Kemisk DNA-syntese bruges til at fremstille DNA-strenge med en ønsket sekvens (rækkefølge af nukleotiderne A, T, C og G).
Niveau: Mellem-højt, også interessant i kemi
Peter Rugbjerg
Prisen er på det seneste faldet drastisk på DNA-sekvenser, der fremstilles kemisk. I dag kan man via internettet bestille præcis sin 'favorit DNA-sekvens', som ikke findes naturligt nogen steder, og få den sendt til laboratoriet.
Et eksempel kunne være et naturligt optrædende gen sat sammen med genet for grønt fluorescerende protein (GFP). GFP får det naturlige gens protein til at blive selvlysende, hvilket kan afsløre proteinets placering i cellen.
Den store fordel ved kemisk DNA-syntese er, at de langsommere molekylærbiologiske kloningsteknikker kan springes over, så det nye DNA hurtigere kan bruges til gensplejsning.
Kemisk DNA-syntese bruges også til at designe primere, der er ca. 20 nukleotider lange sekvenser anvendt i PCR, som bruges til opkopiering af DNA i meget molekylærbiologisk arbejde.
Reaktionscyklussen (phosphoramidit-metoden)
I kemisk DNA-syntese tilføjes DNA-nukleotiderne én ad gangen til den voksende DNA-streng i en cyklus bestående af fire kemiske reaktioner. Modsat den naturlige, enzym-drevne DNA-syntese forløber kemisk DNA-syntese fra 3'- til 5'-enden af strengen. Og i stedet for de fire naturlige nukleotider starter man med phosphoramiditter, der er kemisk forandrede nukleotider, som bl.a. reagerer hurtigere (figur 1).
Figur 1. Phospohoramiditterne ligner DNA-nukleotiderne og indeholder samme base, men derudover bl.a. også en beskyttende dimethoxytrityl-gruppe (DMT). Her er vist den kemiske struktur for en phosphoramidit. De fire baser i DNA er A, T, C og G.
Phosphoramiditternes 5'-ender er beskyttet mod at reagere med andre phosphoramiditters 3'-ender af en påhæftet dimethoxytrityl-gruppe (DMT).
Syntesen begynder, når den første phosphoramidit dannes og bindes til en kemisk støtte, hvorfra DNA-strengen skal syntetiseres.
Cyklusserne kan nu begynde og afhænger altså direkte af længden og sekvensen af den ønskede DNA-streng.
De fire trin i cyklussen
En cyklus, der forlænger DNA-strengen én gang, kan opdeles i disse fire trin (se også figur 2):
-
DMT fjernes. Den beskyttende DMT-gruppe på den foregående nukleotid fjernes ved reaktion med en syre, så 5'-enden bliver reaktiv.
-
Ny phosphoramidit tilsættes. Den næste phosphoramidit i sekvensen (A, T, C eller G) aktiveres og tilsættes blandingen. Den danner nu en phosphit-triester-binding til 5'-hydroxygruppen, hvorved DNA-strengen forlænges.
-
Capping. En lille andel binder ikke nogen ny phosphoramidit, og disse 'cappes', hvilket vil sige, lukkes for fremtidige reaktioner i kommende cyklusser, så der ikke opstår sekvenser undervejs med manglende nukleotider. Cappingen foregår ved påsætning af en acetyl-gruppe (-COCH3).
-
Oxidation. Mellem det nye og foregående nukleotid oxideres phosphit-gruppen til den naturlige phosphat-gruppe i tilstedeværelse af iod og en svag base, og cyklussen er nu tilendebragt.
Figur 2. Oversigt over en kemisk DNA-synteses fire trin i en cyklus nummer n. I hver cyklus tilføjes et nyt nukleotid til DNA-strengen. Her er det nye nukleotid markeret med gul.
Når alle de brugervalgte nukleotider er sat på, skal strengen løsnes fra støtten, og det sidste nukleotids DMT-gruppe fjernes. Da phosphoramiditterne bærer en methyl-gruppe (-CH3), skal disse også fjernes fra alle samlingerne af nukleotiderne.
Når de syntetiserede DNA-strenge bliver lange, øges risikoen for fejl, og man vil derfor sjældent syntetisere længere sekvenser end ca. 200 nukleotider. Hvis en længere DNA-sekvens skal bruges, kan kortere sekvenser i stedet klones sammen efterfølgende.