og defekt absoprtion af kloridioner. Mutationerne kan medføre at der enten slet ikke kodes for Cl- kanalerne der sidder vendt ud mod lumen (altså ud mod luftvejene) eller der er en defekt i kanalen således at den ikke åbnes selvom den stimuleres, der derfor er en meget lille strøm af Cl- ioner ind i cellen.

    Nogle af symptomerne på Cystisk Fibrose er blandt andet et meget højt saltindhold i sveden. Sved bruges til at nedkøle kroppen ved at der sker en fordampning af vand. I den normale svedkirtel vil både vand og NaCl føres til hulrummet i kirtlen gennem en filtration proces, NaCl reabsorberes derefter igennem Na+ og Cl- kanaler gennem cellen, og efterlader dermed en vandig opløsning i svedkirtlen, da vandet ikke kan optages i epitel cellemembranen, vil vandet forlade svedkirtlen gennem åbninger til huden. Ved CF er epitel Cl- absorptionen defekt, hvilket også påvirket optaget af Na+ ioner da den elektrokemiske gradient nedsættes når der ikke optages negative klorid ioner i cellen. Konsekvensen er at der er et øget NaCl niveau i sveden.

    Et andet mere alvorligt symptom er et reduceret vand indholdet i det beskyttende slim der dækker epitelet i luftvejene. Vand indholdet i slimet bestemmes af en fin osmotisk balance af væske optag og sekretion. I CF patinter er der en mangel på CTFR proteiner i epitelet, hvilket betyder en nedsat strøm af Cl- ioner der dermed medfører en nedsat væske sekretion. Dernæst sker der et øget optag af Na+ ioner, da CTFR har en hæmmende effekt på natriumkanalerne, som nu mangler. Den øget koncentration af Na+ ioner i cellen vil medfører endnu et øget optag af væske igennem membranen. Begge dele resulterer altså i mindsket væskeindhold i slimet der dækker epitellaget i luftvejene. P.ga. det nedsatte vandindhold bliver slimet derfor mere tykt og sejt, hvilket derved gør at de små fimre hår der sidder i luftvejene og sørger for at bevæge slimen (og de uønskede partikler der kommer ned i luft rørene) op og ud af lungerne, ikke fungere optimalt. Der sker altså en ophobning af slim i luftvejene som giver perfekt grobund infektion, inflammation og et tiltagende destruktivt miljø for lungevævet, forskellen på sundt og sygt lungevæv kan ses på figur 5.2.

    Figur 5.2 Normal epithelium. Et tyndt lag af vandigt slim fanger inhalerede partikler og bakterier, dette flyttes op gennem luftvejene af fimrehåre, der sidder på overfladen af epithelcellerne. Det meste af den væske der bruges til at gøre slimen vandig og mobil sekreres af slimhinderne. Cystisk Fibrose epithelium. På grund af manglende CFTR, sekreres der kun meget lidt væske fra slinmhinderne, slimet er derfor tykt og meget svært at flytte. Dette miljø er ideelt for de fangede bakterier som formerer sig og vokser i antal, de vil også tiltrække immunceller, hvilket vil føre til inflammation og skade på sundt lungevæv.

    Epilepsi

    En anden sygdom der skyldes en genetisk defekt ionkanal er epilepsi, og opstår p.ga. mutationer i forskellige subdele af Na+ kanalens membranprotein. Hvis defekten sidder i andre subdele af membranproteinet vil det fører til andre sygdomme, såsom fejl i hjerterytmen eller periodiske lammelser. Der er forskellige gener der koder for natrium membranproteinet; nogle koder for natriumkanalerne i hjertet andre for kanalerne i skeletmuskulaturen og fire andre gener koder for natriumkanalerne i hjernen, så alt afhængig af hvilket gen der er en mutation på vil det resulterer i vidt forskellige sygdomme.

    Epilepsi er et resultat af en overaktivitet af de elektriske signaler i hjernen. Afhængig af hvilken type af epilepsi der er tale om, sidder mutationerne forskellige steder. Der findes således en type epilepsi der rammer børn, hvor det specifikke gen der er muteret koder for inhiberende natriumkanaler i hjernen. Disse kanaler er kritiske i kontrollen af hjernens elektriske aktivitet.

