• Enzymer

    Danisco og Institut for Systembiologi byder dig velkommen til dette projekt, der handler om enzymer og deres anvendelse ved brødproduktion. Projektet er udarbejdet af Luise C. Kristiansen. Formålet med projektet er at vise dig et af de spændende arbejdsfelter inden for bioteknologi, nemlig enzymteknologi. Enzymer anvendes i dag overalt i industrien, f.eks. til at gøre juice mindre grumset og til at lette indfarvning af læder. Den moderne bioteknologi har banet vejen for produktion af enzymer med nye eller tilpassede egenskaber, og der er ingen tvivl om, at brugen af enzymer vil blive endnu mere udbredt i fremtiden.

    I dette projekt vil du lære om enzymer, og hvordan de anvendes ved brødproduktion.

    For at navigere rundt i projektet anvendes menuen til venstre.

    Projektoversigt

    • Velkommen
    • Teori
      • Introduktion
      • Enzymer
      • Stivelse og amylaser
      • Gluten og proteaser
      • Arabinoxylan og xylanaser
      • Enzymatisk modifikation af lipider
      • Analysemetoder
    • Øvelser
      • Øvelse 1: Gluten og effekten af protease
      • Øvelse 2: Effekten af xylanase
      • Øvelse 3: Effekten af xylanase og amylase
    • Artikler mm.
      • Artikler fra Ingeniøren
      • Artikler fra Aktuel Naturvidenskab
    • Ordliste
  • Velkommen

    Velkommen til en verden af enzymer!

    Dette projekt handler om enzymer og deres anvendelse i brødproduktion.

    Enzymer er biologiske katalysatorer, der bruges til at accelerere biokemiske reaktioner. Enzymer anvendes i dag overalt, f.eks. i fødevareindustrien, hvor de bruges til modning af ost og til at give brød en sprødere skorpe, og i tekstilindustrien, hvor de bruges til at indfarve læder og til at forarbejde bomuld.
    Enzymer er et bæredygtigt alternativ i forhold til brugen af kemisk katalyse. I modsætning til kemisk katalyse, der ofte kræver et ekstremt miljø, virker enzymer under milde forhold, f.eks. neutral pH og/eller stuetemperatur. Dvs. anvendelse af enzymer kan reducere energiforbruget. Derudover vil produktionen af biprodukter være minimal, da enzymer er meget specifikke og typisk kun katalyserer en reaktion eller nært beslægtede reaktioner. De biprodukter, der er, vil i modsætning til kemisk affald sjældent være skadelige for mennesker og naturen. Det gør dem forholdsvis nemme at komme af med på en forsvarlig måde; det kan være, at de kan bruges til noget andet.

    Projektets opbygning
    Projektet består af en teoretisk del, der indledes med en introduktion til emnet. Herefter følger seks teoriafsnit, hvor du vil lære, hvad enzymer er, og hvordan de fungerer, samt hvilke enzymer, man anvender ved brødproduktion. Sidste teoriafsnit beskriver de analysemetoder, som man benytter til at se enzymernes effekt. Der tages udgangspunkt i de analysemetoder som Danisco benytter. Som afslutning på hvert teoriafsnit vil der være links til andet materiale, der på en eller anden måde har relation til det, som du netop har læst.
    I alle teoriafsnit vil der i højre side være biospots med fakta-bokse, der forklarer ord og begreber i teksten eller kommer med ekstra informationer. Til projektet findes også en samlet ordliste.
    Efter at du har læst og forstået det teoretiske materiale er du klar til at lave øvelser, hvor du med egne øjne vil se effekten af tre af de enzymer, som man anvender ved brødproduktion.
    Udover det teoretiske materiale og øvelserne har du mulighed for at læse artikler, der relaterer til enzymer og/eller brødproduktion.

    God fornøjelse!

  • Teori

    Der kan navigeres rundt i projektets artikler ved brug af menuen til venstre eller i oversigten nedenfor.

    • Introduktion
    • Enzymer
    • Stivelse og amylaser
    • Gluten og proteaser
    • Arabinoxylan og xylanaser
    • Enzymatisk modifikation af lipider
    • Analysemetoder

    Rigtig god fornøjelse med den teoretiske del af materialet.

    Enzymer er biologiske katalysatorer, der bruges til at accelerere biokemiske reaktioner. Enzymerne anvendes i dag overalt i fødevareindustrien, f.eks. til modning af ost, til at gøre juice mindre grumset og til at give brød en sprødere skorpe. Den moderne bioteknologi har banet vejen for produktion af enzymer med nye eller tilpassede egenskaber. Udviklingen af disse enzymer foregår bl.a. hos Danisco. Mere end hvert fjerde industrielt fremstillede brød i verden indeholder ingredienser fra Danisco. Det er f.eks. enzymer, der bruges til at gøre skorpen gylden (Fig. 1), til at give en mere ensartet krummestruktur og til at bevare friskheden af brødet i holdbarhedsperioden.

    Figur 1. Enzymer kan bl.a. bruges til at give brød en gylden skorpe. Foto fra Danisco.

    At lave et brød

    For at lave et godt brød skal man som minimum bruge mel, vand, salt og gær. Selve fremgangsmåden varierer, men følger typisk nogle bestemte trin (Fig. 2).

    Hvedemel er den vigtigste ingrediens i det meste brød. Melet indeholder unikke proteiner, der ved blanding med vand og efter æltning danner et proteinnetværk kaldt gluten, som gør, at dejen både er viskøs (flydende) og elastisk. Dette proteinnetværk betyder, at dejen kan holde på den carbondioxid, der produceres af gæren ved fermenteringen. Dermed hæver dejen, og man opnår den porøse krummestruktur, der kendetegner et brød. I Figur 3 ses en oversigt over bestanddelene i hvedemel.

     

    Enzymer og brødproduktion

    Enzymer har ved brødproduktion en vigtig rolle gennem modifikation af nogle af dejens molekyler. Det kan f.eks. være nedbrydning af stivelse og andre polysakkarider. I mel findes allerede enzymer (endogene enzymer) som f.eks. amylaser, men som regel i for små mængder til at kunne frembringe de optimale effekter. Tilsætning af enzymer (exogene enzymer) sker altså for at optimere dejens egenskaber og forbedre kvaliteten af det bagte brød. Bl.a. kan man ved tilsætning af enzymer:

    • Øge dannelsen af fermenterbare sukkere i dejen
    • Reducere den tid, det tager at blande ingredienserne
    • Ændre dejens konsistens og evne til at hæve
    • Stabilisere dejen
    • Øge den sensoriske kvalitet af brødet (krumme, smag og farve)
    • Bevare friskheden af brødet i holdbarhedsperioden

    Da strukturen og funktionaliteten af brød er stærkt afhængig af makromolekylære vekselvirkninger, er det ikke overraskende, at man tilsætter enzymer, der modificerer makromolekylerne i dejen. Disse enzymer tilsættes enten til melet før bagning og/eller sammen med de andre ingredienser, når dejen blandes.

    Figur 2. Trin i brødproduktion.

    Anvendte enzymer

    De mest anvendte enzymer i forbindelse med brødproduktion er enzymer, der katalyserer reaktioner med hhv. stivelse og ikke-stivelses polysakkaridet arabinoxylan. Dvs. enzymer, der øger reaktionshastigheden af reaktioner, hvori der indgår stivelse eller arabinoxylan. Disse enzymer kaldes amylaser og xylanaser, og er begge hydrolaser. Ud over amylaser og xylanaser anvendes også andre enzymer, der modificerer gluten (proteindelen i mel) og lipiderne.
    Hvis man vha. af enzymer ønsker at modificere og optimere bageprocesser samt det færdige brøds karakteristika, er det først og fremmest nødvendigt at have et kendskab til opbygningen af de molekyler, der påvirkes.

    Figur 3. Bestanddele i hvedemel.

    Derfor vil hver af de artikler, som beskriver de forskellige anvendte enzymer, indledes med en introduktion, der omhandler opbygningen af hhv. stivelse, gluten, ikke-stivelses polysakkaridet arabinoxylan samt lipiderne i dejen.

     

    Læs mere:

    Fakta om fødevareingredienser
    Danisco har lanceret en hjemmeside, hvor man kan læse om fødevareingredienser generelt, herunder enzymer. Via hjemmesiden er det muligt at stille spørgsmål om fødevareingredienser, og der er også en ingrediens-ordbog, hvor man kan slå ord op.

    I en levende organisme foregår mange komplicerede reaktioner, som uden hjælp af en biologisk katalysator ville gå alt for langsomt til, at man ville kunne opretholde de nødvendige livsprocesser. Katalysatorerne udgøres i en organisme især af enzymer, der øger hastigheden af kemiske reaktioner uden selv at blive forbrugt.

