Optimering af en cellefabrik

Den valgte cellefabrik er ikke altid optimeret til produktionen af det ønskede produkt. Dette kan skyldes lav produktivitet, ophobning af uønskede biprodukter eller produktets toksicitet.

Derfor er optimering af cellefabrikken afgørende.
Rationelle designmetoder som CRISPR-Cas9 gen modificering muliggør præcise ændringer, såsom at tilføje (knock-in), fjerne (knock-out) eller regulere gener og metaboliske pathways.

I kontrast hertil anvender evolutionær design metoder som tilfældig mutagenese og Adaptive Laboratory Evolution (ALE), der bruger naturlig selektion for gradvist at forbedre stammens egenskaber over tid.

Andre gange kan man, i stedet for at optimere en enkelt stamme, kombinere styrkerne fra to forskellige gennem samsdyrkning (co-cultivation) for at overvinde produktions flaskehalse.
Disse flaskehalse er specifikke trin i processen, hvor begrænsninger, såsom langsomme reaktionsrater eller ophobning af toksiske biprodukter, reducerer den samlede produktionseffektivitet. Ved at bruge to stammer, der supplerer hinandens evner, kan disse flaskehalse minimeres, hvilket resulterer i en mere effektiv proces med højere udbytte.

De forskellige optimeringsmetoder har hver deres fordele og ulemper.
Det er derfor vigtigt at forstå, hvilke metoder, der skal anvendes, og hvordan de bedst kombineres, afhængigt af cellefabrikkens behov.

De vigtigste produktivitetsparametre for optimering

Evaluering af en cellefabriks samlede ydeevne kræver, at man måler sammenlignelige og kvantificerbare parametre.
De tre vigtigste parametre, der bruges til at vurdere en cellefabriks præstation, er titer, produktivitet og udbytte:

Titer (produktkoncentration)

Titer refererer til den samlede mængde af det ønskede produkt, der er ophobet i kulturmediet, normalt målt i gram pr. liter (g/L).
En højere titer betyder, at der er blevet produceret mere produkt, hvilket er vigtigt for at opnå en effektiv og økonomisk forsvarlig proces.

For at måle titeren tages prøver fra kulturvæsken, eller fra lyserede (døde og ødelagte) celler, hvis produktet findes inde i cellerne. Celler og celleaffald fjernes først ved centrifugering. Derefter anvendes teknikker som HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) eller GC (Gas Chromatography) til præcist at måle produktkoncentrationen i den klare væske.

Produktivitet (produktionshastighed)

Produktivitet måler, hvor hurtigt produktet dannes over tid, typisk udtrykt i gram pr. liter pr. time (g/L/h). En proces med høj produktivitet producerer det ønskede stof hurtigere, hvilket gør det muligt at forkorte produktionstiden og øge den samlede effektivitet.
Lav produktivitet betyder derimod, at processen tager længere tid, hvilket kan gøre produktion i stor skala upraktisk. Produktiviteten kan beregnes ved at dividere titeren med den tid, fermenteringen tog.

Udbytte (konverteringseffektivitet)

Udbyttet beskriver, hvor effektivt råmaterialer omdannes til det ønskede produkt, ofte målt som gram produkt pr. gram substrat (g/g).
Et højt udbytte betyder, at cellerne udnytter ressourcerne effektivt, hvilket minimerer spild og reducerer produktionsomkostninger.
Udbyttet kan beregnes ved at dividere den målte mængde produkt med mængden af substrat, der er tilsat.

Teknikker til at optimere organismens egenskaber

Nogle gange handler optimeringen af en cellefabrik ikke om at forbedre disse tre parametre direkte, men om at tilføje eller forbedre andre ønskede egenskaber.
Det kan for eksempel være:

- at få cellefabrikken til at udnytte et alternativt substrat,
- at øge stresstolerance,
- eller at få cellerne til at udskille produktet i mediet, de vokser i.

Der findes mange metoder til at forbedre eller tilføje sådanne egenskaber, og de kan overordnet opdeles i to hovedgrupper:

Rationelt design
- kræver klar forståelse af cellen metabolisme
- målrettet sletning (deletion) eller indsættelse (insertion) af gener
Rettet evolution
- kræver ikke fuld forståelse af cellens metabolisme
- tilfældige mutationer og efterfølgende selektion
- gentagende proces med screening for forbedrede egenskaber

For at udføre Rationelt Design skal man ændre i gener med, hvis funktion man kender, dette kan enten være at slette dem (deletion) eller insætte nye gener (insertion).