    Inhiberende neuroner udløser transmitterstoffet GABA i præsynaptiske synapser (link til artikel 4), og kan derved stoppe et elektrisk signal. Der er altid en dynamisk balance mellem hæmmende og fremmende signaler i hjernen for at sikre den normale funktion. Hvis der er en defekt i en hæmmende ionkanal betyder det at der intet er til kontrollerer de fremmende signaler og der sker dermed en overaktivitet der medfører et epileptisk anfald.

    Nogle medicintyper virker ved at blokere ionkanaler og dermed reducere den mængde Na+ der kan passere igennem kanalerne, mens andre virker ved at sætte sig på receptorer der øger de inhiberende elektriske signaler. F.eks. er der nogle typer af medicin der fremmer GABA funktionen.

    Et af de mest tydelige symptomer på et epileptisk anfald er krampetilfælde. Dette skyldes en manglende inhibering af de elektriske signaler med det resultat at der sker en overaktivitet i hjernen, der medfører at hjernen sender forkerte signaler ud i kroppen så kroppen gør ting du ikke vil have den til at gøre.

     

    Generaliseret anfald

    Nogle anfald starter i hele hjernen på én gang, dette kaldes for et generaliseret anfald. Et generaliseret anfald kan således ikke kobles til at have noget bestemt start sted i hjernen, og hvis man ser på et EEG viser det ingen tegn på lokalisation i hjernen. Et generaliseret anfald kan groft opdeles i et Petit mal anfald eller et Grand mal anfald.

     

    Petit Mal anfald

    Ved et Petit mal anfald, også nogle gange kendt som et absence anfald, er der typisk kun mindre nedsat neural funktion, patienter stirre blankt og vil være fraværende, det varer ca. 2-10 sek., hvorefter tidligere aktivitet genoptages. Det vil altså typisk ramme bevidstheden og hukommelsen men patienten bibeholder sin muskelspænding (falder ikke sammen) og kan fortsætte med automatiske aktivitet (fx gang). Disse anfald vil oftest optræde i barndommen, hvis de ikke forsvinder med alderen udvikler de sig ofte til grand mal anfald.

     

    Grand Mal anfald

    Dette er nok det anfald flest mennesker kendetegner med epilepsi. Det udvikler det maksimale anfalds respons hvor alle hjernens systemer påvirkes. Nogle patienter har en prodome (ændret mentaltilstand) nogle dage før et grand mal anfald. Typisk gennemgår en patient 3 faser.

      • Initial tonisk: Der sker en muskel fleksion hvorefter alle muskler ekstenderer (strækkes), nogle gange følges dette af et lydløst råb. Denne tilstand varer 10-20sek, og følges af
      • Total muskelafslapning og derefter voldsomme spasmer. Der er også nedsat respiration hvilket kan medføre at patienten bliver blå i hovedet (ilt mangel). Denne fase varer ½-2 minutter
      • Den sidste fase er den terminale fase hvor patienten træder ind i en koma lignende tilstand og bliver helt slap og stille. Et EEG vil i denne fase være helt fladt, der kan altså ikke måles nogen elektrisk aktivitet overhovedet. Den terminal fase varer ca. 5 minutter.

    Partiel/delvis anfald

    Hvis et anfald er startet ét bestemt sted i hjernen (det har et lokaliseret fokus) afhænger anfalds mønsteret af det område i hjernen der stimuleres. Det kan opdeles i simpelt eller kompleks.

    Simpelt anfald

    Et simpelt anfald spredes meget lidt, og patienten har elementære symptomer. Det er et ukompliceret anfald f.eks. falder patienten sammen eller oplever sensoriske defekter. Hukommelsen og bevidstheden påvirkes ikke og patienten kan altså huske det hele.

     

    Kompleks anfald

    Hvis patienten udsættes for et kompleks epileptisk anfald, vil personen først opleve et simpelt anfald der efterfølges af en påvirkning af bevidstheden. Sådanne patienter vil typisk virke konfuse og udvise automatismer (meningsløs og automatisk opførsel) som f.eks. tyggende eller slugende bevægelser.

    Denne artikel beskriver hvorledes medicinalprodukter kan rettes mod specifikke ionkanaler og hvilke teknikker der er til at måle effekten osv.