    Enzymers specificitet

    Enzymer, der er proteiner, er meget specifikke mht. hvilke reaktioner, de katalyser, og hvilke substrater de binder. Specificiteten opstår på grund af den tredimensionelle form og struktur af enzymet og dets aktive center. Enzymets aktive center er det sted, hvor katalytiske grupper, der kan bryde eller danne bindinger, befinder sig, og hvor substratet bindes. Hvis man kigger på hele enzymet, udgør det aktive center kun en meget lille del (6-12 aminosyrer) (Fig. 1), men det betyder ikke, at den resterende del af enzymet kan undværes. Tværtimod. Udformningen af det aktive center, de substrater, der bindes, samt de reaktioner, der katalyseres, er stærkt afhængige af hele enzymets opbygning.

    I en levende organisme foregår mange komplicerede reaktioner, som uden hjælp af en biologisk katalysator ville gå alt for langsomt til, at man ville kunne opretholde de nødvendige livsprocesser. Katalysatorerne udgøres i en organisme især af enzymer, der øger hastigheden af kemiske reaktioner uden selv at blive forbrugt.

    Enzymers specificitet

    Enzymer, der er proteiner, er meget specifikke mht. hvilke reaktioner, de katalyser, og hvilke substrater de binder. Specificiteten opstår på grund af den tredimensionelle form og struktur af enzymet og dets aktive center. Enzymets aktive center er det sted, hvor katalytiske grupper, der kan bryde eller danne bindinger, befinder sig, og hvor substratet bindes. Hvis man kigger på hele enzymet, udgør det aktive center kun en meget lille del (6-12 aminosyrer) (Fig. 1), men det betyder ikke, at den resterende del af enzymet kan undværes. Tværtimod. Udformningen af det aktive center, de substrater, der bindes, samt de reaktioner, der katalyseres, er stærkt afhængige af hele enzymets opbygning.

    Figur 1. Det aktive center er markeret med blåt. Som det ses, udgør det kun en meget lille del af enzymet. Enzymet er fordøjelsesenzymet trypsin. Den lilla struktur (et peptid) er et fragment af et større protein.

    Figur 2. Nøgle i lås. 

    Figur 3. Induced fit.

    Når et substrat bindes til det aktive center på et enzym, dannes et såkaldt enzym-substrat-kompleks (ES-kompleks). Binding af substrat til det aktive center kan finde sted på tre forskellige måder, nemlig ved hydrogenbindinger, ved elektrisk tiltrækning eller frastødning og ved hydrofobiske vekselvirkninger.
    De kræfter, der holder enzymer og deres substrater sammen, er forholdsvis svage og virker kun, hvis enzymet og substratet passer godt sammen. Af denne grund passer enzym og substrat tit sammen som en nøgle i en lås (Fig. 2).

    Da et enzym imidlertid ikke er en fast struktur, men er forholdsvis fleksibel, sker det dog oftere, at enzymet ændrer form ved binding af substrat. Dette fænomen kaldes induced fit og er illustreret i Figur 3. Substratet ændrer ofte også form.

    Ændringen i enzymets form medfører, at substratet og enzymet passer bedre sammen, og at substratet og det aktive center kommer i tæt kontakt med hinanden. Derudover kan ændringen også bruges til f.eks. at holde vand ude af det aktive center, så den reaktion, der skal katalyseres, kan forløbe uden problemer. Begge dele er tilfældet for den gruppe af enzymer, der hedder kinaser (fosfatoverførende transferaser). Disse enzymer overfører fosfatgrupper fra molekyler med højt fosfatgruppe-overførselspotentiale, som f.eks. ATP, til substrater ved en reaktion, som kaldes fosforylering. Hvis der er vand til stede ved disse reaktioner, er der en stor sandsynlighed for, at fosfatdonor-molekylerne vil hydrolyseres, og der vil i så fald ikke blive overført en fosfatgruppe til substratet.

    Figur 4. Exergone og endergone reaktioner.
    A: I en exergon reaktion, vil reaktanterne opføre sig som en kugle, der ruller ned ad en bakke. Der vil frigives energi.
    B: I en endergon reaktion skal der tilføres energi. En kugle ruller ikke op ad en bakke af sig selv.

    Ved de fleste kemiske såvel som biokemiske reaktioner, vil der enten frigives eller skulle tilføres energi. En reaktion, hvor der frigives energi, en såkaldt exergon reaktion, kan opfattes som en kugle, der ruller ned ad en bakke. Det er noget, der sker spontant, dvs. af sig selv (Fig. 4A). Omvendt vil en reaktion, der kræver energitilførsel – en endergon reaktion, ikke være spontan. På samme måde som en kugle ikke af sig selv ruller op ad en bakke (Fig. 4B).

    Det, der har betydning for, om en reaktion er spontan eller ej (exergon eller endergon), er energiindholdet – også kaldt Gibbs fri energi (G), i henholdsvis reaktanterne og produkterne i reaktionen. Denne energi afhænger især af de bindinger, der findes i molekylerne, og de vil som regel ikke være ens for reaktanter og produkter i den samme reaktion. Når der foregår en reaktion, sker der således enten et fald eller en stigning i den fri energi.
    Ændringen i den fri energi (∆G) ved en reaktion er givet som den fri energi i produkterne (Gprodukter) minus den fri energi i reaktanterne (Greaktanter):

    ΔG = Gprodukter – Greaktanter

    Hvis reaktanternes fri energi er større end produkternes (∆G < 0), betyder det, at der frigives energi ved reaktionen, og at den er spontan. Omvendt vil en stigning i fri energi (∆G > 0), dvs. en reaktion, hvor produkternes energiindhold er større end reaktanternes, betyde, at reaktionen ikke forløber spontant, men kræver energitilførsel. Se Figur 5. Det giver god mening; for at få noget med et større energiindhold, er man nødt til at tilføre energi. Og omvendt.

    Figur 5. Spontane og ikke spontane reaktioner.

    Figur 6. Kuglen ligger nu i en lille fordybning. For at den kan rulle ned ad bakken, er det nødvendigt med et energi-input.

    Ændringen i fri energi (∆G) fortæller altså, om reaktionen er spontan eller ej. Den siger imidlertid intet om, hvordan reaktionen forløber, eller hvor hurtigt det går.

     

    Aktiveringsenergi Ea

    Selvom en reaktion er spontan, kræves der ofte et input af energi, før den går i gang. Dette input kaldes aktiveringsenergien Ea.

    Hvis vi vender tilbage til kuglen på toppen af bakken (Fig. 4A) er der ingen tvivl om, at kuglen vil rulle ned. Eneste problem er blot, at kuglen nu ligger i en lille fordybning (Fig. 6). For at kuglen kan rulle ned ad bakken, skal den op af fordybningen, hvilket kræver et energi-input.

    Figur 5. Spontane og ikke spontane reaktioner.

    Det samme gør sig gældende ved kemiske reaktioner, hvor reaktanterne skal over en energibarriere, før reaktionen forløber. Aktiveringsenergien tilfører reaktanterne energi, hvilket medfører, at de passerer energibarrieren og befinder sig på en mere ustabil form. Dette er en overgangstilstand, der kaldes transition state.

    Figur 6 ses det, at lige før kuglen ruller ned, har den en højere fri energi, end da den lå i fordybningen, hvilket skyldes den tilførte energi. Det samme gælder molekyler i overgangstilstanden (transition state). De har her højere fri energi end både reaktanter og produkter (Fig. 7).

    Ændringen i fri energi (∆G) for reaktionen er uafhængig af aktiveringsenergien (Ea) samt af molekylernes fri energi, når de er i transition state. Ændringen afhænger udelukkende af den fri energi for reaktanter og produkter. I forhold til ændringen i fri energi er aktiveringsenergien normalt ikke særlig stor.

     

    Enzymers virkemåde

    Enzymer øger reaktionshastigheden ved at sænke substratets aktiveringsenergi (Ea), hvilket er det samme som at lette overgangen til transition state. Selvom aktiveringsenergien er mindre i en enzymkatalyseret reaktion, er ændringen i fri energi (∆G) ved reaktionen den samme (Fig. 8). Som nævnt afhænger ∆G kun af den fri energi i reaktanter og produkter. Den er uafhængig af om reaktionen er enzymkatalyseret eller ej.

    Figur 7. Energiforløb for en proces, der passerer en overgangstilstand. Aktiveringsenergi (Ea) og ændring i fri energi (ΔG) er vist.

    Ved dannelsen af et ES-kompleks er der forskellige katalytiske mekanismer, der kan bevirke, at aktiveringsenergien bliver mindre, og reaktionen får lettere ved at forløbe. Et par af dem er beskrevet nedenfor.

    I det tilfælde, hvor der er to substrater, der skal reagere med hinanden, er det oftest enzymets rolle at bringe de to i kontakt med hinanden og orientere dem rigtigt, således at de atomer, mellem hvilke der skal dannes nye bindinger, føres sammen (Fig. 9). Dette er måske den mest simple mekanisme, hvorved et enzym kan katalysere en reaktion.

    Aktiveringsenergien kan også mindskes, ved at de eksisterende bindinger i substratmolekylerne gøres ustabile, hvorved overgangen til transition state fremmes. Der findes enzymer, som gør dette ved at strække eller vride substratmolekylerne (Fig. 10). Det er f.eks. det, man ser ved induced fit, hvor enzym og substrat ændrer form, når ES-komplekset dannes.