Deletion: Celler udfører mange processer samtidig, hvoraf nogle konkurrerer om energi og ressourcer med produktionen af det ønskede produkt. Ved at fjerne eller nedregulere disse pathways kan flere ressourcer dirigeres mod produktionsvejen, hvilket øger effektiviteten. Da essentielle gener ikke kan slettes, kan genekspressionen i stedet nedreguleres ved gen-knockdown, f.eks. ved CRISPR-interferens (CRISPRi) med dCas9. Denne metode blokerer midlertidigt transkriptionen uden at fjerne genet, så cellen forbliver levedygtig, mens produktiviteten øges.

Insertion: Indsættelse af gener kan introducere nye ønskede egenskaber i en cellefabrik. Disse gener kan gøre cellen i stand til at producere nye forbindelser, udnytte alternative næringsstoffer, håndtere stress eller udskille toksiske produkter. Afhængigt af formålet kan der indsættes forskellige typer gener, som overordnet kan opdeles i produktionsgener, regulatoriske gener, transportgener og stressresponsgener, som gennemgås nedenfor.

Produktionsgener

Disse gener koder for de enzymer eller selve proteinet, der er nødvendige for, at cellefabrikken kan producere det ønskede produkt, også selvom genet oprindeligt stammer fra en anden organisme.
Afhængigt af produkttypen kan det være hele biosyntetiske pathways eller blot et enkelt rekombinant protein (se figur 1).

I biosyntetiske pathways kræves der ofte flere gener, som tilsammen koder for de enzymer, der katalyserer hvert trin i omdannelsen fra substrat til slutprodukt.
Disse gener skal vælges omhyggeligt og udtrykkes koordineret, så metabolitternes “flow” gennem pathway’en er effektivt.

Ved produktion af rekombinante proteiner kan man også øge mængden ved at indsætte flere kopier af genet. Flere genkopier producere mere mRNA og dermed også øger proteinproduktionen.

Figur 1: Figuren viser, hvordan indsættelse af produktionsgener kan ændre, hvad en celle producerer. Øverst illustreres det naturlige indre miljø i cellen, hvor den kun producerer sine egne proteiner og molekyler ud fra sit oprindelige DNA. Nederst til venstre ses et eksempel på indsættelse af gener fra en biosyntetisk pathway, hvor flere enzymer samarbejder om trinvis at omdanne et udgangsstof til et nyt slutprodukt. Nederst til højre vises produktion af et rekombinant protein, hvor et indsat gen transskriberes til mRNA og derefter translateres til et protein, som cellen ikke naturligt producerer. Selv om forskellige DNA-sekvenser kan kode for det samme protein, foretrækker forskellige organismer bestemte codons (tripletter af nukleotider, der koder for aminosyrer). Ved at justere DNA-sekvensen, så den matcher værtscellens præferencer, kan man øge effektiviteten af translationen. Dette resulterer i hurtigere og mere præcis proteinsyntese, bedre foldning og ofte et mere funktionelt protein.

Regulatoriske gener

For yderligere at optimere genudtryk anvendes regulatoriske elementer såsom promotere, ribosome binding sites (RBS) og terminatorer. Disse kontrollerer, hvor meget og hvornår et gen udtrykkes, hvilket gør hele produktionsprocessen mere effektiv.

Promotere er DNA-sekvenser placeret umiddelbart før et gen. De fungerer som en “tænd/sluk-knap” for transkriptionen og fortæller cellen, hvor den skal begynde at kopiere genet til mRNA. En stærk promoter øger, hvor ofte genet transskriberes, hvilket fører til højere mRNA-niveauer og dermed mere proteinproduktion. En inducerbar promoter (inducible promoter) aktiveres kun under bestemte betingelser, f.eks. når et specifikt molekyle (en inducer) tilsættes vækstmediet.
Dette gør det muligt for cellen at fokusere på vækst først og derefter skifte til produktion på det rigtige tidspunkt (se figur 2).