     

    Lægemiddel rettet specifikt mod ionkanaler

    I udviklingen af behandlingsmetoder for sygdomme opstået som resultat af en defekt ionkanal mekanisme, har forskere designet lægemidler der er rettet specifikt mod én bestemt slags ionkanal, for på den måde at kunne behandle alt fra forhøjet blodtryk til migræne. Indtil videre har forekomsten af bivirkninger ved denne slags lægemidler medført at de ikke er voldsomt udbredte, da ionkanaler spiller en så væsentlig del i hele organismen og tit har forskellige roller i forskellige organer. Nyere forskning har vist at hvis man i stedet vælger at rette fokus mod en undertype af de forskellig ionkanaler, som altså tit er forskellig fra organ til organ kan man udvikle lægemidler der ikke har samme udstrækning af bivirkninger.

    F.eks. vil et medicinalprodukt til at behandle epilepsi og som er specifikt rettet mod Na+ kanaler, i forsøget på at mindske deres aktivitet, kunne have alvorlige bivirkninger på f.eks. hjerterytmen, der også er styret af Na+ kanaler.

    Et alternativ ville være at fremme GABA aktiviteten, som styrer den hæmmende præsynaptiske synapse, og derigennem påvirke Na+ kanalerne i hjernen uden at påvirke dem i andre organer, som har andre præsynaptiske transmitterstoffer. Der er lavet museforsøg med forskellige typer af denne slags medicin, som har vist at musene får færre epileptiske anfald og lever længere.

    For at designe denne type lægemidler der er rettet mod specifikke biologiske mål, her ionkanalerne, producerer man små biomolekyler (proteiner), der er komplementer i facon og ladning i forhold til det endelige mål de vil interagere med og binde sig til (ionkanalens receptor).

    For at sikre sig den bedst mulige binding har man behov for at vide så meget om de enkelte receptorers dimensionale struktur, hvilket bl.a. opnås gennem røntgenkrystallografi og MR spektroskopi (Magnetisk Resonans), begge er teknikker, der gør det muligt at bestemme molekylers opbygning. Ved derefter at bruge den viden man har om det biologiske mål (receptoren), kan man designe lægemidler, der med stor forventning vil binde sig til receptorstedet med høj affinitet og selektivitet. Udover at undersøge strukturen af receptoren kan de samme metoder også bruges til at skabe en bedre forståelse for neurotransmitterstoffet, og derigennem optimere lægemidler.

    Måleteknikker

    Man kan groft opdele de elektrofysiologiske teknikker til at måle ionstrømmen henover cellemembranen som indirekte metoder eller direkte metoder. En Indirekte måling benytter extracellulære elektroder og er tit en non-invasiv metode, såsom EEK (hjerne) (Figur 6.1) og EKG (hjerte).

    Direkte metoder bruger mikropippetter til at skabe kontakt med den celle man ønsker at undersøge. Med den direkte metode kan pipette enten bryde gennem membranen (intracellulær måling) eller pipetten kan skabe kontakt med cellemembranen men ikke penetrerer den, dette kaldes en patch clamp teknik.

    Den indirekte metode måler altså fra en større afstand og på en række nervers aktivitet, man kan altså kun sige noget om den overordnede elektriske aktivitet i et begrænset område som overflade elektroderne måler på.

    Figur 6.1 En indirekte målemetode er brugen af EEG, hvor elektroder placeret på patientens hoved og måler hjernens elektriske aktivitet.

    I takt med at de direkte metoder er blevet mere udbredte og bedre udviklet er man i stand til at måle på den enkelte celles elektriske aktivitet og det er faktisk muligt at måle på en enkelt ionkanal ad gangen for på denne måde at kunne undersøge om det er en bestemt ionkanal der er defekt, og hvordan forskellige lægemidler ændrer ionkanalens aktivitet.

    Voltage clamp

    Dette er som sagt en teknik der gør det muligt at studere enkelte eller flere ionkanaler i cellens membran og måle strømmen der løber henover. Figur 6.2 viser en optagelse fra en enkel kanal. Den stille periode repræsenterer den tid hvor kanalen er lukket. Størrelsesordenen af enkel-kanal-strømmen bestemmes af ion koncentrationen på hver side af membranen, af potentialet over membranen og af den ’lethed’ ionen er i stand til at komme igennem kanalen med (permeabiliteten).