    Figur 8. Enzymer sænker aktiveringsenergien. 

    Figur 9. Enzymet orienterer de to substrater rigtigt i forhold til hinanden.

    Figur 10. Enzymet belaster substratmolekylet, så de eksisterende bindinger bliver ustabile.

    Fjernelse eller tilførsel af protoner (H+) destabiliserer også substratmolekylernes bindinger, der herved bliver lettere at bryde. Det sker ved syre-base katalyse, hvor sure eller basiske sidekæder på aminosyrerne i enzymets aktive center fjerner eller overfører protoner (Fig. 11).

    Oxidoreduktaser indeholder typisk metalioner som co-faktorer. Her udnyttes metalioners evne til at optage og afgive elektroner uden at metalionerne frigøres fra enzymet. Som ved syre-base katalyse vil fjernelse eller tilførsel af elektroner til substratmolekylerne kunne destabilisere eksisterende bindinger og fremme dannelse af nye.

     

    Enzymkinetik

    Ordet kinetik stammer fra det græske ord kineein, der betyder bevæge. I forbindelse med kemi og biologi handler det om, hvordan molekyler bevæger sig, hvordan de støder ind i hinanden, og hvordan dette kan resultere i, at der sker en reaktion. Beskæftiger man sig med enzymkinetik, undersøger man enzymers reaktionshastigheder, der typisk udtrykkes ved den omdannede stofmængde af produktet pr. sekund. Ud fra reaktionshastighederne er man i stand til at beskrive enzymernes aktivitet og udtale sig om andre vigtige kendetegn ved de enzymkatalyserede reaktioner.
    I forbindelse med anvendelsen af enzymer i fødevareproduktion har enzymernes aktivitet bl.a. stor betydning for, hvor meget enzym der skal tilsættes.

     

    Læs mere:

    Proteinstruktur
    Enzymer er proteiner, hvilket vil sige, at de har en primær, en sekundær, en tertiær og i visse tilfælde også en kvarternær struktur. Disse strukturer kan du læse om i det Biotech Academy-projekt, der handler om antimikrobielle peptider.

    Michaelis-Menten modellen
    Beskæftiger man sig med enzymkinetik, vil man ofte benytte Michalis-Menten modellen. Denne model er forholdsvis simpel og gør rede for de kinetiske karateristika af de fleste enzymkatalyserede reaktioner. Du kan læse om Michaelis-Menten modellen her.  

    Figur 11. Enzymet destabiliserer bindingerne i substratmolekylet ved at give det ladninger.

    Enzyme kinetics
    Dette er en hjemmeside på engelsk, hvor du kan læse mere om enzymkinetik. For at få det fulde udbytte af hjemmesiden kan det være nødvendigt, at du i forvejen ved lidt om kinetik, f.eks. fra kemiundervisning.

    Hvis du har lyst til at lære mere om enzymkinetik har Kemi Forlaget i 2005 udgivet en god bog. Bogen hedder Enzymkinetik – Introduktion til Enzymkinetik, og den er skrevet af Hans Christian Jensen, Ulla Christensen og Jakob Schiødt (ISBN 87-89782-19-4).

     

    Michalis-menten modellen

    Generelt forestiller man sig, at omdannelsen af et substrat til produkt sker via to trin:

    1. Dannelse af ES-kompleks (binding af substrat til enzym).
    2. Omdannelse af substrat til produkt og frigørelse af produkt fra enzym.

    Dette kan også beskrives ved følgende model:

     

    Et substrat (S) bindes til et enzym (E) og danner et ES-kompleks (ES). Dette sker med hastighedskonstanten k1.  Nu kan der så ske én af to ting. Enten vil enzymet og substrat gå fra hinanden igen (dissocieres) – dette vil ske med hastighedskonstanten k-1. Eller også vil reaktionen fortsætte, og der vil dannes produkt (P) med hastighedskonstanten k2. Dannelsen af ES-komplekset sker som regel hurtigt, hvorimod selve dannelsen af produkt er langsommere, og derfor kaldes det hastighedsbestemmende trin. Dvs. k-1 er som regel meget større end k2.

    Modellen herover er den simpleste model, der gør rede for de kinetiske karakteristika af de fleste enzymkatalyserede reaktioner. Den kaldes Michaelis-Menten modellen opkaldt efter tyskeren Leonor Michaelis og canadieren Maud Menten, der fremsatte den tilbage i 1913. Det særlige ved denne model er, at ES-komplekset fungerer som en intermediat i reaktionen

     

    Michaelis-Menten ligningen

    Ud fra Michaelis-Menten modellen og en antagelse om, at koncentrationen af ES-kompleks er konstant, kan man opskrive et matematisk udtryk, der beskriver, hvordan hastigheden af reaktionen – dvs. omdannelsen af substrat til produkt, afhænger af koncentrationerne af substrat og enzym samt af hastighedskonstanterne i de forskellige trin i reaktionen.
    Dette udtryk kaldes Michaelis-Menten ligningen, og ser ud som følger:

    Hvor Michaelis-Menten konstanten KM er givet som:

    Figur 1. Vmax som funktion af substratkoncentration [S].

    Ved lav substratkoncentration, dvs., når [S] << KM, vil hastigheden af reaktionen være proportional med substratkoncentrationen:

    Når substratkoncentrationen bliver meget højere en KM ([S] >> KM) fås:

    I denne situation er reaktionshastigheden således uafhængig af koncentrationen af substrat. I det specielle tilfælde, hvor substratkoncentrationen er lig Michaelis-Menten konstanten ([S] = KM) fås:

    I mange enzymkatalyserede reaktioner indgår der mere end et substrat eller enzymet har mere end et aktivt center. I så fald kan man ikke benytte Michaelis-Menten modellen og ligningen beskrevet ovenfor. Man må da tage andre mere omfattende midler (modeller og ligninger) i brug.

    Betydningen af KM og Vmax 
    Michaelis-Menten konstanten KM har enheden mol pr. liter (M), og ligger typisk mellem 10-1 og 10-7 M. Den afhænger af flere forskellige faktorer som f.eks. temperatur og pH.
    Idet, at KM er den koncentration af substrat, hvor halvdelen af enzymmolekylernes aktive centre er fyldte, og reaktionshastigheden er halvdelen af Vmax, kan KM bruges som et mål for, hvor høj substratkoncentrationen skal være, for at man opnår en acceptabel reaktionshastighed.

    KM var givet som:

    Hvis hastigheden, hvormed enzymet og substratet dissocieres, er meget større end hastigheden, hvormed der dannes produkter (k-1>>k2), kan KM skrives som:

    I dette tilfælde er Michaelis-Menten konstanten KM lig med dissociationskonstanten for ES-komplekset. En høj KM-værdi fortæller, at k1 er mindre end k-1, hvilket vil sige, at der er en svag binding mellem enzymet og substratet, og der er en stor sandsynlighed for at ES-komplekset opløses. Omvendt fortæller en lav KM-værdi, at der er en stærk binding mellem substrat og enzym.

    Men huskKM kan kun bruges til at sige noget om affiniteten mellem enzymet og substratet, hvis k-1 er meget større end k2.

    Den enzymkatalyserede reaktions maksimale hastighed Vmax angiver antallet af substratmolekyler, der omdannes af enzymet til produkt pr. tidsenhed, hvis enzymet er mættet. Vmax er ligesom KM afhængig af temperatur og pH. Vmax ligger normalt mellem 1 og 104 substratmolekyler pr. sekund.

    Simpel bestemmelse af KM og Vmax 
    Hvis en enzymkatalyseret reaktion kan beskrives vha. Michaelis-Menten ligningen, og hvis reaktionshastighederne er målt ved forskellige kendte substratkoncentrationer, bruges specielle computerprogrammer til at bestemme Michaelis-Menten konstanten KM samt den maksimale reaktionshastighed Vmax. Man kan ikke umiddelbart bestemme de forskellige hastighedskonstanter, der indgår i KM.
    Det er dog også muligt i hånden at bestemme KM og Vmax ud fra de samme data eller vha. et mere simpelt program som f.eks. Microsoft Excel. Først skal Michaelis-Menten ligningen dog omskrives. Dette gøres ved først at dividere brøken med [S] i både tæller og nævner:

    Så tages den reciprokke værdi på begge sider:

    Det ses, at denne ligning er på formen:

    Dvs. plottes 1/v0 som funktion af 1/[S] fås en ret linje med hældningen KM/Vmax, der skærer y-aksen i 1/Vmax og x-aksen i 1/KM. Et sådan plot kaldes et Lineweaver-Burk plot eller et dobbelt reciprokt plot. Plottet er vist i Figur 2.

    Figur 2. Lineweaver-Burk plot.  

     

    Læs mere:

    Enzyme kinetics
    Dette er en hjemmeside på engelsk, hvor du kan læse mere om enzymkinetik. For at få det fulde udbytte af hjemmesiden kan det være nødvendigt, at du i forvejen ved lidt om kinetik, f.eks. fra kemiundervisning.

