Øvelser

I dette projekt er der udviklet to forsøg til laboratoriet. Øvelsesvejledningerne kan downloades her:

 

Mælkesyrebakterier og holdbarhed 

 

Undersøgelse af forskellige probiotiske stammer

 

Til lærene findes yderligere en vejledning (materialer, udstyr, forberedelse og kort oversigt over tidsplan for forsøgene)

 

Vedledning til lærere (version, hvor der i øvelsen om undersøgelse af forskellige probiotiske stammer kun inkuberes med ilt)

 

 

 

Praktisk gennemgang af metoderne, der anvendes i forsøgene

 

Generelt om mikrobiologiske teknikker

 

Når man arbejder med bakterier, er det vigtigt at arbejde sterilt, da der ellers kan komme andre bakterier frem, end dem man ønsker at undersøge. Alt udstyr (pipettespidser, podenåle, agarplader mm.) er sterilt, og skal holdes væk fra andre bakterier. Hvis en pipettespids for eksempel har rørt hånden, er det vigtigt, at der tages en ny. Udstyr opbevares i lukkede poser eller beholdere, og man skal kun røre på de steder, der ikke kommer i kontakt med anvendte bakterier og medier.

HUSK at skrive navn og dato på alle anvendte reagensglas, plader mm. På pladerne skrives der langs kanten på bunden, da lågene kan byttes om.

Det er vigtigt ikke at indtage mad og drikkevarer, når der arbejdes med bakterierne. Husk at vaske hænder grundigt med sæbe inden I starter. Sprit bordet af og sørg for kun at have de ting fremme, der skal bruges.

Alle laboratorietimer afsluttes med at vaske hænderne grundigt med sæbe.

 

Udpladning

 

I mikrobiologiens laboratorie er det ofte meget nyttigt at sprede bakterier på specielle plader, som indeholder et medie, bakterierne kan vokse på, og agar, som gør mediet stift. Udpladning kan for eksempel bruges til at tælle antal bakterier i en prøve, til at isolere bakterier, til at undersøge diversiteten af bakterier i en prøve, til at identificere bakterier og meget mere.

 

Rent praktisk udføres udpladningen således:

Der plades ud ved at overføre 0,1 mL fra en fortynding til en plade og sprede væsken hen over pladen med en steriliseret dridalski-spatel. Spatelen skal steriliseres mellem hver udpladning. Det gøres ved at dyppe den i 70 % sprit og føre den hurtigt ind over bunsenbrænderen (det er vigtigt at spatelen tages hurtigt ud af ilden, da den ellers sprænger). Ved denne metode går der ild i spritten, som damper af. Nu er spatelen meget varm, hvilket vil dræbe alle bakterierne, hvis den blev brugt direkte. Derfor sættes spatelen i siden af agarpladen, så der sker en hurtig afkøling.

 

Efter udpladning sættes pladerne til inkubering, så bakterierne kan få lov at vokse.

 

Tørring af plader

 

Før man benytter agarplader, er det vigtigt, at overfladen er tør, da bakterierne ellers vil kunne svømme rundt på pladen, og derved spredes utilsigtet. Inden brug skal alle de anvendte agarplader derfor sættes ind i et varmeskab (30°C eller 37°C) i omkring 20 minutter. Pladerne sættes med bunden opad på skrå hen over låget, så bakterier i luften ikke falder ned på pladen.

 

Figur 1. Tørring af plader.

 

CFU

 

Efter inkubering vil man kunne se en masse små prikker på pladerne. Disse prikker kaldes kolonier, og i teorien er hver prik fremkommet af én enkelt bakterie, som har formeret sig og dannet så mange bakterier, at de danner en synlig prik. Denne bakterie kaldes en ”colony forming unit” (CFU). Antallet af CFU'er skulle derfor gerne stemme overens med, hvor mange bakterier, der har været fra start. Man kan derfor finde ud af, hvor mange bakterier, der er i en mL af det, der undersøges, ved at tælle CFU'er og gange med fortyndingsfaktoren.

 

  

Figur 2. Agarplader med bakteriekolonier (CFU - colony forming units).

 

 

Fortyndinger

 

Når man skal udplade prøver, er det vigtigt at forberede passende fortyndinger, så der ikke kommer for mange bakterier på pladerne, og CFU'er er umulige at tælle. I Cultura er der for eksempel omkring 10⁹-10¹⁰  CFU/mL, så hvis man tager 100 µL (0,1 mL) fra en ufortyndet prøve og plader ud, vil der være 10⁸-10⁹  CFU på pladen. Dette er selvfølgelig umuligt at tælle, både fordi der er så mange, men også fordi der ikke dannes enkeltstående kolonier, og bakterierne ses som én stor masse på pladen.

 

Figur 3. Fortyndingsrækker.

 

Der skal derfor fortyndes i et passende omfang, så der på pladen kommer et antal bakterier, som kan tælles (mellem 30-300 CFU).

 

Renstrygning

 

Renstrygninger udføres for at øge chancen for, at den bakterie man arbejder med er ”ren” (dvs. ikke indeholder andre bakterier). Hvis der tages en koloni direkte fra den oprindelige udpladning, risikeres det, at man også har fået andre bakterier med.

 

Renstrygningen udføres ved at tage en steril podenål, som dyppes forsigtigt i en koloni. Podenålen afsættes derefter som en streg i kanten af en ny agarplade. Herefter tages en ny podenål, som føres en enkelt gang igennem den afsatte streg og derefter spredes ned over agarpladen i zigzag-bevægelse. Denne procedure gentages, hvor blot endnu en ny podenål føres igennem det netop afsatte spor.

 

Figur 4. Renstrygning af bakterier. Husk ny podenål mellem hvert strøg.

 

Det er meget vigtigt, at der for hvert trin tages en ny podenål. Dette skal gøres for at undgå, at der sidder for mange bakterier tilbage på podenålen. En klassisk fejl man gør i forbindelse med renstrygninger er, at man ikke stoler på, at der er bakterier, hvis man ikke kan se dem. Derfor ender man ofte med alt for mange bakterier – og uden de ønskede enkeltkolonier!

 

Api strips

 

I forsøget "Undersøgelse af forskellige probiotiske stammer" benyttes api strips til at identificere mælkesyrebakterierne i Idoform, Bifiform og Cultura.

 

Api strips er designet til at kunne identificere bestemte bakterier helt ned på stammeniveau. De detekterer forskelle i fænotype baseret på, hvilke kulkilder de kan fermentere og vokse på. I en api strip test er der brønde med hver sin kulkilde i. Til hver brønd tilføjes der en suspension, som indeholder bakterien, der undersøges, de stoffer bakterien skal bruge til at leve af (selvfølgelig uden kulkilden) og et farvestof, som viser, om der er en positiv reaktion efter et bestemt antal timer.

Til identificering af Lactobacillus og lignende bakterier benyttes api 50 CH strips, med 50 brønde, som er vist på billedet nedenfor.

 

Figur 5. Friske api 50 CH strips.

 

Efter inkubering vil brøndene skifte farve, hvis bakterien kan vokse på kulkilden i brønden.

 

 

Figur 6. Api 50 CH strips efter inkubering.