    Den mest direkte måde at undersøge ionkanalens funktion er ved at måle den strøm der strømmer gennem den åbne kanal eller ved at måle ændringer i membranpotentialet som dette vil producere.
    Hvis man f.eks. ønsker at måle ionstrømmen (enten makroskopisk eller strømmen over enkelte kanaler), er det nødvendigt at fastholde cellemembranpotentialet konstant, da vi jo ved at en ionstrøm, der løber over cellemembranen vil forandre membranpotentialet. Denne metode kaldes en voltage clamp (spændings klemme).

    Figur 6.2 Ionkanaler opfører sig som port i cellemembranen. Når kanalen er åben (første pil), ioner bevæger sig igennem kanalen og skaber derved en meget lille strøm, hvilket ses som en opadrettet udslag på kurven. Ved et fikseret membranpotentiale, som her, vil amplituden af strømmen gennem den enkelte kanal være konstant. Tiden hvor kanalen er åben variere dog.

    En voltage clamp fungerer ved at indsætte en glas mikroelektrode med en meget tynd spids ind i cellen (figur 6.3), det er dermed muligt at måle forskellen mellem det spændingspotentiale den registrerer og det en reference elektrode udenfor cellen måler. Forskellen på de to målinger er cellens membranpotentiale.

    Voltage clamp

    Dette er som sagt en teknik der gør det muligt at studere enkelte eller flere ionkanaler i cellens membran og måle strømmen der løber henover. Figur 6.2 viser en optagelse fra en enkel kanal. Den stille periode repræsenterer den tid hvor kanalen er lukket. Størrelsesordenen af enkel-kanal-strømmen bestemmes af ion koncentrationen på hver side af membranen, af potentialet over membranen og af den ’lethed’ ionen er i stand til at komme igennem kanalen med (permeabiliteten).

    Den mest direkte måde at undersøge ionkanalens funktion er ved at måle den strøm der strømmer gennem den åbne kanal eller ved at måle ændringer i membranpotentialet som dette vil producere.
    Hvis man f.eks. ønsker at måle ionstrømmen (enten makroskopisk eller strømmen over enkelte kanaler), er det nødvendigt at fastholde cellemembranpotentialet konstant, da vi jo ved at en ionstrøm, der løber over cellemembranen vil forandre membranpotentialet. Denne metode kaldes en voltage clamp (spændings klemme).

    Hvis man indsætter en mikroelektrode mere i cellen, kan denne bruges til at overføre en strøm til cellen, for på den måde at ændre membran potentialet, det er dermed muligt at holde membranpotentialet ved en konstant værdi (clamped).

    Princippet i en voltage clamp er at man kan tilføre cellen en strøm, der har samme amplitude men modsatsrettet i forhold til den, der strømmer naturligt over cellemembran, på den måde vil der ikke være nogen net strøm over membranen og potentialet er konstant. Yderligere ved at registrere den strøm det kræves for at klemme potentialet (holde det konstant), kan man altså måle den strøm der strømmer over membranen.

    Figur 6.3 To mikroelektroder er indsat i cellen. En optager membranpotentialet og den anden bruges til at påføre en strøm. Outputtet fra spændingselektroden førers ind til et af inputtene til afklemningsforstærkeren, som påfører strøm til cellen for at holde det ønskede membranpotentiale. Dette potentiale (styrings potentialet) førers til det andet input af afklemningsforstærkeren. Den strøm der påføres cellen har den samme amplitude, men modsatte ladning, som den elektriske strøm der løber over cellemembranen. Strømmen I(m) kan måles ved at benytte en strøm-til-spændings-transformator.

    En voltage clamp måler den samlede strøm, der løber over hele cellemembranen, det vil sige den strøm der strømmer gennem hundrede eller tusindvis af ionkanaler simultant, dette kaldes for hele-celle-strømmen eller den makroskopiske strøm. Konventionelt betegner man strømme der er indadrettede over membranen (udefra ind) som negative, og vises som nedadrettede udsving på plot over strømmen.

    Jo mindre cellen, som skal undersøges er, jo mindre skal spidsen af mikroelektroden også være for ikke at ødelægge cellen. I takt med at spidsen bliver tyndere og tyndere får elektroden en utrolig høj modstand, der er derfor en nedre grænse for hvor små cellerne kan være for at kunne måle en succesfuld spændings klemning, fordi spændingen simpelthen ikke kan ændres hurtigt nok, p.ga. den høje modstand, til at holde potentialet konstant. For små celler er patch clampen derfor essentiel.

