Cellefabrikker er blevet meget attraktive som biologiske mikroorganismer, der producerer værdifulde stoffer, fx medicin eller enzymer bl.a. til vaskepulver.

Endda meget komplekse biologiske stoffer bliver nu produceret efter naturens metode i disse små levende celler, hvor den almindelige kemiske produktionsindustri typisk må give op.

Dyrket i store tanke kan cellerne i dag danne bl.a. penicillin, antistoffer og hormoner.

Instruktionen til cellefabrikkerne kommer fra deres gener, og genteknologi bruges derfor til at indsætte et fremmed gen, der har koden for det nye produkt.

Et eksempel er hormonet insulin til behandling af diabetes type I. Menneskeligt insulin produceres i dag af celler, som har indsat et insulin-gen.

Udvikling af cellefabrikker i overblik

Udviklingen og produktionen med cellefabrikker kan opdeles i tre helt overordnede opgaver (se figur 1).

1.      Den første opgave er at finde et gen, som har instruktionen (koden) for det protein, der skal produceres, fx insulin.

2.      Genet for proteinet skal indsættes i en velegnet mikroorganisme til produktion, her bagegæren Saccharomyces cerevisiae. Den nu gensplejsede gær vil dermed danne proteinet som om, det var dens eget.

3.      Gærcellen skal derefter dyrkes op i en fermentortank, hvorfra proteinet til sidst kan renses op og testes. Som i virkelighedens bioteknologiske produktion, skal cellefabrikken desuden helst kunne producere så meget som muligt.

Figur 1. De tre overordnede opgaver for at udvikle en cellefabrik og producere et protein består i at 1. finde genet, som koder for proteinet, 2. indsætte genet i en velegnet celle, 3. dyrke disse gensplejsede celler i en fermentortank og oprense produktet derfra.

Læs den fulde teori bag design og udvikling af cellefabrikker.

Hvordan er det muligt biologisk at lave en cellefabrik?

Det er muligt at instruere en fremmed gærcelle i at producere menneskeligt insulin, fordi vores gener alle benytter DNA som sprog.

Alle gener opbevares i cellen som dobbeltstrenget DNA, og et gen styrer cellen ved at kode for et protein, der udfører en bestemt opgave i cellen. Alle gener er derfor ikke aktive hele tiden.

DNA består udelukkende af de fire nukleotider forkortet A, T, C og G i en lang dobbeltstrenget kæde, og det er kun deres indbyrdes rækkefølge (sekvens), der afgør hvilket protein, genet vil kode for.

Når et gen skal aktiveres i en celle, bliver dets DNA afskrevet som en besked bestående af enkeltstrenget mRNA (transkription, se figur 2).

mRNA-afskriften er nu cellens instruktion til at danne det ønskede protein (translation).

Lær mere om hvordan DNA og gener styrer cellen.

Udvikling af cellefabrikker i Det Virtuelle Laboratorium

De tre overordnede opgaver for at designe en cellefabrik følges også i det virtuelle laboratorium.

Opgave 1: Find det kodende gen og design det så det er aktivt i cellen

Den DNA-sekvens, der skal instruere cellefabrikken, skal først og fremmest indeholde selve det kodende gen. Men for at aktivere genet i cellen, skal gen-regulerende DNA-sekvenser også indsættes før og efter genet i rigtig rækkefølge. Ellers ignorerer cellen genet!

Figur 3: I Det Virtuelle Laboratoriums DNA-designprogram kan sekvenserne flyttes rundt ved træk og slip med musen.

DNA’et skal designes og bestilles efter viden om, hvordan DNA forstås af cellen.

For at danne mRNA af DNA’et i cellen, skal genet først aktiveres med en promoter-sekvens. Cellen læser sekvensen  af DNA’et fra venstre side på skærmen mod højre.

DNA efter promoteren bliver kopieret til mRNA i cellen, indtil der optræder en terminator-sekvens. Promotere har forskellig styrke, der i sidste ende påvirker hvor meget produkt, der opnås.

For at cellen nu kan oversætte dette mRNA til det ønskede protein, skal cellens proteinfabrikker, ribosomerne, kunne binde til mRNA’et ved et ribosombindingssted (RBS). Når et ribosom er bundet og læser langs et mRNA, dannes der protein ud fra sekvensen. Proteiners sekvens starter altid ved et start-codon (DNA-koden ATG) og fortsætter indtil et stop-codon (fx DNA-koden TAG).

Oversigt over hvilke eleemnter der er nødvendige for at DNA aflæses til mRNA, der aflæses til et protein (f.eks insulin). ATG / AUG er de baser som startcodon består af, og TAG / UAG er de baser stop codon består af.

Lær mere om hvordan DNA og gener virker i cellen.

Det bestilte DNA vil komme med posten og er nu klar til at blive indsat i en gærcelle.

Opgave 2: Ved arbejdsbordet gensplejses cellerne med DNA’et

De fleste celler optager ikke fremmed DNA, der flyder omkring dem, fordi de er omsluttet af en beskyttende cellemembran. Derfor har forskerne udviklet teknikker til at gøre cellemembranerne gennemtrængelige i en kort periode, hvor det ønskede DNA kan tilsættes og trænge ind. Dette kaldes gensplejsning eller transformation. (lær mere om transformation).

Figur 4. Ved arbejdsbordet gensplejses cellerne med det designede DNA.

