Case: Udvikling af hurtigtvirkende insulin

Udviklet i samarbejde med Novo Nordisk

Medicinalvirksomheden Novo Nordisk har gennem mange år anvendt genteknologi til udvikling og fremstilling af lægemidler, der anvendes til behandlingen af bl.a. diabetes.

Denne case indledes med en gennemgang af diabetes, og hvordan sygdommen behandles med insulin, der er produceret i gensplejsede gærceller. Herefter beskrives det, hvordan forskerne ved hjælp af genteknologi og kreativ tænkning, har udviklet en ny type insulin, samt hvilke udfordringer, de mødte undervejs.

Insulin til behandling af diabetes

Diabetes er en udbredt folkesygdom, hvor kroppens egen produktion af insulin er nedsat eller helt ophørt. Insulin binder sig til kroppens celler, hvilket gør det muligt, at de kan optage glukose, som er cellernes primære energikilde. Mangel på insulin betyder, at den glukose, der cirkulerer rundt i blodet, ikke kan optages af cellerne, og derfor stiger glukosekoncentrationen. En langvarig forhøjet blodsukkerkoncentration kan forårsage sen-komplikationer, der vil blive beskrevet nedenfor i afsnittet om følgerne af diabetes. På verdensplan lider 5 % af alle voksne af diabetes. Antallet af mennesker med diabetes er globalt set voldsomt stigende. Læs meget mere om diabetes her.

Heldigvis har man gennem lang tid kunnet behandle diabetes med indsprøjtninger af insulin. Behandling med humant insulin gør sygdommen meget mindre generende og farlig, fordi patienterne løbende kan sikre brændstof til kroppens celler og sænke koncentrationen af glukose i blodet til det rigtige niveau, hvilket nedsætter risikoen for at udvikle sen-komplikationerne. Behandlingen med insulin kan dog ikke præcist efterligne den naturlige,  løbende insulin-frigivelse hos en rask person, bl.a. fordi virkningen først indtræder lidt tid efter indsprøjtningen. Ved hjælp af genteknologi har Novo Nordisks forskere derfor udviklet både hurtig og langsomt virkende insulin (insulin-varianter), der kan kombineres og give et næsten normalt blodsukkerniveau gennem dagen, og derved reducere symptomer og forebygge sen-komplikationer af diabetes.

Følgerne af diabetes (sen-komplikationer)

Diabetespatienter, der lever med et bare lidt forhøjet blodsukker i mange år, risikerer bl.a. at blive ramt af blindhed, dårlig sårheling og blodpropper. Samtidig kan et for lavt blodsukker som følge af for høje doser insulin fører til besvimelse og i værste fald dødsfald. Diabetes en derfor en sygdom, som kræver omhyggelig behandling.

Både diabetes type 1 og type 2 kan behandles med indsprøjtning af insulin. Ved type 1 dannes stort set intet insulin i kroppen, mens kroppens celler ved type 2 ikke længere reagerer tilstrækkeligt på insulin. Livsstilsændringer såsom kostomlægning og øget motion kan hjælpe behandlingen af type 2 diabetes.  

Insulin på molekylært niveau

Insulin er et protein, der virker som hormon i kroppen. Det frigives til blodet, når blodsukkerkoncentrationen er høj, hvilket især er tilfældet efter måltider, fordi maden bliver nedbrudt til bl.a. glukose.

Hvert insulin-protein består af to aminosyre-kæder, der holdes sammen af disulfidbroer. Insulin dannes i bugspytkirtlen ved samme mekanisme som alle andre proteiner: transskription af insulin-genet fra DNA til mRNA og efterfølgende ved translation af mRNA’et til proteinet.