    Hvis du har lyst til at lære mere om enzymkinetik har Kemi Forlaget i 2005 udgivet en god bog. Bogen hedder Enzymkinetik – Introduktion til Enzymkinetik, og den er skrevet af Hans Christian Jensen, Ulla Christensen og Jakob Schiødt (ISBN 87-89782-19-4).

    Stivelse udgør størstedelen af de fordøjelige kulhydrater i hvedemel. Navnet stivelse dækker over to typer kulhydrater – henholdsvis amylose og amylopektin, der har det tilfælles, at de begge er polysakkarider og opbygget af monosakkaridet glukose.

    I amylose er glukosemolekylerne udelukkende sat sammen ved hjælp af α-(1,4)-glykosidbindinger. Det betyder, at amylose er uforgrenet – en lang kæde af glukosemolekyler (Fig. 1).

    Figur 1. Amylose. 

    Amylopektin indeholder både α-(1,4)- og α-(1,6)-glykosidbindinger. Derfor er amylopektin i modsætning til amylose et forgrenet molekyle (Fig. 2). I amylopektin fra hvede er afstanden mellem α-(1,6)-forgreningerne mellem 12 og 25 glukosemolekyler.

     

    Stivelseskorn

    I naturen optræder stivelse i form af nogle små sfæriske partikler – såkaldte stivelseskorn, hvis størrelse og form afhænger af plantearten. I disse stivelseskorn er amylose og amylopektin organiseret i forskellige lag kaldt lameller (Fig. 3). Nogle af disse lag er mere ordnede end andre pga. korte kæder fra amylopektin, der går sammen to og to og danner en dobbelthelix. Amylose og uordnede kæder fra amylopektin findes i de andre lag.

    Figur 2. Her ses amylopektin. I den røde cirkel er der zoomet ind på en forgrening.

    Stivelse fra hvede indeholder både store og små stivelseskorn, der har en forholdsvis rund struktur (Fig. 4). De store stivelseskorn har en diameter, der ligger på mellem 22 μm og 35 μm, hvorimod diameteren af de små stivelseskorn er mellem 2 μm og 3 μm. I hvedemel vil der både være intakte og ødelagte stivelseskorn.

     

    Gelatinisering og retrogradering

    Stivelseskorn er uopløselige i vand under stuetemperatur men suger vand til sig, efterhånden som temperaturen stiger. På et tidspunkt nås en kritisk temperatur (omkring 60 °C), hvor de bindinger mellem stivelsesmolekylerne, der holder kornene sammen, bliver svagere, og stivelseskornene begynder at svulme op. Når dette sker, stiger viskositeten af opløsningen, dvs. den bliver mere tyktflydende. Dette fænomen kaldes gelatinisering eller forklistring. Bliver man ved med at øge temperaturen, vil stivelseskornene til sidst gå i stykker, og viskositeten vil falde igen.
    Retrogradering er næsten det omvendte af gelatinisering. Stivelseskornene bliver ikke gendannet, men der sker en reorganisering af stivelsesmolekylerne, der igen indordner sig i forhold til hinanden og danner bindinger. Retrogradering er med til at gøre gammelt brød hårdt, men andre faktorer kan også have betydning – herunder vandindholdet i brødet.

    Figur 3. Stivelseskorn. De blå cirkler på figuren til venstre viser de lag, hvor kæderne fra amylopektin er tæt pakkede. Lagene kan fornemmes på fotografiet til højre.

    Amylaser og deres effekt

    Amylaser er enzymer, der hydrolyserer glykosidbindinger i polysakkarider som f.eks. stivelse (Fig. 5). Amylaser er hydrolaser. De findes overalt i naturen bl.a. i spyt, og vil ligesom alle enzymer have forskellige egenskaber som f.eks. pH- og temperaturoptimum alt efter, hvor de kommer fra. I forbindelse med brødproduktion er α- og β-amylase de to mest anvendte amylaser.

     

    α- og β-amylase

    α- og β-amylase nedbryder begge stivelse til mindre molekyler og har således samme substrat, men de to enzymer virker ikke ens. α-amylase er en endoamylase og hydrolyserer α-(1,4)-glykosidbindinger inde i stivelsesmolekylet, mens β-amylase er en exoamylase, der hydrolyserer α-(1,4)-glykosidbindinger fra den ikke-reducerende ende af stivelsemolekylet. Det betyder, at α-amylase mere eller mindre tilfældigt klipper de lange stivelsesmolekyler i mindre stykker af varierende længde, hvorimod β-amylase frigør to sammenhængende glukosemolekyler (maltose) ad gangen. Forskellen mellem de to amylaser er illustreret vha. nedbrydelsen af amylopektin i Figur 6.

    De to enzymer har samme substrat, men det er deres tredimensionelle struktur, der afgør, hvor og hvordan de bindes til stivelsesmolekylerne og dermed hvilke bindinger, de kan hydrolysere. Se Figur 7 og Figur 8.

    Figur 7. Den tredimensionelle struktur af α-amylase. Det aktive center, hvor α-amylasen hydrolyserer α-(1,4)-glykosidbindingen, er markeret med blåt. De gule pile indikerer, at stivelsesmolekylet fortsætter.

    Figur 5. Hydrolyse af en α-(1,4)-glykosidbinding i amylose. 

    Figur 6. Nedbrydning af amylopektin vha. α- og β-amylase.

    Effekten af amylaser

    I dejen kan α- og β-amylase kun hydrolysere de stivelseskorn, der er blevet ødelagt under formalingen af korn til mel. Dvs. mængden af tilgængeligt substrat er ret begrænset. Ikke desto mindre vil hydrolysen af de tilgængelige stivelsesmolekyler øge mængden af fermenterbare sukkere, dvs. maltose, som gærcellerne efter spaltning med enzymet maltase, kan omdanne til bl.a. carbondioxid ved fermentering, hvorved dejen hæver. Når brødet bages, gelatiniserer stivelseskornene og bliver mere følsomme over for amylaserne. β-amylase inaktiveres typisk omkring de temperaturer, hvor stivelseskornene gelatiniserer. Af denne grund er det primært α-amylase, der nedbryder stivelsen og påvirker brødets endelige struktur. Da gæren i brødet dør ved høje temperaturer, fermenteres der ikke længere sukker, som derfor i stedet bl.a. forsøder brødet.
    Hvis enkelte af de amylaser, der bruges, stammer fra bakterier, vil enzymerne ikke nødvendigvis denatureres pga. høje temperaturer. Dvs. de vil stadig være virksomme, når brødet er bagt. Disse bakterielle amylaser har en positiv effekt på brødet.  De hæmmer dannelsen af bindinger, der gør brødet hårdt, hvorfor brødet er friskt i længere tid, men den præcise mekanisme er endnu ikke helt forstået. Et eksempel er amylase fra den termofile bakterie Bacillus stearothermophilus, der bruges til at opnå blødhed i brødet og samtidig er i stand til at bevare elasticiteten. Denne amylase er egentlig en exoamylase, men har også en smule endoamylaseaktivitet.

     

    Læs mere:

    Gæring
    Gærcellers omdannelse af sukkere til alkohol (ethanol) og carbondioxid udnyttes også, når man skal brygge øl. Det kan du læse mere om i det Biotech Academy projekt, der handler om øl.

    Figur 8. Den tredimensionelle struktur af β-amylase. I firkanten ses et tværsnit af den lomme, hvor stivelsesmolekylet bindes. Det ses, at β-amylasen er en exoamylase. Det aktive center, hvor β-amylasen hydrolyser α-(1,4)-glykosidbindingen er markeret med blåt. Den gule pil indikerer, at stivelsesmolekylet fortsætter. Ved hydrolyse frigøres de to gule sammenhængende glukosemolekyler.

    Proteindelen i mel er lille sammenlignet med mængden af stivelse. Den udgør 10-14 %, hvor mængden af stivelse udgør 80-85 %. Ikke desto mindre er det proteindelen, der er ansvarlig for dannelsen af et unikt viskøst og elastisk proteinnetværk kaldt gluten. Dette proteinnetværk er specielt for hvedemel. Gluten dannes, når melet indeholdende de to proteintyper gliadin og glutenin blandes med vand, og dejen æltes.

     

    Gliadiner og gluteniner

    Gliadiner er globulære og symmetriske proteiner. Gluteniner er store og langstrakte komplekser af flere forskellige proteiner, og har derfor et langt større overfladeareal (Fig. 1). Både gliadiner og gluteniner indeholder svovlbroer(disulfidbindinger). I gliadiner er de primært intramolekylære, mens gluteniner indeholder både intra- og intermolekylære svovlbroer.

    Begge proteintyper er uopløselige i vand og har et højt indhold af aminosyrerne glutamin og prolin. I modsætning til mange andre proteiner er der kun en meget lille del af de to glutenproteiners sekundære struktur, der har α-helixkonformation. Dette skyldes sandsynligvis den høje koncentration af prolin og denne aminosyres særlige konfiguration.

