Eftersom immunsystemet er skabt til at bekæmpe infektioner og sygdomme, er det naturligt at anvende immunologien til at søge nye behandlingsformer. Disse vil nemlig ligne mekanismer som allerede foregår i kroppen. Men immunologien har også langt bredere anvendelsesmuligheder, idet diagnosticering og påvisning af forskellige stoffer er mulige at udføre ved at bruge antistoffer. Der er udviklet mange forskellige teknikker til anvendelse i laboratoriet, og i det følgende vil nogle af de vigtigste af disse blive gennemgået. De fleste af disse teknikker anvendes dagligt i Symphogen A/S ligesom i andre virksomheder, som forsker i anvendelsen af immunforsvarets komponenter, udvikling af lægemidler eller diagnostiske tests.
Udfældning
Udfældning bygger på princippet om, at tunge molekyler fælder ud af en opløsning, hvis denne har en densitet, der er mindre end molekylets. Udfældning med antigener finder sted for antigener, der indeholder mange epitoper, da der således er mulighed for, at mange antistoffer kan bindes, såfremt de er polyklonale.
Antistofferne vil krydsbinde til flere antigener, og der dannes herved et kæmpe net af antigener og antistoffer. Dette vil på et tidspunkt nå en sådan størrelse, at det vil udfældes (se figur). Anvendes monoklonale antistoffer, vil der ikke ske udfældning som vist på figuren.
Men for at udfældning kan ske og give et godt resultat, er det vigtigt, at hverken koncentrationen af antistof eller antigen er for stor. Er der for meget antistof til stede, er der for mange antistofbindingssteder i forhold til epitoper, og antistofferne vil derfor ofte kun binde et antigen, og krydsbinding mellem antistoffer vil ikke finde sted. Ligeledes, hvis der er for meget antigen til stede, vil krydsbinding ikke finde sted, da der er for få antistoffer til at kæde antigenerne sammen, se figur 1.
 |
| Figur 1: Figuren viser princippet i udfældningsreaktioner, hvor kun en tilpas mængde antigen og antistof vil give en høj udfældning. |
Agglutinering
Agglutinering bygger på princippet om udfældning og anvendes til dagligt inden for mange områder til diagnosticering og som led i andre test.
På vores blodlegemer sidder antigener, som også findes på resten af kroppens celler. Dette er bl.a. A- og B-antigenerne som er kendt i ABO-lodtypesystemet. En person som har blodtype A, har A-antigener siddende på overfladen af de røde blodlegemer. En person der har blodtype B, har B-antigener på overfladen, mens en person af blodtype O ikke har nogen af disse antigener.
A/B-antigenerne findes også på mange bakterier, som vi møder til dagligt, og vi bliver derfor stimulerede til at danne antistoffer mod disse antigener, såfremt vi ikke selv har antistofferne i kroppen. Således vil en person med blodtype A have B-antistoffer og modsat for en person med blodtype B, mens en person med blodtype O vil have såvel A- som B-antistoffer i blodet.
Da overførsel af antistoffer mod ens egne antigener kan medføre, at de røde blodlegemer ødelægges, kræves der særlig påpasselighed ved blodtransfusioner. Det er derfor nødvendigt at kunne teste, hvilken blodtype man hører til. Blodtypebestemmelse sker ved en agglutineringsreaktion, hvor man blander blod på en plade hvorpå der findes antistoffer mod enten A- eller B-antigener. Hvis der er antigener til stede på blodlegemerne i prøven, vil disse udfælde sammen med antistoffet på pladen, og man kan derved bestemme blodtypen.
Immundiffusion
Immundiffusion benytter princippet om udfældning af store antigen-antistof-komplekser. I denne metode anvendes dog ikke flydende medier, men antistoffer inkorporeret i eksempelvis agar i en petriskål. I midten af skålen laves et hul, hvor agaren udtages, og i dette hul kan en farvet opløsning af antigen tilsættes. Dette vil nu diffundere ud i gelen og bindes til antistofferne.