Cellefabrikker producerer humant insulin i store mængder

Insulin er et af de første proteiner, der blev fremstillet af en cellefabrik ved at indsætte insulin-genet. Dette gennembrud gjorde, at både gær (S. cerevisiae) og bakterien E. coli siden 1980’erne har været brugt som cellefabrikker til produktion af humant insulin til behandling af diabetes. Fordi det humane insulin-gen er blevet indsat i cellefabrikken, er insulinen identisk med den insulin, der dannes i menneskets bugspytkirtel. Indtil midtfirserne blev insulin til medicinsk brug udvundet fra bugspytkirtler fra køer og svin, men dyrenes insulin er ikke er helt identisk med menneskelig insulin: enkelte aminosyrer er skiftet ud.

Udover at mindske risikoen for allergiske reaktioner ved at bruge humant insulin frem for insulin fra dyr, undgår patienterne nu også den teoretiske risiko for overførsel af sygdomme fra dyrene. Hvis verdens nuværende behov for insulin-lægemidler skulle dækkes via bugspytkirtler fra svin, skulle man bruge 500 mio. svin. Så produktionen i cellefabrikker løser også en stor praktisk udfordring.

I store fermenteringsanlæg i bl.a. Kalundborg dyrkes gærceller for at producere insulin-lægemidler til store dele af verden, da Novo Nordisk i dag er en af de førende udbydere af behandling til diabetes.

Forskernes udfordring: Hurtigtvirkende insulin

Når en diabetiker skal spise, er det vigtigt at holde blodsukkeret tilpas lavt efter måltidet, f.eks. ved indsprøjtning af insulin. Men humant insulin, der indsprøjtes i underhuden, absorberes langsomt til blodet, og derfor skal et måltid planlægges i god tid for at undgå farlige situationer. Denne udfordring i patienternes hverdag ønskede et udviklingsteam i Novo Nordisk at afhjælpe ved at designe en ny, hurtigtvirkende insulin-variant.

Forbedring af insulins virkningshastighed

Insulin skal indsprøjtes i underhuden og bliver langsomt absorberet i blodet, fordi de enkelte insulin-molekyler binder til hinanden to og to i såkaldt dimere (figur 1). Ved de høje koncentrationer, som findes i indsprøjtningsvæsken, samler tre dimere sig endda gerne omkring et zink-atom til en hexamer. Disse hexamere er for store til at passere igennem blodåremembranen, så først når hexamererne langsomt med tiden skilles i enkelte molekyler igen, kan de optages i blodet og komme til at regulere blodsukkeret.

Figur 1 Insulin (rød og grøn) samler sig to og to i dimere. Tre dimere samler sig til en hexamer, som er for store til at blive optaget til blodåremembranen efter en indsprøjtning under huden.

Undersøgelser af den kemiske tiltrækning mellem de enkelte insulin-molekyler viste, at der er nogle særligt tiltrækkende aminosyrer i insulins to kæder (B9, B12, B13, B16 og B23-28, se figur 2)

.

Udviklerne satsede derfor på, at absorptionen ville blive speedet op, hvis nogle af de kemisk tiltrækkende aminosyrer blev udskiftet med aminosyrer, der kunne frastøde hinanden. Omvendt, skulle selve insulinets virkning naturligvis ikke ødelægges af det; der er ingen gavn af et hurtigt absorberet protein, som ikke længere har nogen effekt på kroppen. Da insulin som nævnt virker ved at binde til cellernes overflade-membran, kiggede udviklerne på insulins kontakt med disse såkaldte celle-receptorer i cellemembraner, fordi netop denne kontakt skulle bevares. Det var tidligere opdaget, at insulin faktisk binder til receptoren ved aminosyrerne B12, B16 og B23-25, så disse skulle naturligvis helst ikke ændres.

Den første hurtigtvirkende insulin-kandidat, som udviklingsteamet producerede tilbage i begyndelsen af 1990’erne, havde udskiftet aminosyren B10 for at forhindre dannelse af insulin-hexameren, og det lod til

at være en meget effektiv ændring.