    Figur 1. Gliadiner (øverst til venstre), gluteniner (øverst til højre) og gluten (nederst).

    Gluten er både viskøs og elastisk. Det kan strækkes uden at gå i stykker, og det har en tendens til at vende tilbage til sin oprindelige form, efter at man har strakt det. En dej uden gluteniner ville være meget flydende, mens en dej uden gliadiner ville være sej og gummiagtig. Det er netop kombinationen af de to, der giver dejen dens unikke konsistens.  

     

    Dannelse af glutennetværket

    Idet mel og væske blandes, absorberer gliadin og glutenin en masse vand. Når dejen efterfølgende bearbejdes ved æltning vil de store og langstrakte gluteninproteiner omslutte de mindre og globulære gliadinproteiner, og der vil efterhånden dannes et tredimensionelt glutennetværk bestående af langstrakte proteinplader, der strækker sig gennem hele dejen. Det dannede glutennetværk stabiliseres af både intra- og intermolekylære bindinger som f.eks. hydrogenbindinger, svovlbroer og dityrosinbindinger (binding mellem to tyrosin-aminosyrer). Endvidere har det vist sig, at de polære lipider i dejen også har betydning for stabiliteten via vekselvirkningen med glutennetværket.
    Glutennetværket stabiliserer små gaslommer, der indeholder det carbondioxid, som gærcellerne producerer ved fermentering af bl.a. maltose. Det er årsagen til, at brødet hæver. Ved bagning størkner glutennetværket pga. de høje temperaturer og bliver stift. Gaslommerne er nu fyldte med luft og gelatiniserede (forklistrede) stivelseskorn.

     

    Proteaser og deres effekt

    Enzymer, der hydrolyserer peptidbindinger i proteiner (Fig. 2), og derved nedbryder dem, kaldes proteolytiske enzymer eller proteaser. De tilhører gruppen af hydrolaser.

    Analogt til amylaser kan man dele proteaser op i endopeptidaser og exopeptidaser. Endopeptidaser, som f.eks. fordøjelsesenzymerne pepsin, trypsin og chymotrypsin, hydrolyserer peptidbindinger inde i proteinet (Fig. 3). Endopeptidaserne genkender bestemte aminosyre-sidegrupper og hydrolyserer peptidbindingen ved siden af disse. Exopeptidaser hydrolyserer peptidbindinger mellem terminale aminosyrer og selve proteinet. Det kan enten være fra den ene ende, hvor der er en fri aminogruppe eller den anden, hvor der er en fri carboxylsyregruppe. Disse exopeptidaser kaldes hhv. amino-peptidaser og carboxy-peptidaser (Fig. 3).

    De fleste aminopeptidaser og visse carboxypeptidaser har metalioner som co-faktorer. Disse sidder permanent bundet til enzymerne og kaldes derfor prostetiske grupper. I Figur 4 og Figur 5 ses tværsnit af en aminopeptidase og en carboxypeptidase. I begge figurer vises tværsnittet af hele enzymet. Der er fokus på den lomme, hvor proteinet bindes, og peptidbindingen hydrolyseres.

    Figur 2. Hydrolyse af en peptidbinding.

    Figur 3. Forskellen mellem amino-peptidaser, carboxy-peptidaser og endopeptidaser.

    Figur 4. Tværsnit af en aminopeptidase. Tværsnit af hele enzymet. Den lyserøde pil viser, hvor metalionerne sidder. I dette tilfælde er der to metalioner, begge coboltioner. Den gule pindestruktur er en peptidanalog. I firkanten nederst til venstre ses enzymets tredimensionelle struktur. Den gule pil viser lommen, og hvor det protein, der hydrolyseres, sidder.

    Figur 5. Tværsnit af en carboxypeptidase. Tværsnit af hele enzymet. Den lilla pil viser, hvor metalionen sidder. I dette tilfælde er der en metalion, en zinkion. Den gule pindestruktur er en peptidanalog. I firkanten nederst til venstre ses enzymets tredimensionelle struktur. Den gule pil viser lommen, og hvor det protein, der hydrolyseres, sidder.

    I brødproduktion anvender man både endopeptidaser og exopeptidaser. Dette skyldes, at endopeptidasers spaltning af peptidbindinger kan resultere i dannelsen af nogle bestemte peptider, der giver brødet en bitter smag. Ved også at tilsætte exopeptidaser kan man få nedbrudt disse uønskede peptider. Desuden afhænger viskositeten af dej bl.a. af størrelsen og formen på de proteiner, der er til stede. Jo større proteiner, jo mere viskøs (tyktflydende) dej. Exoproteaser har ikke særlig stor effekt på størrelsen af proteinet og derfor heller ikke på viskositeten, hvorimod endoproteaser er i stand til at nedsætte viskositeten drastisk ved f.eks. at halvere proteinet (klippe det over på midten). Proteaserne inaktiveres (denatureres), når brødet bages.

    Proteaser kan bruges til at nedbryde gluten, hvilket vil gøre dejen blødere, mere smidig og elastisk. Det betyder, at dejen er nemmere at blande og har et bedre flow. I industrien, hvor man benytter maskiner og brødforme ved fremstilling af brød, er det fordelagtigt, at dejen nemt blandes og fordeles i forme. Ved at gøre dejen mere elastisk øger protease glutennetværkets evne til at tilbageholde carbondioxid og giver en bedre krumme.
    Når det kommer til smag og farve af brødet, spiller både proteaser og amylaser en vigtig rolle. Dette skyldes, at dannelsen af både frie aminogrupper og sukkere medvirker til at forbedre smagen af brødet og skorpens farve viaMaillard reaktioner.

    Andre enzymer, der påvirker glutennetværket 
    Som nævnt sørger glutennetværket for at stabilisere de voksende gaslommer, der er dannet ved fermentering. Oxidoreduktaser som f.eks. peroxidase eller glukoseoxidase kan bruges til at styrke glutennetværket ved bl.a. at fremme dannelsen af svovlbroer i gluten og dermed øge brødvolumenet.
    Enzymet transglutaminase, der katalyserer dannelsen af kovalente krydsbindinger mellem proteinerne (ikke svovlbroer), kan også styrke glutennetværket samt øge dejens evne til at binde vand og dermed påvirke krummen.

     

    Læs mere:

    Proteinstruktur
    Proteiner har en primær, en sekundær, en tertiær og i visse tilfælde også en kvartenær struktur. Du kan læse om disse proteinstrukturer i det Biotech Academy-projekt, der handler om antimikrobielle peptider.

    Gæring
    Gærcellers omdannelse af sukkere til alkohol (ethanol) og carbondioxid udnyttes også, når man skal brygge øl. Det kan du læse mere om i det Biotech Academy-projekt, der handler om øl.

    Hvedemel indeholder andre polysakkarider end amylose og amylopektin. Disse polysakkarider kaldes ikke-stivelses polysakkarider. Da xylanaser sammen med amylaser er de mest anvendte enzymer i forbindelse med brødproduktion, er det vigtigste ikke-stivelses polysakkarid i denne forbindelse xylanasernes substrat arabinoxylan. Arabinoxylan er først og fremmest opbygget af monosakkaridet xylose (Fig. 1).

    Xylosemolekylerne sidder sammen vha. β-(1,4)-glykosidbindinger, og danner polymeren xylan. Til nogle af xylosemolekylerne er der bundet monosakkaridet arabinose (Fig. 2).

    Arabinose kan være bundet til C2 og/eller C3 på xylosemolekylerne via hhv. α-(1,2)- og α-(1,3)-glykosidbindinger. Arabinosemolekylerne kan via esterbindinger være bundet til fenolsyrer – især til ferulinsyre. Se Figur 3.

    Arabinoxylaner deles normalt op i to grupper, alt efter om det kan opløses i vand eller ej. Der findes opløseligt arabinoxylan og uopløseligt arabinoxylan. Det er endnu ikke helt klarlagt, hvad forskellen i opløselighed skyldes, men fordelingen af arabinosemolekyler langs xylankæden har antagelig en stor betydning.

    Figur 1. Xylose.

    Figur 2. Arabinose.

    Figur 3. Struktur af arabinoxylan. Den lange kæde består af xylosemolekyler, hvortil der er bundet fem arabinosemolekyler. Arabinosemolekylet øverst til højre er bundet til ferulinsyre. Esterbindingen er markeret med rødt. 

     

    Xylanaser og deres effekt

    Vigtigst for nedbrydning af arabinoxylan er de xylanaser, der katalyserer spaltningen af β-(1,4)-glykosidbindinger mellem to xylosemolekyler inde i arabinoxylanmolekylet (Fig. 6). Derved frigives der mindre kæder af arabinoxylan af varierende længde. Disse enzymer kaldes endo-β-(1,4)-xylanaser. De mange arabinosemolekyler i arabinoxylan bevirker, at endo-β-(1,4)-xylanaserne ikke altid kan bindes til arabinoxylan pga. sterisk hindring. Det er derfor ikke alle glykosidbindinger, der kan hydrolyseres.