Figur 2: En inducerbar promoter gør det muligt at regulere genekspression præcist. Genet udtrykkes kun i nærvær af induceren. RBS er en kort sekvens på mRNA’et, placeret tæt på startcodonet. De hjælper ribosomerne med at binde til mRNA’et og begynde translationen. En god RBS øger effektiviteten af proteinproduktionen ved at gøre ribosom-binding hurtigere og mere præcis, hvilket gør at mRNA hurtigere bliver transskriberet til proteiner. Terminatorer er sekvenser, der markerer slutningen af transkriptionen. De fortæller cellen, hvornår den skal stoppe med at kopiere genet til mRNA. Stærke terminatorer sikrer, at mRNA’et får den rette længde og forhindrer, at cellen spilder energi på at producere defekte transkripter.

Transportgener

Disse gener koder for proteiner, der kan transportere molekyler ind og ud af celler. Det er ofte enten transport af substrater ind i cellen eller eksport af produkter ud af cellen, se figur 3.

Disse transportere gør det muligt for cellen at optage næringsstoffer, den tidligere ikke kunne bruge.
Det udvider udvalget af substrater, som cellefabrikken kan vokse på og omdanne til produkter.
Hvis substratet er meget forskelligt fra det, cellen normalt anvender, kan der også være behov for yderligere enzymer til at omdanne det til brugbare metabolitter.

Hvis produktet ophobes i cellen eller er toksisk, kan det skade cellefunktionen, bremse væksten eller føre til celledød.
Ved at konstruere cellen til at eksportere produktet ud i mediet kan man forhindre dette, forlænge produktionen og øge det samlede udbytte.

Figur 3: Et transportprotein gør det muligt for cellen at pumpe molekyler ud i omgivelserne. Dette er nyttigt, hvis produktet er toksisk eller ophobes for meget inde i cellen.

Stressresponsgener

Disse gener hjælper cellen med at overleve under de hårde industrielle betingelser, hvor den kan udsættes for høje/lave temperaturer, toksiske biprodukter eller høj metabolisk belastning.

En måde at øge stresstolerancen på er ved at indsætte gener, der koder for chaperone-proteiner. Under nogle typer af stress kan proteiner i cellen misfolde, hvilket kan forstyrre vigtige processer. Chaperoner hjælper med at genfolde de misfoldede proteiner tilbage til deres korrekte struktur. Ved at øge antallet af chaperoner bliver cellen mere robust og kan fortsætte produktionen effektivt, selv under stress (se figur 4).

Figur 4: Under stress kan proteiner misfolde, hvilket kan føre til celledød. Hvis cellen udtrykker stressrespons-proteiner som chaperoner (vist som grønne proteiner), kan disse refolde de misfoldede proteiner og holde cellen i live.

Metoder baseret på rettet evolution udnytter tilfældige evolutionære ændringer i håbet om, at nogle af mutationerne vil være fordelagtige eller resultere i den ønskede egenskab. Denne metode kræver ikke forudgående viden om cellens indre funktioner, men den er typisk mere tidskrævende og kræver mange screeningsrunder for at finde de bedste varianter. Eksempler inkluderer: ALE og tilfældig mutagenese.

ALE – Adaptive Laboratory Evolution

Adaptive Laboratory Evolution (ALE) er en effektiv teknik, der bruges til at forbedre organismer ved at lade dem gradvist tilpasse sig specifikke betingelser i laboratoriet. I modsætning til genredigering, hvor man foretager målrettede ændringer i DNA’et, bygger ALE på naturlig selektion over mange generationer. Cellerne dyrkes i et nøje kontrolleret miljø, hvor kun dem med fordelagtige egenskaber overlever og formerer sig (se figur 5).

Trinene i ALE er:

Cellerne placeres i et miljø, der er en smule stressende.
Dette kan for eksempel være et miljø med en alternativ kulstofkilde, høj temperatur eller tilstedeværelsen af et toksisk stof.
De celler, der naturligt tilpasser sig (evolverer gennem tilfældige mutationer) til disse betingelser, overlever og reproducerer sig, hvorved de fordelagtige træk nedarves til de næste generationer.
De overlevende celler flyttes derefter til et miljø med lidt højere stressniveau, for gradvist at styrke deres fordelagtige egenskaber.

Efter tilstrækkeligt mange generationer kan de forbedrede celler bruges i industrielle anvendelser.

Når den ønskede cellefænotype er opnået, kan cellens genom sekvenseres for at identificere de gavnlige mutationer. Denne viden gør det muligt effektivt at overføre egenskaberne tilbage til cellefabrikken gennem målrettet genetisk modificering.