Der hvor antigenerne er diffunderet ud, og koncentrationen er i antigen-antistof-ækvivalenszonen vil store antigen-antistof-komplekser formes, og dette vil kunne ses som en farvet ring omkring det hul, hvor antistof er tilsat. Denne ring er på figur 2 kaldt P.
 |
| Figur 2: Figuren viser et immundiffusion-forsøg hvor antigen er tilsat en brønd i midten. Antigenet vil diffundere ud i gelen, som indeholder antistof og størrelsen af zonen giver et indtryk af, hvor meget antigen der var tilstede i prøven. |
Der er yderligere lavet en udvikling af denne metode kaldt dobbelt immundiffusion, hvor både antistof og antigener tilsættes to brønde ved siden af hinanden og diffundere mod hinanden. Der hvor diffusionen resulterer i ækvivalens af både antigen og antistof vil der formes en linje mellem de to brønde, som kan visualiseres med farvestof.
I begge tilfælde kræves det, at man har en standardprøve således at man kan relatere diameteren for cirklen i immundiffusion og linjen i dobbelt immundiffusion til en bestemt koncentration af antistof. Standardprøven laves ved at lade kendte koncentrationer af antigen (eller antistof der kan bindes til de anvendte antistoffer) diffundere i gelen og tegne en graf over de målte diametre.
 |
| Figur 3: Figuren viser princippet i dobbelt immundiffusion hvor antigen og antistof diffunderer mod hinanden i en gel. |
ELISA
ELISA er en forkortelse for Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay, og er en af de mest anvendte tests inden for immunologien. Denne test kan anvendes både til at teste for tilstedeværelsen af antigener eller antistoffer, hvorfor der findes flere forskellige former af ELISA. Ved at kunne teste for tilstedeværelsen af antistoffer, er det langt nemmere at teste for visse infektioner, da man bare skal have en lille blodprøve for at kunne identificere eventuelle antistoffer mod en inficerende bakterie eller virus i patienten.
En form er indirekte ELISA, hvor antigener, specifikke for et antistof man ønsker at teste for, påsættes bunden af en brønd, og overskydende antistof vaskes væk. Herefter tilsættes den prøve, man ønsker at teste på, og såfremt den indeholder de formodede antistoffer, vil disse binde til antigenerne. Herefter vaskes overskydende antistof væk, og der tilsættes nu et andet antistof, der kan binde sig til det antistof, man tester for. Dette antistof er bundet til et enzym, og når man tilsætter et substrat som kan omdannes af dette enzym, skifter opløsningen farve.
Denne test kan også vendes om (sandwich ELISA). I denne metode anbringer man på bunden af en brønd antistoffer, der er specifikke for de antigener, man ønsker at teste for. Efter at overskydende antigener og antistoffer er vasket bort, tilsættes prøven det andet antistof, der er bundet sammen med et enzym. En farvereaktion fremkommer ved tilsætning af substrat der kan omdannes af enzymet til et farvet produkt.
 |
| Figur 4: Illustrationen viser ELISA metoden hvor en prøve kan undersøges for tilstedeværelsen af antigen eller antistof. |
Western Blotting
Et Western blot er en teknik, der gør det muligt at teste tilstedeværelsen af et specifikt protein i en opløsning med mange forskellige proteiner. Den bruges ofte til at teste for antistoffer ved diagnosticering af patienter. Behandler man et protein med et denaturerende stof vil proteinet få en forholdsvis lineær form. Denne effekt udnyttes i Western blot, hvor et denaturerende stof tilsættes den opløsning, der skal testes.
 |
| Figur 5: Når et protein denatureres foldes det op og bliver forholdsvist lineært. |
Herefter påsættes de denaturerede proteiner en gele indeholdende det denaturerende stof, og der tilsluttes en spændingskilde. Da proteinet har en ladning, vil det bevæge dig i gelen på en sådan måde, at små proteiner vil bevæge sig hurtigst. Denne metode kaldes gel-elektroforese. Efter at have bevæget sig ned ad gelen overføres proteinerne ved hjælp af en elektrisk strøm til en nylon membran. Den negative pol placeres på gel siden og den positive pol placeres på nylon membran siden. Herved vil de negativt ladede proteiner bevæge sig over på nylon membranen, og befinde sig i samme mønster som på gelen.
