Enzyminhibering

Enzymers aktivitet er ikke konstant og kan påvirkes af andre kemiske stoffer. Når et fremmed molekyle nedsætter et enzyms aktivitet, kaldes det en enzyminhibitor. Det kan betyde, at reaktionen forløber langsommere, eller at der kræves en højere koncentration af substrat for at opnå samme effekt.

Enzyminhibitorer findes naturligt i kroppen og bruges til at regulere biokemiske reaktioner. Mange lægemidler fungerer også som enzyminhibitorer, f.eks. ritonavir (Norvir), der hæmmer enzymet HIV-protease og dermed virussets livscyklus.

Der skelnes mellem reversible og irreversible enzyminhibitorer. Irreversible inhibitorer deaktiverer enzymet permanent, mens reversible inhibitorer kun binder midlertidigt. Denne del af forløbet fokuserer på reversible inhibitorer, som inddeles i kompetitive, unkompetitive og nonkompetitive inhibitorer.

Kompetitive inhibitorer

Et molekyle, der fungerer som kompetitiv inhibitor, vil konkurrere med substratet om det samme aktive site på enzymet (se figur 7). Da kun ét molekyle, enten substrat eller inhibitor, kan binde til det aktive site ad gangen, er det enzymets affinitet over for substratet og inhibitoren samt koncentrationerne af disse, der afgør, hvor meget af henholdsvis substrat eller inhibitor, der binder.

En kompetitiv inhibitor vil oftest ligne substratet meget, da det skal kunne binde til samme aktive site. I nogle tilfælde kan inhibitoren også omdannes af enzymet, i andre tilfælde kan det blot binde til enzymet.

Kompetitiv inhibering ændrer ikke enzymreaktionens maksimalhastighed ( $V_{max}$ ), men øger Michaelis–Menten-konstanten (Kₘ). For at forklare dette ved hjælp af Michaelis–Menten-kinetik introduceres et nyt begreb. Kₘ er et mål for enzymets bindingsaffinitet for substratet. Tilsvarende indføres konstanten Kᵢ, som angiver enzymets bindingsaffinitet for inhibitoren:

Figur 7. Til venstre ses den normale enzymreaktion, hvor substratet binder til enzymets aktive site og danner et aktivt enzym-substrat-kompleks. Til højre vises kompetitiv inhibering, hvor en inhibitor ligner substratet og blokerer det aktive site, så substratet ikke kan binde, og enzymet bliver inaktivt.

Ligning 17: $K_i = \frac{[E] \cdot [I]}{[EI]}$

Tilstedeværelsen af en kompetitiv inhibitor medføre, at reaktionens Kₘ-værdi øges. Det betyder, at der kræves en højere substratkoncentration for at opnå samme reaktionshastighed. Denne nye Kₘ-værdi kaldes $K_{M}^{app}$ , hvor app står for apparent (tilsyneladende/effektiv):

Ligning 18: $K_{M}^{app} = K_M \cdot (1 + \frac{[I]}{K_i})$

Kₘ,app beskriver altså den Kₘ-værdi, som reaktionen har, når en kompetitiv inhibitor med bindingsaffiniteten Kᵢ er til stede. Bemærk, at effekten af en kompetitiv inhibitor kan ophæves ved at tilsætte en tilstrækkelig stor mængde substrat.

Nonkompetitive inhibitorer

En nonkompetitiv inhibitor kan binde sig til det frie enzym, og danne et EI-kompleks eller binde sig til ES-komplekset, se figur 8. Inhibitoren binder et andet sted på enzymet end substratet og kan altså binde uafhængigt af dette. Det betyder at der hele tiden vil være en del af enzymerne, som er bundet til en inhibitor og derfor ikke er tilgængelige for reaktionen. Dette betyder med andre ord at den effektive koncentration af enzymet bliver mindre, og dermed at maksimalhastigheden V_max reduceres:

Ligning 19: $V_{max}^{app} = \frac{V_{max}}{1} + \frac{[I]}{K_i}$

Figur 8. Nonkompetitiv inhibering. Inhibitoren (rød) binder til et andet site end det aktive site og deaktiverer enzymet, uanset om substratet er bundet eller ej.

Dette udtryk beskriver altså den maksimalhastighed V_max^app reaktionen har, når en nonkompetitiv inhibitor er til stede. Ved non-kompetitiv inhibering påvirkes K_M ikke. I modsætning til kompetitiv inhibering kan nonkompetitiv inhibering ikke overkommes ved at tilsætte mere substrat. Dette skyldes at andelen af enzymer der binder til inhibitoren ikke påvirkes af koncentrationen af substratet, da inhibitor og substrat binder to forskellige steder på enzymet.

Unkompetitive inhibitorer

Hvis et molekyle fungerer som unkompetitiv inhibitor, binder det kun til enzym-substrat-komplekset. Når inhibitoren binder, dannes der ikke produkt, komplekset stabiliseres, og reaktionen fuldendes ikke (se figur 9). Substratets affinitet øges, da det ikke frigives, hvilket kan beskrives som en kemisk ligevægt.