Man producerede derfor forventningsfuldt X10 til kemiske forsøg på cellekulturer, hvilket gav positive resultater. Men som det ofte sker med potentielle lægemidler i udvikling, måtte projektet afbrydes, da forsøg med rotter viste dårlige resultater. Forsøget viste en forhøjet risiko for mælkekirtelkræft hos de rotter, som fik X10 ift. rotter som til sammenligning kun fik indsprøjtet saltvand.

Vejen fra idé til færdigt, godkendt lægemiddel er lang og meget dyr. I den allersidste udviklingsfase af alle nye lægemidler skal stofferne testes i mennesker igennem en række kliniske forsøg, der bl.a. skal skaffe viden om lægemidlets funktion og sikkerhed. I denne flerårige periode opdages og stoppes lægemidler, hvis de viser sig at have uønskede bivirkninger.

Det er en meget vigtig del af lægemiddeludviklingen, at alle potentielle lægemidler testes grundigt kemisk og på cellekulturer og dernæst i dyr, for at vurdere om de er sikre nok til at teste på frivillige forsøgspersoner. Forsøgene på mennesker skal sikre, at bivirkninger ikke er større end den ønskelige virkning, og at der ikke kommer farlige produkter på markedet.

Heldigvis havde udviklingsteamet flere andre ideer til, hvordan man kunne forhindre insulin-dimeren i at danne sig, så insulinen kunne optages hurtigere.

En af dem var at udskifte aminosyren B28, som normalt er en upolær prolin aminosyre (figur 3). Ideen gik ud på at øge de frastødende kræfter i området, så insulin-dimeren ikke samler sig så nemt. Valget faldt derfor på at indsætte den polære aminosyre asparaginsyre på B28-pladsen.

Figur 3. De to aminosyre-kæder i insulin aspart, hvor insulins naturlige aminosyre ved B28 prolin (Pro) udskiftes med asparaginsyre (Asp).

 
Ideen skulle nu udføres i praksis, og gærceller blev derfor gensplejset med en ekspressionsvektor, der indeholdt genet for den nye variant kaldet insulin aspart. Den eneste forskel i genet var altså codonet for B28, der nu kodede for asparaginsyre.

Da gærcellernes ny-producerede insulin aspart var oprenset, kunne forskerne spændt undersøge resultatet.

Test af insulin aspart

Insulin aspart skulle naturligvis også igennem en lang undersøgelsesprocedure for at sikre kendskab til virkningen og sikkerheden ved det. Til stor glæde for udviklerne, viste stoffet efter mange forsøg sig sikkert at bruge, og absorptionen af insulin aspart i blodet var dobbelt så hurtig som for humant insulin. Insulin aspart kunne stadig binde sig til receptoren på cellerne, og det havde altså ikke tabt sin virkning i forbindelse med den opnåede nye virkningshastighed.

Insulin asparts hurtige absorption efter indsprøjtning, minder mere om raske menneskers udskillelse af insulin til blodet i forbindelse med måltider Derfor var insulin aspart en interessant forbedring af diabetes-behandlingen for mange patienter.

I 1999 fik insulin aspart godkendelse til salg i EU med navnet NovoRapid og året efter i USA med navnet NovoLog.

Den hurtigtvirkende insulin, NovoRapid er et eksempel på, hvordan genteknologi ikke kun kan bruges til at producere lægemidler identiske med naturens, men også mere avancerede varianter, hvor dele af genet er ændret. Som nævnt er genteknologi også udnyttet til at udvikle langsomt virkende insulin, som hjælper med at fastholde insulin-niveauet over længere tid.

I dag arbejder Novo Nordisks forskere videre med at forbedre behandlingen af diabetes ved hjælp af genteknologi. En af de store satsninger er stamceller (se Biotech Academy-materiale), der måske vil kunne kurere diabetes, men som al medicinsk forskning rummer udviklingen mange udfordringer. De forbedrede insulin-varianter såsom insulin aspart forventes derfor også at være en stor hjælp i diabetes-behandlingen mange år frem endnu.