     

    Patch Clamp

    En patch clamp kan i modsætningen til en voltage clamp bruges til både at måle hele cellens elektriske aktivitet eller enkelte ionkanaler. Patch clampen virker ved at danne en forsegling med en meget høj modstand (Giga Ohm) mellem cellemembranen og glasvæggen af en mikropipette placeret mod overfladen af cellen, en illustration af patch clampens mikropipette kan ses på figur 6.4.

    Figur 6.4 Pga. den høje modstand forseglingen producerer, betyder det at den strøm, der løber gennem ionkanalerne i det stykke af membranen, der ligger indenfor elektroden kan optages/måles med meget lidt baggrunds støj. Dette er utrolig vigtigt, da den strøm man kan måle igennem en enkelt kanal er meget lille (få pA eller mindre). En anden fordel af denne type forsegling er at det potentiale, der er over membran stykket kan ændres ved at påføre elektroden en spænding (der er altså ikke behov for to elektroder).

    Der er 4 overordnede måder patch clampen kan fungere på: cell attached, inside out, outside out, og whole cell (figur 6.5).

    De første 3 kan bruges til at måle strømmen fra en enkelt kanal fra et meget lille stykke af membranen, den sidste metode bruges til at måle den samlede strøm, der løber over hele cellemembranen.

    Alle metoder tager udgangspunkt i de samme principper som cell attached teknikken.

     

    Cell attached

    Pipetten forsegles til membranen på en intakt celle. Den indre overflade af membrankanalen er derfor eksponeret til dens normale cytosoliske miljø, hvilket gør at denne konfiguration er særdeles brugbar til at studere ionkanalens egenskaber under normale fysiologiske betingelser.  Der er dog visse ulemper ved denne teknik idet at sammensætningen af den intracellulære opløsning er ukendt, desuden bestemmes potentialet over det undersøgte stykke membran ikke kun af den strøm der tilsættes gennem pipetten, men det er også afhængig af cellens hvilemembran potentiale hvilket vi ikke kender og som også kan variere over tid.

     

    Inside-out og outside out teknik

    De to andre potentielle konfigurationer der er for at undersøge enkelt-kanaler, er mulige fordi cellemembranen brister før forseglingen til membranen brydes. Når pipetten trækkes tilbage vil et stykke isoleret cellemembran som er forseglet til pipettespidsen følge med.

    Figur 6.5 viser forskellige patch clamp konfigurationer.

    Dette stykke membran vil således have dens intracellulære overflade vendt ud mod en opløsning hvis indhold er kendt (inside out). I outside-out konfigurationen vender den eksterne membranoverflade ud mod en kendt opløsning. Begge metoder giver således mulighed for at studere strømmen gennem en enkelt kanal under kontrollerede ioniske betingelser, det er desuden muligt at lave målinger af det samme membranstykke i forskellige opløsninger. Man bruger derfor disse konfigurationer i høj grad når man ønsker at studere kanaler styret af transmitterstoffer.

     

    Whole cell

    Whole-cell konfiguratioen bruges på samme vis som voltage-clamp metoden, til at måle summen af elektriskaktivitet over alle ionkanaler i cellemembranen. Når pipetten er forseglet til membranen kan man ved sugning ødelægge membranstykket og dermed skaffe sig adgang til indersiden af cellen.

    Automatisk patch clamp

    Patch clamp metoden er en meget tidskrævende proces der kræver meget erfarne operatører, succesraten af cellemembraner der kan undersøges i forhold til de der går i stykker i procesforløbet er meget lav. Et dansk firma, Sophion, har udviklet en automatisk patch clamp, QPatch, der gør det muligt at screene op til 48 ionkanaler ad gangen, det er således muligt at få hundredvis af målinger på én dag, hvilket dermed gør det muligt at få en meget hurtigere, og mere nøjagtig undersøgelse af forskellige lægemidlers virkning på ionkanalerne.

    Følgende film (tryk her) viser kort hvordan QPatch (og altså også princippet i hvordan en almindelig manual patch clamp fungerer).

  • Øvelser

    De følgende øvelser og opgaver vil  give jer en gennemgang af det teoretiske stof vi har berørt igennem artiklerne.

    • Osmoseøvelser
      Tilknyttet artikel 2 og til dels artikel 5. Den består af tre separate øvelser samt opsamlende opgaver, disse kan alle laves uafhængigt af hinanden.