Dette medfører, at den maksimale reaktionshastighed, V_max, sænkes, fordi en del af ESI-komplekserne ikke kan katalysere reaktionen. Samtidig falder K_M, da noget substrat er bundet i ESI-komplekset. Effekten af inhiberingen kan ikke ophæves ved at tilsætte mere substrat, da inhibitoren og substratet binder forskellige steder på enzymet.

Figur 9. Unkompetitiv inhibering. Substratet binder til det aktive site, ændrer enzymets struktur, så inhibitoren kan binde til det allosteriske site.

Lineweaver-Burk-plot

Ofte kender man en inhibitor uden at vide, hvilken type den er. Det kan man finde ud af ved at lave en grafisk afbildning. De tre inhiberingstyper påvirker enzymreaktionen karakteristisk:

Kompetitiv inhibering: K_M øges, Vmax påvirkes ikke.
Non-kompetitiv inhibering: Vmax sænkes, K_M påvirkes ikke.
Unkompetitiv inhibering: Både Vmax og K_M sænkes, så forholdet Vmax/K_M forbliver konstant.

For at identificere inhiberingstypen grafisk omskrives Michaelis–Menten-ligningen. Ved at tage reciprokværdien på begge sider fremkommer Lineweaver–Burk-ligningen, som bruges til at lave et Lineweaver–Burk-plot. Omskrivningen ser således ud:

Ligning 16 (Michaelis-Menten ligningen): $V_0 = V_{max} \cdot \frac{[S]}{[S] + K_M}$

Ligning 20 (Lineweaver-Burk): $\frac{1}{V_0} = \frac{K_M}{V_{max}} \cdot \frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{max}}$

Lineweaver-Burk-ligningen ses som en lineær funktion af formen y = a ∙ x + b

x = 1/[S], y = 1/V0, a = K_M/V_max,b = 1/V_max.

Fordi sammenhængen mellem 1/V₀ og 1/[S] er lineær, er den forholdsvis let at analysere. I en lineær funktion vil a udgøre den rette linjes hældning og b vil udgøre linjens skæring med y-aksen. Plottes Lineweaver-Burk-ligningen som 1/V₀ som funktion af 1/[S], vil det derfor se ud som vist i figur 10. Ud fra Lineweaver-Burk plottet er det således ret let at aflæse såvel V_max, som K_M-værdien for enzymet:

Skæringen med y-aksen er lig 1/V_max.
Skæringen med x-aksen er lig -1/K_M.

Figur 10. Lineweaver-Burk ligningen er afbildet grafisk. På x-aksen er 1/[S] og på y-aksen er 1/V_0. Der vil være en lineær sammenhæng mellem de to.

I et Lineweaver–Burk-plot kan inhiberingstypen identificeres ved at sammenligne en reaktion med og uden inhibitor (se figur 11):

Kompetitiv inhibering: Samme skæring med y-aksen (V_maxuændret), men ændret hældning og x-akseskæring (K_Møges).
Nonkompetitiv inhibering: Samme skæring med x-aksen (K_Muændret), men ændret hældning og y-akseskæring (V_maxsænkes).
Unkompetitiv inhibering: Ændrede skæringer med både x- og y-aksen, men samme hældning (K_M/V_max konstant).

Figur 11. Lineweaver–Burk-plot. Reaktionen uden inhibitor til stede (Sort), Unkompetitiv inhibering (lyserød), Kompetitiv inhibering (blå) og Non-kompetitiv inhibering (gul).

Alkohol som kompetitiv inhibitor

Ethanol nedbrydes i kroppen ved at binde sig til det aktive site på enzymet alkoholdehydrogenase (ADH) og omdannes til ethanal. Methanol (træsprit) nedbrydes af samme enzym, men omdannes til formaldehyd og videre til format, som er stærkt giftigt. Allerede små mængder methanol kan give permanent blindhed eller være dødelige. De giftige virkninger optræder dog først efter nogle timer, hvilket gør behandling mulig.

Ethanol kan fungere som modgift mod methanolforgiftning, fordi ethanol og methanol konkurrerer om det aktive site på ADH. Da ADH har større affinitet for ethanol, vil ethanol fungere som en kompetitiv inhibitor og hæmme nedbrydningen af methanol. Herved øges K_M for methanol, så nedbrydningen sker langsommere, og koncentrationen af det giftige format holdes under det toksiske niveau.

Ethanol kan også anvendes som kompetitiv inhibitor over for andre farlige stoffer, f.eks. ethylenglycol (antifrostvæske).

Gift eller modgift?

Alkohol er et stof med mange virkninger, afhængigt af koncentration og anvendelse. I små mængder kan det virke stimulerende, mens større mængder kan give alvorlige sundhedsskader og være dødelige. Samtidig kan alkohol i medicinsk sammenhæng fungere som en effektiv modgift mod endnu farligere forgiftninger, f.eks. methanol og ethylenglycol. Alkohol kan således både redde liv og koste liv – afhængigt af situationen.