    Figur 4. Arabinoxylans indflydelse på glutennetværket og stabilisering af gaslommerne.
    A: Gaslommerne i brødet stabiliseres af opløseligt arabinoxylan. B: Uopløseligt arabinoxylan er en fysisk barriere, der hindrer dannelsen af glutennetværket.

    Figur 5. Vandbindende egenskaber af melets bestanddele.

    Xylanaser bruges i stort omfang i forbindelse med brødproduktion for at øge stabiliteten af dejen, brødvolumenet og friskheden samt for at forbedre krummestrukturen.  De foretrukne xylanaser er dem, der nedbryder det uopløselige arabinoxylan. Hos forskellige xylanaser ses en bemærkelsesværdig forskel i specificitet, når man sammenligner aktiviteten over for opløseligt arabinoxylan med aktiviteten overfor uopløseligt arabinoxylan. Det er dog svært at sige hvorfor, da man endnu ikke helt forstår den strukturelle forskel imellem opløseligt og uopløseligt arabinoxylan. Nedbrydning af det uopløselige arabinoxylan er fordelagtigt ved brødproduktion, da det som nævnt kan hindre dannelsen af glutennetværket.
    Når det uopløselige arabinoxylan nedbrydes, mindskes dets vandbindende egenskaber. Vandet, der frigives, vil kunne bruges til at hydrere gliadin og glutenin og dermed fremme dannelsen af glutennetværket. Senere i bageprocessen kan vandet være med at hydrere stivelsen og dermed blødgøre brødet. Når det uopløselige arabinoxylan nedbrydes og bliver opløseligt, stiger mængden af opløseligt arabinoxylan naturligvis. Dermed forstærkes den positive effekt af uopløseligt arabinoxylan.

    Andre enzymer

    Peroxidaser (oxidoreduktaser) kan ud over at styrke glutennetværket ved at fremme dannelsen af svovlbroer, også katalysere krydsbinding af arabinoxylan. Det sker ved dannelse af ferulinsyredimerer (bindinger mellem to ferulinsyremolekyler) (Fig. 7). Dannelsen af ferulinsyredimerer bidrager til at styrke dejen – muligvis pga. interaktioner med glutennetværket.

     

    Læs mere:

    Lignocellulose

    Arabinoxylan er en del af lignocellulose, som udgør 75-98 % af alle grønne planter. Lignocellulose bruges bl.a. til at lave bioethanol. Du kan læse om lignocellulose i det Biotech Academy projekt, der handler om bioethanol.

    Figur 6. Hydrolyse af arabinoxylan.

    Figur 7. Krydsbinding af arabinoxylan via dannelse af en ferulinsyredimer.

    I forhold til mængden af kulhydrater og proteiner udgør lipiderne i mel kun en meget lille del (1-2 %). Omkring halvdelen af lipiderne er ikke-polære, mens den anden halvdel er polære lipider (Fig. 1). De ikke-polære lipider kan bl.a. være tri-, di- eller monoglycerider samt frie fedtsyrer. De polære lipider udgøres af fosfolipider og glykolipider.

    Figur 2-4 nedenfor ses et triglycerid, fosfatidylcholin (et fosfolipid) og digalactosyl diglycerid (et glykolipid).

    Figur 1. Lipidsammensætning i mel.

    Figur 2. Triglycerid.

    Figur 3. Fosfatidylcholin (et fosfolipid).

    Figur 4. Digalactosyl diglycerid (et glykolipid).

    Lipider i dej vekselvirker med både stivelsen og glutennetværket. Dannelsen af stivelse-lipid-komplekser har betydning for både gelatinisering og retrogradering af stivelsesmolekylerne. F. eks. kan glykolipider bindes til overfladen af stivelseskornene og i en vis grad bremse gelatinisering. Amylose-lipid-komplekser kan sterisk hindre retrogradering. Lipidernes vekselvirkninger med glutennetværket er derfor med til at stabilisere det.

    Enzymatisk modifikation af lipider

    I forbindelse med brødbagning er enzymatisk modifikation af lipider vha. lipaser endnu ikke lige så udbredt som modifikation af stivelse og gluten, men brugen af lipidmodificerende enzymer er stigende. For nyligt har man opdaget fordelen ved at anvende en ny slags lipaser, der kan modificere både triglycerider, fosfolipider og glykolipider. Disse lipaser øger brødvolumenet og giver en fin og ensartet krummestruktur, samtidig med at de styrker dejen. Disse effekter menes at være forårsaget af omdannelsen af digalactosyl diglycerider (glykolipider) til digalactosylmonoglycerider (Fig. 5), fosfolipider til lysofosfolipider (Fig. 6) og triglycerider til di- og monoglycerider (Fig. 7). Dvs. alle reaktioner, hvor der sker en fraspaltning af en fedtsyre. Se figurerne nedenfor.

    Figur 5. Hydrolyse af digalactosyl diglycerid (DGDG) til digalatosyl monoglycerid (DGMG) og en fri fedtsyre. 

    Figur 6. Hydrolyse af et fosfolipid til et lysofosfolipid og en fri fedtsyre. X står er en variabel, polær gruppe, f.eks. cholin som i figur 3.

    Figur 7. Hydrolyse af triglycerid til monoglycerid og to frie fedtsyrer.

    Størst effekt får man ved en lipase, der modificerer de polære lipider – fosfolipiderne og glykolipiderne. De polære lipider fremmer gennem vekselsvirkning med glutennetværket dannelsen af små ensartedeuniforme gaslommer, der er meget stabile og fleksible. Brødets endelige volumen og krumme afhænger i høj grad af disse gaslommers stabilitet og struktur. Ved modifikation af de polære lipider kan man øge stabiliteten og ensartetheden af gaslommerne og dermed opnå et mere homogent glutennetværk, hvilket stabiliserer dejen og forbedrer kvaliteten af det færdige brød ved at give en ensartet krumme.

     

    Læs mere:

    Den biologiske cellemembran
    Størstedelen af lipiderne i biologiske cellemembraner udgøres af fosfolipider. Du kan læse mere om fosfolipider og cellemembraner i det Biotech Academy-projekt, der handler om antimikrobielle peptider.

    For at analysere virkningen af deres enzymer udfører Danisco en lang række eksperimenter. Disse er typisk praktisk orienterede og derfor udformet som deciderede bageforsøg, men under laboratorieforhold (Fig. 1).

    Figur 1. Fotografier fra bageriet hos Danisco, Brabrand. Fotos fra Danisco.

     

    Ved vurdering af enzymer kan der indgå analyser af dejen, men det vil først og fremmest være selve brødet, der bedømmes. Hvad der anses for god brødkvalitet er selvfølgelig subjektivt, men der er dog bestemte egenskaber, som de fleste foretrækker. Det kan f.eks. være ensartethed (ingen enorme huller forårsaget af store luftbobler), en god overflade (sprød og gylden skorpe), en god krumme (hverken for sej eller for blød), volumen (forbrugerne vil oftest vælge det største brød, hvis de har muligheden), og at brødet holder sig friskt længe. Derudover er der fra producenternes side en vis interesse i, at dejen er stabil i processen, dvs. at den ikke falder sammen ved transport på samlebånd eller under bagning, og at brødet kan pakkes og transporteres uden at blive ødelagt. Og så skal brødet selvfølgelig smage godt. Det er ikke op til enzymerne alene at få brødet til at opfylde alle disse kriterier. Meget afhænger også af ingredienserne (melet, gæren mm.), af bageprocessen, af opbevaringen af brødet osv. Men ved hjælp af enzymerne kan man komme et godt stykke af vejen.

    I det følgende gennemgås en række af de metoder, som Danisco bruger til at måle effekten af deres enzymer.

    Bestemmelse af enzymaktivitet

    For at bestemme, hvordan enzymerne skal doseres, undersøger Danisco enzymaktiviteten af alle deres enzymer ved den temperatur og pH, der svarer til de omstændigheder, hvor enzymerne skal anvendes. Bestemmelsen af enzymaktiviteten sker vha. assays, hvor man enten måler substratforbruget eller mængden af dannet produkt. Man kan bl.a. bestemme enzymaktiviteten ved at måle initialhastigheden ved forskellige substratkoncentrationer, hvilket typisk sker med et spektrofotometer.

     

    Tredimensionale billeder af dej

    Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) er en teknik, der af Danisco bruges til at opnå tredimensionale billeder af dej. Herved kan strukturen af dejen, dvs. fordeling og størrelse af luftlommer mm. evalueres. CLSM tager endimensionale billeder af dejstrukturen i forskellige niveauer. Med brug af en computer kan man samle alle disse, hvorved man får et tredimensionalt billede. Computeren giver desuden de forskellige komponenter i brødet forskellige farver. Hos Danisco farves lipiderne røde og proteiner, gærceller og stivelseskorn grønne (Fig. 2).

    Andre analyser af dejen involverer undersøgelse af modstandskraften, når man trækker i den, elasticiteten og udvidelsesevnen.

    Figur 2. CLSM af dej med tilsat lipase. Foto fra Danisco.

