Indledning:

I slutningen af 50’erne og i starten af 60’erne fandt forskeren Christian Anfinsen ud af, at den information, der skal til for at et protein folder rigtigt, ligger gemt i proteinets primærstruktur. Grunden til dette er, at der kun er netop én struktur der er stabil i et bestemt miljø. F.eks. vil enzymet have en struktur ved en pH og en anden struktur ved en anden pH. Proteinets struktur er bestemt af peptidbindingernes bevægelighed samt interaktionerne mellem aminosyrernes sidegrupper. For at bevise dette tog Anfinsen et enzym, der nedbryder RNA ribonuklease, og behandlede det med kemikalier, der denaturerede enzymet. Derved ophørte enzymaktiviteten totalt. Da Anfinsen fjernede kemikalierne, således at miljøet igen var som inden i en celle, kom der atter aktivitet. Dette beviste, at når man tager et denatureret protein og gendanner det kemiske miljø til naturlige cellulære betingelser, så vil det spontant folde tilbage til sin aktive form. Denne mekanisme, der passende kaldes for renaturering, fik Anfinsen Nobelprisen i 1972. Det skal dog nævnes, at ikke alle proteiner kan renaturere. Når man f.eks. koger æggehvide, så bliver den ikke flydende igen, når ægget bliver koldt. Her er der tale om irreversibel denaturering.

Den fundamentale opdagelse af, at et denatureret enzym kan folde tilbage i den rigtige struktur uden nogen hjælp, indikerer, at al den information, der skal til for at et protein folder rigtigt, ligger i DNA-sekvensen. Derfor må det være muligt at regne sig frem til, strukturen for et givent protein, udelukkende på baggrund af DNA-sekvensen. Dette er en svær disciplin, idet dette kræver ekstremt mange udregninger. Det bliver ekstra kompliceret med meget store proteiner, såsom f.eks. enzymer, med mange hundrede aminosyrer. Derfor har man på Center for Biologisk Sekvensanalyse ved Institut for Systembiologi udviklet et computerprogram, der skyder en genvej til en mulig proteinstruktur alene ud fra DNA-sekvensen for et givent gen. Programmet hedder CPHmodels (Copenhagen Models) og er et værktøj, der ud fra kendte proteinstrukturer kan forudsige, hvad strukturen af en given aminosyresekvens må være. Dette vil I komme til at bruge til at finde frem til, hvilken gruppe det AMP, der er gemt i jeres udleverede sekvens, tilhører.

For at kunne forstå hvordan 3-D strukturen af et protein er afgørende i biologisk sammenhæng, kommer der i nedenstående en kort opsummering omkring proteinstruktur. Mange af de fakta, der bliver givet i teksten, skal I senere bruge til jeres rapport.  

Proteiner

Proteiner er polymerer af aminosyrer bundet sammen via peptidbindinger. Peptidbindingen skabes ved en kondensationsreaktion mellem carboxylsyregruppen på den første (N-terminale) aminosyre og aminogruppen på den efterfølgende (C-terminale) aminosyre (Figur 1).

Figur 1: Viser kondensationsreaktionen hvorved et dipeptid dannes. Den N-terminale og C-terminale ende af peptidet er angivet.

Peptidbindingen er ikke fleksibel idet carbonylgruppen bidrager til en delvis dobbeltbinding mellem carbonatomet og nitrogenatomet i den efterfølgende aminosyre (Figur 2). Dette gør igen at oxygenatomet fra carbonylgruppen bliver negativt ladet mens nitrogenatomet bliver positivt ladet. Denne polarisering giver proteinerne deres evne til at lave hydrogenbindinger samt er med til at give polypeptidets rygrad (N-C-C)n den zig-zaggede struktur.

Figur 1: Viser kondensationsreaktionen, hvorved et dipeptid dannes. Den N-terminale og C-terminale ende af peptidet er angivet.

Peptidbindingen er ikke fleksibel, idet carbonylgruppen bidrager til en delvis dobbeltbinding mellem carbonatomet og nitrogenatomet i den efterfølgende aminosyre (Figur 2). Dette betyder, at oxygenatomet fra carbonylgruppen bliver negativt ladet, mens nitrogenatomet bliver positivt ladet. Denne polarisering giver proteinerne deres evne til at lave hydrogenbindinger, samt er med til at give polypeptidets rygrad (N-C-C)n den zig-zaggede struktur.  

Figur 3: Figuren viser, hvordan et polypeptid kun kan drejes omkring det carbonatom hvorpå sidegruppen sidder, i den zigzaggede struktur. Dette skyldes den plane peptidbinding.