Elektroporation er en sådan teknik baseret på, at cellerne udsættes for et kortvarigt elektrisk felt.

Selektion bruges til at finde en gensplejset celle

I transformationen er det kun en lille del af cellerne, der vil optage DNA’et. For at finde dem nemt har man typisk DNA’et siddende i et plasmid (ring af DNA) sammen med et selektionsgen. Selektionsgenet giver  resistens overfor et antibiotikum, som tilsættes den vækstplade, som cellerne fordeles på. Celler, der ikke har optaget plasmidet med resistensgenet, vil derfor blive dræbt af antibiotikummet, mens celler, der har det fået det nye DNA, vil kunne gro frem i kolonier på pladen.

I det eksperimentelle arbejde er det vigtigt at arbejde sterilt for at undgå kontaminering (forurening) med andre slags bakterier eller svampe fra luften. Derfor bruges fx pipettespidser, der er autoklaveret dvs. varmebehandlet ved 121 grader celsius, og spidsen smides ud efter hver pipettering.

Efter dyrkning i varmeskab vil de fremvoksede kolonier af celler på vækstpladen indeholde plasmidet med det designede DNA, og cellernes produktion af det ønskede protein er derfor klar til at blive afprøvet ved at dyrke dem i en fermentortank.

Opgave 3: Cellerne dyrkes og danner produktet der isoleres

Dyrkning af celler giver det bedste resultat ved at starte med at dyrke cellerne op i en lille flydende starterkultur, og derefter tilsætte de mange nye celler til den større fermentortank. Gærceller vil typisk dele sig i to hver halvanden time ved optimale betingelser for fx næring, temperatur, lufttilførsel og pH. Fermentorer er særlige tanke, hvor mikroorganismer kan dyrkes optimalt, fordi disse betingelser kan styres. Der kan samtidig måles koncentrationer af næring (substrat), cellernes samlede vægt (biomasse) og produkt over hele tidsforløbet, og ved at prøve sig frem, kan fermenteringen forbedres (lær mere om fermentering).

Efter fermenteringen skal produktet oprenses fra alle de andre proteiner, cellerester og øvrige stoffer. Afhængigt af om produktet befinder sig inde i cellerne eller er blevet udskilt, gennemgås ofte et skræddersyet oprensningsforløb, hvor  cellemembranerne fx åbnes (lyseres) og celleresterne skilles fra. Typisk køres blandingen også gennem forskellige søjlekolonner, der er designet med et særligt materiale til at holde på produktet, mens urenheder såsom andre proteiner løber igennem. Efterfølgende ændres fx surhedsgraden (pH), hvilket kan påvirke produktets kemiske bindinger til materialet og frigive produktet alene.

I Det Virtuelle Laboratorium vil denne søjlebaserede oprensning være tilstrækkelig.

Virker produktet?

Hvis det lykkedes at producere og oprense produktet, vil det naturligvis være meget interessant, at finde ud af om det er aktivt og fungerer som forventet.

Case: Produktion af vaskeenzym

Har cellefabrikkens produkt evne til at vaske tøjet rent ved miljørigtige temperaturer?

Vaskemiddel tilsættes i dag ofte enzymer, der nedbryder snavs som fx protein, kulhydrater og fedt. Eksempelvis omdanner fedtnedbrydende enzymer de store fedt-molekyler (tri-glycerider) til mindre molekyler (glycerol og frie fedtsyrer), der lettere vaskes væk. Tøjvask ved høje temperaturer (fx 60 grader) kan dog være nødvendigt for at øge hastigheden af de reaktioner, enzymerne foretager.

Fordi det nye enzym er fundet i en organisme, der lever koldt, håbes det, at det vil arbejde hurtigt selv ved lave temperaturer, så vaskemaskinen kan spare energi (se case-historien Udvikling af fedtnedbrydende vaskeenzym).

Laboratoriet har derfor en vaskemaskine, der kan bruges til at teste enzymets evne til at fjerne en grimt plettet T-shirt.

Så nu er spørgsmålet, om cellefabrikken kan udvikles til at producere dette nye vaskeenzym, og ved hvor lav temperatur det stadig er muligt at fjerne pletten?

Case: Hurtigtvirkende insulin

Har cellefabrikkens produkt den ønskede virkning på diabetiske mus?

Diabetes type I er en sygdom, hvor kroppens celler har problemer med at optage sukker pga. mangel på proteinhormonet insulin. Indsprøjtninger med insulin kan derfor som nævnt virke som behandling. I laboratoriet kan der produceres humant insulin eller en udviklet analog (variant) af insulin, der virker hurtigere (se case-historien Udvikling af hurtigtvirkende insulin).

Laboratoriet har to forsøgsmus: En, der lider af diabetes type I, og en rask. Sygdommen betyder, at musens celler ikke optager sukker særlig godt, og blodsukkeret kan derfor nå farligt høje koncentrationer efter et måltid ligesom i mennesker med sygdommen. I raske mus og mennesker udskilles proteinhormonet insulin i blodet som signal til at optage sukkeret efter et måltid, og human insulin virker også i mus.  

Med de to forskellige mus, er det derfor muligt at foretage en afprøvning af effekten af den humane insulin og den nye insulin-analog og få en umiddelbar indikation af stoffets virkning (se nærmere retningslinjer for brug af dyreforsøg).