    Bedømmelse af brød

    Forskellen mellem forskellige mængder af tilsat enzym kan bedømmes ved direkte sammenligning af brødene. Her ser man f.eks. på volumen, skorpe eller form. Brødvolumenet bestemmes med et volumeter (Fig. 3). Volumeteret er en beholder, hvori man anbringer brødet. Beholderen fyldes nu op med et kendt volumen rapsfrø (eller andre korn, der alle har samme har størrelse og form), der lægger sig rundt om og over brødet. Det samlede volumen af rapsfrø og brød kan aflæses på volumeteret. Da man kender volumenet af rapsfrø, kan brødvolumenet nemt bestemmes.

     

    Kender man brødvolumenet, kan man bestemme dets specifikke volumen. Det er det reciprokke af densiteten. I denne forbindelse angives det specifikke volumen i cm3/g, som også skrives ccm/g. Det specifikke volumen kan bruges til at give en idé om, hvor mange luftbobler brødet indeholder. Et lille specifikt volumen svarer til få luftbobler.

     

    Brødets friskhed

    Kompressionsanalyser bruges til at måle brødets fasthed og til at bedømme dets friskhed. I begge tilfælde presses en skive brød sammen af en maskine. Hvis man skal måle brødets fasthed, ser man på, hvor stor en kraft, der skal benyttes for at presse skiven en given afstand sammen. Jo større kraft, desto mere fast er brødet. Når man bedømmer friskheden, ser man omvendt på, hvor meget en given kraft presser skiven sammen. Det er godt, hvis skiven presses meget sammen, da en blød skive er tegn på et friskt brød.

     

    Detaljeret analyse

    Selvom de ovenstående metoder til bestemmelse af f.eks. brødvolumen og blødhed er kvantitative, er de ikke tilstrækkelige. For at få et indblik i de kemiske processer, der foregår under bageprocessen, må benyttes mere avancerede metoder. Kun på denne måde kan man få en detaljeret viden om enzymernes effekt.

    Figur 3. Et simpelt volumeter. Foto fra Danisco.

    Figur 4. Tyndtlagskromatografi.

    En af disse metoder er tyndtlagskromatografi (Thin Layer Chromatography – TLC). Tyndtlagskromatografi er en hurtig og nem måde, der kan bruges til at adskille forskellige komponenter i en prøve og efterfølgende identificere dem vha. referencer – dvs. molekyler, som man kender. Adskillelsen sker ved, at en væske (en mobil fase) trænger op gennem en TLC-plade (en stationær fase). Den mobile fase opløser prøven og trækker de forskellige komponenter i prøven med sig. De enkelte komponenter påvirkes forskelligt af den stationære fase. Alt efter hvilken komponent, det er, vil den bevæge sig med væsken en bestemt afstand fra det punkt, hvor prøven blev afsat (Fig. 4). En TLC-plade består typisk af en metal-, glas- eller plasticplade, hvorpå der er et tyndt lag af f.eks. kiselgel. TLC er en analysemetode, der især bruges til at undersøge effekten af forskellige lipaser.

    En anden metode er HPLC. HPLC står for High Performance Liquid Chromatography. Metoden bruges til at adskille forskellige bestanddele i den prøve, der ønskes undersøgt. Ved denne metode kan stoffer med f.eks. forskellig molekylestørrelse, forskellig ladning eller forskellige funktionelle grupper adskilles. Ved HPLC har man en stationær (stillestående) fase, der består af et eller flere rør med en masse små porøse gelékugler. Disse rør kaldes kolonner. Gennem den stationære fase pumper man den mobile (bevægelige) fase, der f.eks. består af en saltopløsning. Den prøve, man vil analysere, sprøjtes ind (injiceres) og transporteres gennem kolonnen vha. den mobile fase (eluentet). De forskellige bestanddele i prøven vil ikke bevæge sig gennem kolonnen med samme hastighed og bliver dermed adskilt fra hinanden. De vil altså komme ud af kolonnen på forskellige tidspunkter. Vha. en detektor og en computer kan man se, hvornår det sker. Se Figur 5.

    Figur 5. HPLC

    Figur 6: Eksempel på massespektrum af digalactosyl monoglycerid. Se original MS-MS spectrum fra Danisco.

    Ud over de beskrevne metoder benytter Danisco sig bl.a. også af sensoriske tests, hvor paneler med forsøgspersoner bedømmer, hvordan brødet smager, dufter og føles med munden og med fingrene.

     

    Læs mere:

    Artikler
    Hvis du kunne tænke dig at læse mere om enzymer, har vi her samlet en række artikler. Artiklerne omhandler forskellige ting, men de har alle det tilfælles, at det drejer sig om enzymer.

    Figur 7. Forskellige fragmenter af digalactosyl monoglycerid. Sammenlign med figur 6. Den bruttoformel og masse, der står over den stiplede linje, hører til den del af molekylet, der ligger over linjen. Tilsvarende hører den bruttoformel og masse, der står under den stiplede linje, til den del af molekylet, der ligger under den stiplede linje. 

  • Øvelser

    Til dette projekt hører på nuværende tidspunkt tre øvelser. Formålet med de tre øvelser er, at du med egne øjne skal se effekten af tre af de enzymer, man anvender i forbindelse med brødproduktion. De tre enzymer er:

    • En α-amylase, der nedbryder stivelse.
    • En endo-β-(1,4)-xylanase, der nedbryder uopløseligt arabinoxylan.
    • En endopeptidase, der nedbryder gluten.

    I alle øvelser skal enzymerne tilsættes en dej. Dejen skal hvile og i to af øvelserne også hæve. Det betyder, at selvom øvelserne er forholdsvis simple, tager de noget tid.

    Faglig forberedelse:
    Før du udfører øvelserne er det vigtigt, at du ved, hvad enzymer er. Du skal vide, hvad de tre enzymer, som indgår i øvelserne, gør ved dejen og evt. brødet. Af denne grund er det også nødvendigt at vide hvilke molekyler, der findes i mel. Alt dette kan du lære ved at læse det teoretiske materiale, der hører til projektet.

    Anden forberedelse:
    I øvelserne skal du ælte en dej mm. Det er ikke alle, der ved, hvordan en dej skal æltes. Derfor har vi lavet et podcast, der viser hvordan. Det og andre podcasts, der illustrerer øvelserne, kommer på nettet og kan downloades til efteråret 2008.

    Praktiske informationer:
    Såfremt det af tidsmæssige eller andre årsager ikke er muligt at gennemføre alle øvelserne, kan de enkelte øvelser sagtens stå alene.

    Øvelsesvejledninger til de enkelte øvelser finder du her:

     

    Herunder kan du se vejledningsvideoer til øvelserne

     

    Gluten og effekten af protease

     

    Gluten og effekten af protease from Biotech Academy on Vimeo.

     

    Effekten af xylanase

    Effekten af xylanase from Biotech Academy on Vimeo.

    Hvis du har nogle spørgsmål eller kommentarer til øvelserne, er du meget velkommen til at kontakte os. Så vil vi forsøge at hjælpe bedst muligt og hurtigst muligt.

  • Artikler

    Nedenfor ses to tidsskrifter, hvori der er blevet bragt artikler med relevans i forhold til dette projekt.

    Download og læs relevante og interessante artikler fra:

    Nyt Danisco-enzym får brød til at holde længere
    Ingen har lyst at spise en hotdog, hvor brødet går i stykker. Danisco har lanceret et enzym, der gør brødet blødere og mere fleksibelt.

     

    Nye dufte i forsøgsbageriet 
    Hver år kommer der op til flere nye brød på hylderne i supermarkedet. Denne artikel handler om hvordan Danmarks største brødvirksomhed Lantmännen Schulstad udvikler nye brød.

     

    Kartoffel- og roepulp bliver til sunde fibre 
    Ud over at forlænge mæthedsfølelsen og fremme væksten af gavnlige bakterier i tarmfloraen tyder det på, at kostfibre har en positiv virkning på immunforsvaret. Professor Anne Meyer fra DTU arbejder på at nedbryde restprodukter fra industriel produktion af sukker og kartoffelstivelse til kostfibre vha. enzymer.

     

    Dansk hvede med indbygget nedbrydningsenzym 
    Bakterier fundet i varme kilder på Island har gener, der koder for en xylanase, som er aktiv ved høje temperaturer. Disse gener er blevet indsat i hvedestrå. Idéen er, at enzymerne ved opvarmning nedbryder hvedestrået indefra

     

    Dansk enzym bremser farligt stof i brød 
    Det kræftfremkaldende stof akrylamid dannes, når stivelsesholdige fødevarer opvarmes, f.eks. når brød bages. Tilsætning af et enzym fra Novozymes kan reducere dannelsen af akrylamid.

    Kunstige enzymer 
    Ønsker man at gøre kemiske processer mere miljøvenlige, kan man med stor fordel bruge enzymer. Enzymerne er mere specifikke end de kemiske katalysatorer, og de producerer langt færre biprodukter.