Nylon membranen dyppes i en opløsning, der indeholder antistoffer mod et ønsket antigen. Til sidst tilsættes et sekundært antistof, der binder til det første antistof. Dette sekundære antistof er bundet til et enzym, der udvikler en farve, når dets substrat også tilsættes. Herved kan tilstedeværelsen at et bestemt antigen eller protein visualiseres.
 |
| Figur 6: Figuren viser, hvordan man i Western blotting kan vise tilstedeværelsen af forskellige proteiner i en prøve. |
Denne metode anvendes bl.a. til at teste personer for HIV. Proteiner fra HIV-inficerede celler separeres i gel-elektroforesen og overføres til nylonmembranen. Her tilsættes serum fra en blodprøve taget fra en person, der skal testes for HIV. Såfremt personen har HIV, vil der findes anti-HIV antistoffer i prøven, og disse vil bindes til proteinerne på nylonmembranen. Tilstedeværelsen af anti-HIV antistoffer påvises ved at tilsætte sekundære antistoffer, koblet sammen med et enzym, mod humane antistoffer, og ved tilsætning af substrat vil der ske en farvereaktion, såfremt der var anti-HIV antistoffer i prøven. Metoden der anvendes, er i princippet den samme som i to andre tests, Southern blot og Northern blot, hvor der henholdsvis testes for DNA og RNA.
Flow cytometri
Flow cytometri gør det muligt at teste for flere forskellige cellers tilstedeværelse i en prøve. Denne metode anvendes ofte til at teste for kræft i blodets celler, da dette vil udvikle særlige proteiner på cellernes overflade. Den kan endda give et overblik over fordelingen af forskellige celler i en prøve eftersom flow cytometeret er i forbindelse med en computer, hvortil data sendes. Samtidigt kan der også opnås information om størrelsen af cellerne i en prøve.
 |
| Figur 7: Figuren viser, hvordan celler kan analyseres i et flowcytometer. Her kan cellerne opdeles såfremt der er flere celler i en prøve. |
For at teste en prøve i et flow cytometer er det nødvendigt først at behandle prøven med antistoffer mod de antigener, der identificerer specifikke celler. Disse antistoffer er specielle, idet de er fluorescerende med forskellige farver (og altså bølgelængder). Man kan således skelne mellem dem såfremt der anvendes flere på en gang. Prøven, der oftest vil være en blodprøve, suges ind i flow cytometeret. Det sker langsomt, så kun en enkelt celle ad gangen kommer ind i cytometeret. Nu sendes en laserstråle mod cellen, hvilket exciterer det fluorescerende antistof. Dette resulterer i udsendelsen af fotoner, der har forskellige egenskaber afhængigt af hvilke stoffer der er brugt til at lave de fluorescerende antistoffer.
Resultatet af dette er, at der udsendes lys med forskellige bølgelængder, afhængigt af hvilken celle der måles på, samt at der sker en spredning af lyset, der afhænger af cellens størrelse og indhold. Alt dette sendes til en computer og vises her.
Efter cellerne har passeret gennem flow cytometeret kan de sorteres og opsamles hver for sig, således at man kan lave videre undersøgelser på nogle af cellerne.
Denne metode anvendes bl.a. af Symphogen A/S, når de skal have isoleret forskellige celler fra en blodprøve til at producere ønskede rekombinante polyklonale antistoffer.
Læs mere