Denne metode fungerer for mange typer af cellefabrikker, da stresstolerance udvikles gennem naturlige mekanismer og derfor ikke kræver forudgående viden om specifikke gener.
Dog tager evolution lang tid, og derfor er ALE en langsom og arbejdskrævende metode.

Figur 5: ALE fungerer ved at tage en cellepopulation og dyrke den under gradvist mere stressende forhold, startende med lav stress og derefter mod højere stressniveauer. De overlevende celler bliver naturligt selekteret, og de mest tilpassede kan til sidst sekvensteres eller bruges direkte i produktion.

Tilfældig mutagenese

Tilfældig mutagenese er en proces, hvor der indføres tilfældige mutationer i en organismes DNA uden målrettet at gå efter specifikke gener. Der findes mange måder at introducere disse mutationer på. En af de mest simple og klassiske metoder er UV-mutagenese (se figur 6). I denne proces udsættes organismer for UV-lys, som beskadiger deres DNA. Når cellerne forsøger at reparere skaden, sker der ofte fejl i reparationen, hvilket resulterer i permanente mutationer.

De muterede celler screenes derefter for forbedrede egenskaber, såsom højere produktivitet eller øget stresstolerance afhængigt af det ønskede træk. Mutanter, der viser forbedrede egenskaber, kan gennemgå yderligere runder af UV-mutagenese for yderligere at forstærke forbedringerne.
Ligesom i ALE, kan genomer bagefter sekventeres for at identificere de mest gavnlige mutationer, som derefter kan genskabes målrettet i den oprindelige cellefabrik ved hjælp af genetisk modificering.

Denne metode kræver heller ikke forudgående viden om specifikke gener, men den er også arbejdskrævende. En af de største udfordringer er, at metoden introducerer mutationer ved at beskadige DNA’et, hvilket kan dræbe cellerne, især ved høje doser af UV-lys.

Figur 6: UV-mutagenese fungerer ved at udsætte celler for UV-stråling, hvilket skaber tilfældige mutationer. Mutanter, der viser forbedrede egenskaber, udvælges og overføres til agarplader. De kan derefter gennemgå yderligere runder af UV-mutagenese for at forbedre cellernes egenskaber yderligere.

Samdyrkning (Co-culture)

I naturen lever mange mikroorganismer i fællesskaber, hvor de samarbejder for at øge deres overlevelseschancer, som f.eks. i tarmens mikrobiom. I kontrast hertil anvender traditionel bioproduktion typisk én cellefabrik, der udfører hele produktionsprocessen alene, hvilket kan medføre høj metabolisk belastning og begrænset udbytte.

For at løse dette problem kan man anvende en strategi kaldet samsdyrkning (co-kulturering), hvor to eller flere mikrobielle stammer dyrkes sammen i samme fermenteringsmiljø, og hver stamme varetager en specifik del af processen. Én stamme kan eksempelvis omdanne substratet til et mellemprodukt, som en anden stamme videreomdanner til slutproduktet. Denne arbejdsdeling muliggør specialisering, reducerer metabolisk belastning og øger den samlede effektivitet (se figur 7).

Figur 7: I en monokultur mangler et trin i pathway’en, som kan omdanne metabolitten til slutproduktet. I en co-kulturudfører en anden cellefabrik dette trin. På den måde deles arbejdet mellem to forskellige celler.

I co-kulturer kan forskellige celler specialisere sig i forskellige funktioner, såsom nedbrydning af specifikke substrater eller produktion af bestemte molekyler. Dette gør det muligt at vælge den mest egnede celle til hvert procestrin og opnå et højere samlet udbytte. For at en co-kultur kan fungere optimalt, skal;

1. mellemprodukter frigives til mediet,
2. cellerne skal kunne vokse sammen uden at hæmme hinanden,
3. og der må ikke opstå flaskehalse som ophobning af intermediater.

Da forskellige arter kan have forskellige vækstkrav og metaboliske hastigheder, er det nødvendigt at teste miljøbetingelser og celle-ratioer for at finde et passende kompromis, hvor begge stammer trives. På trods af disse udfordringer er der stigende interesse for co-kulturering, da metoden kan øge titer, produktivitet og udbytte.

Biologisk optimering af cellen er dog kun første skridt. Cellefabrikken skal også optimeres til vækst og ydeevne under fermentering og tilpasses industrielle bioreaktorer i stor skala. Opskalering fra laboratorie- til industriel produktion er en væsentlig udfordring og behandles i næste kapitel.