  • Ordliste

    Herunder er en alfabetisk ordliste med forklaring til mange af de ord, der optræder i artiklerne, og som måske ikke er kendt på forhånd.

    Aktive center: Det sted på enzymet, hvor katalytiske grupper, der kan bryde eller danne bindinger, befinder sig, og hvor substratet bindes.

    Aktiveringsenergi Ea: Energiinput, der kræves for at få en bestemt reaktion til at forløbe.

    Amylase: Enzym, der hydrolyserer glykosidbindinger i polysakkarider som f.eks. stivelse (amylose og amylopektin).

    Arabinoxylan: Et ikke-stivelses polysakkarid, der bl.a. findes i hvedemel. Først og fremmest opbygget af monosakkariderne xylose og arabinose. Opdeles i opløseligt arabinoxylan (WEAX) og uopløseligt arabinoxylan (WUAX).

    Assay: Ordet assay er et vidt begreb, der dækker over mange forskellige procedurer, der bl.a. kan bruges til at bestemme mængden eller tilstedeværelsen af en given komponent, f.eks. antistoffer (ELISA) i en blanding. Et assay kan også bruges til bestemmelse af aktiviteten og effekten af et udvalgt stof, f.eks. et enzym.

    ATP: Adenosintrifosfat. Meget energirig kemisk forbindelse. Består af adenin (base), ribose (sukker) og tre fosfatgrupper.

    Co-faktor: Nogle enzymer har brug for en co-faktor, der har betydning for, om enzymet er katalytisk aktivt. Co-faktoren kan være et metal eller et lille organisk molekyle. I det tilfælde, hvor co-faktoren er et organisk molekyle benævnes dette et co-enzym. Et enzym uden sin co-faktor kaldes for at apoenzym og for et holoenzym, når co-faktoren er til stede, og enzymet katalytisk aktivt. Visse co-faktorer sidder permanent fast til enzymet. I så fald kaldes de prostetiske grupper.

    Depolymerisering: Depolymerisering er den proces, hvor en polymer bliver nedbrudt.

    Dityrosinbinding: Binding mellem to tyrosin-aminosyrer.

    Endergon reaktion: En reaktion, hvor der kræves energitilførsel for at reaktionen forløber. Sker en stigning i Gibbs fri energi, hvilket betyder at ΔG > 0. Reaktionen er ikke spontan.

    Endoamylase: Amylase, der hydrolyserer α-(1,4)-glykosidbindinger inde i stivelsesmolekylerne.

    Endopeptidase: Protease, der hydrolyserer peptidbindinger inde i proteiner. Endopeptidaserne genkender bestemte aminosyre-sidegrupper og hydrolyserer peptidbindingen ved siden af disse.

    Exergon reaktion: En reaktion, hvor der frigives energi. Sker et fald i Gibbs fri energi, hvilket betyder at ΔG < 0. Reaktionen er spontan.

    Exoamylase: Amylase, der hydrolyserer α-(1,4)-glykosidbindinger fra den ikke-reducerende ende af stivelsemolekylerne.

    Exopeptidase: Protease, der hydrolyserer peptidbindinger mellem terminale aminosyrer og selve proteinet. Det kan enten være fra den ene ende, hvor der er en fri aminogruppe eller det kan være fra den anden, hvor der er en fri carboxylsyregruppe. Hhv. amino-peptidaser og carboxy-peptidaser.

    Fermentering: Fermentering er det samme som gæring. Ved fermentering sker der en omdannelse af sukkere til alkohol (ethanol) og carbondioxid. Processen sker anaerobt, dvs. den foregår, uden at der er oxygen til stede.

    Ferulinsyredimer: Binding mellem to ferulinsyremolekyler. Ferulinsyre er en fenolsyre, der kan være bundet til arabinosemolekylerne i arabinoxylan.

    Fosfatgruppe-overførselspotentiale: Molekyler, der har et højt fosfatgruppe-overførselspotentiale, har en meget stærk binding til en fosfatgruppe. Dette vil sige, at når bindingen brydes – når fosfatgruppen overføres til et andet molekyle – frigives der en stor mængde energi, der kan bruges til f.eks. at drive en energikrævende (endergon) reaktion.

    Gelatinisering: Gelatinisering eller forklistring er det, der sker, når stivelseskorn under vandoptagelse og varmepåvirkning svulmer op.

    Gibbs fri energi: Energiindhold. Ændringen i den fri energi (ΔG) ved en reaktion er givet som den fri energi i produkterne minus den fri energi i reaktanterne. Hvis den fri energi i reaktanterne er højere end den fri energi i produkterne, bliver ændringen i fri energi negativ (ΔG < 0). Hvis den fri energi i reaktanterne er mindre end den fri energi i produkterne, bliver ændringen i fri energi positiv (ΔG > 0).

    Globulært: At et protein er globulært betyder, at det er meget kompakt foldet, og næsten har en kugleform.

    Glykosidbinding: Etherbinding (-R-O-R-) mellem to sukkere, som er dannet ved sammenkædning af to hydroxylgrupper (-OH) under fraspaltning af vand.

    Hydrofil: Vandelskende.

    Hydrofob: Vandskyende.

    Ikke-reducerende ende: Stivelse (både amylose og amylopektin) har en reducerende ende og en ikke-reducerende ende. Det skyldes, at glukosemolekylet i den ene ende kan åbnes, og den fremkomne aldehyd kan oxideres til en carboxylsyre, hvorved et andet stof reduceres. Denne ende kaldes derfor den reducerende ende.

    Induced fit: Når enzymet ændrer form ved binding af substrat. Substratet ændrer ofte også form.

    Intra- og intermolekylære svovlbroer: Intramolekylære svovlbroer er bindinger mellem to svovlatomer, der sidder i det samme protein. Intermolekylære svovlbroer er bindinger mellem to svovlatomer, der sidder i hvert sit protein.

    Katalysator: En katalysator er i stand til at øge hastigheden af en reaktion uden selv at blive forbrugt eller omdannet.

    Krumme: Krummen skal forstås som den indre, bløde del af et brød – den del, der omsluttes af brødskorpen. Ordet krumme er altså her ikke det, der er tilbage, når man har spist et brød!

    Maillard reaktion: Reaktion mellem en aminosyre og et sukkermolekyle. Sker som regel under opvarmning. Ligesom karamellisering, er den et eksempel på ikke-enzymatisk bruning. Slutproduktet giver smag og duft.

    Maltose: Maltose er et disakkarid, der består af to glukosemolekyler.

    Polymer: En polymer er et makromolekyle, der er opbygget af flere identiske underenheder kaldet monomerer. F.eks. er et protein en polymer, der er opbygget af aminosyrer.

    Porøs: Fuld af porer eller huller.

    Protease: Enzym, der hydrolyserer peptidbindinger i proteiner, og derved nedbryder dem. Kaldes også et proteolytisk enzym. Kan deles op i endo- og exopeptidaser.

    Retrogradering: Retrogradering sker, når der gendannes bindinger mellem stivelsesmolekylerne i forklistrede stivelseskorn.

    Ribozymer: RNA-molekyler med katalytiske egenskaber.

    Sterisk: Ordet sterisk henviser til den rumlige struktur.

    Stivelse: Stivelse dækker over to typer kulhydrater – henholdsvis amylose og amylopektin.

    Svovlbro: En svovlbro er en binding mellem to svovlatomer i to forskellige cystein-aminosyrer.

    Transition state: En overgangstilstand. Når reaktanterne har passeret energibarrieren og er blevet aktiveret (har fået tilført aktiveringsenergi). Reaktanterne befinder sig på en mere ustabil form.

    Viskositet: Et udtryk for f.eks. en væskes modstand mod at flyde. Dvs. viskositet er et mål for, hvor flydende noget er. Jo højere viskositet, jo mere tyktflydende og omvendt.

    WEAX: Opløseligt arabinoxylan. Water extractable arabinoxylan.

    WUAX: Uopløseligt arabinoxylan. Water un-extractable arabinoxylan.

    Xylanase: Enzym, der hydrolyserer ß-(1,4)-glykosidbindinger mellem to xylosemolekyler i arabinoxylan.

null

Projektet er udarbejdet af Luise C. Kristiansen. Luise har en bachelor i Human Life Science Engineering og en master i Matematisk Modellering og Computing.

Luise C. Kristiansen

null

Rie Mejdal er uddannet kemiingeniør fra DTU og arbejder som Application Specialist hos Danisco. Hun har været sparringspartner på denne artikel.

Rie Mejdal

null

Susanne Jacobsen var lektor ved Institut for Systembiologi, DTU. Susanne arbejder med enzymer og proteiner i korn og har været sparringspartner på denne artikel.

Susanne Jacobsen

Thomas Blicher har lavet figurerne af de tredimensionelle enzymstrukturer på denne side. Thomas er lektor på Center for Biologisk Sekvensanalyse ved Institut for Systembiologi.

Thomas Blicher

null

Institut for Systembiologi har Danmarks største biovidenskabelige og bioteknologiske forskning på universitetsniveau.
Instituttet har været partner og sponsor på projektet.

Institut for Systembiologi