Primærstuktur

Når forskere skriver sekvenser af aminosyrer, altså primæstukturen, så bruger de næsten udelukkende en kode hvor hver aminosyre er lig et bogstav i alfabetet. Skulle man skrive et polypeptid ved hjælp af de fulde navne på aminosyrerne, så ville sekvensen blive utrolig lang. Nedenfor er en tabel med forkortelserne. Denne skal i bruge i opgaven og senere i denne artikel.

Navn	3-bogstavskode	1-bogstavskode	Ladning
Alanin	Ala	A	0
Valin	Val	V	0
Leucin	Leu	L	0
Isoleucin	Ile	I	0
Prolin	Pro	P	0
Methionin	Met	M	0
Phenylalanin	Phe	F	0
Tryptophan	Trp	W	0
Glycin	Gly	G	0
Serin	Ser	S	0
Threonin	Thr	T	0
Cystein	Cys	C	0
Tyrosin	Tyr	Y	0
Asparagin	Asn	N	0
Glutamin	Gln	Q	0
Asparaginsyre	Asp	D	-1
Glutaminsyre	Glu	E	-1
Lysin	Lys	K	+1
Arginin	Arg	R	+1
Histidin	His	H	+1

Tabel 1: Tabel over forskellige forkortelser for de 20 aminosyrer. De gule er upolære og hyfobe. Alle de 3 blå grupper er polære og hydrofile. Men de to nederste lyseblå grupper er hhv. positivt og negativt ladede.   

Sekundærstruktur

Sekundærstrukturen af et område på aminosyresekvensen er defineret som den lokale rumlige struktur af kæden uden hensyn til sidegrupperne. Primærstrukturen kan således resultere i mange områder med forskellige sekundærstrukturer (Figur 4). Sekundærstrukturen bestemmes af hydrogenbindinger mellem aminosyrerne i primærstrukturen. De to bedst definerede sekundærstrukturer er α-helixen og β-sheets.

Figur 4: Ovenfor er vist primær, sekunder og tertiær struktur for det antimikrobielle peptid Plectasin, som I vil høre mere om i AMP artiklen. Det kan ses, hvordan der er flere sekundære strukturer gemt i den primære struktur.  

α-helixen
α-helixen har sin helixstruktur tilfælles med DNA; men der stopper lighederne også (Tabel 2).

α-helixens rygrad er arrangeret som en spiral, som sidegrupperne tilnærmelsesvis stikker lige ud fra. Helixen holdes sammen af hydrogenbindinger mellem hver femte aminosyre. Hydrogenbingen sker mellem carbonylgruppen på aminosyre 1 (n) og aminogruppen på aminosyre 5 (n + 4). Derudover kan der også være vekselvirkninger mellem sidegrupperne på hver femte aminosyre, der stabiliserer strukturen. F.eks. kan hydrofobe vekselvirkninger (sidegrupper der er hydrofobe og derfor afskyr vand tiltrækkes af hinanden) eller ionbindinger mellem positive og negative ladede sidegrupper være med til at stabilisere strukturen (Figur 5).  

Figur 5: Til venstre er hydrogenbindingerne mellem rygraden i α-helixen vist med grønt. Til højre ses sidegrupperne alene.

β-sheets

Hvor α-helixen er en rumlig kompakt struktur, er β-sheets det modsatte. Her er rygraden af aminosyrer strakt helt ud, således at β-sheets bliver 3,5 Å længere pr. aminosyre sammenlignet med de 1,5 Å pr. aminosyre i α-helixen. Sidegrupperne stikker ud vinkelret på β-sheetet, således at hveranden sidegruppe kommer ud på hver sin side (Figur 6, billede 3). Ved aminosyre 1 stikker den opad, og ved aminosyre 2 stikker den nedad osv.. Der skal mindst to strenge til at definere en β-sheet, men mange β-sheets har mange flere strenge. β-Sheets stabiliseres ligesom α-helixen af hydrogenbindinger. β-sheets kan være enten parallelle eller antiparallelle (Figur 6).

Figur 6: På ovenstående billede ses fire forskellige billeder af det samme β-sheet i enzymet Thioredoxin (hele enzymet ses på billedet 4). Thioredoxin katalysere dannelsen af svovlbroer i E. coli. På billede 3 ses hydrogenbindingerne mellem polypeptidet. Læg mærke til, at der er parallelle og antiparallelle β-sheets på billede 1. På billede 2 ses, hvordan sidegrupperne skiftevis stikker op og ned i β-sheets.

Tertiærstruktur

Tertiærstrukturen defineres som den rumlige struktur af et proteinmolekyles atomer uden hensynstagen til andre proteinmolekyler. Tertiærstrukturen bestemmes ofte af svovlbroer samt af hydrofobe og hydrofile aminosyrer. Forestil dig, at et protein skal foldes i det vandige miljø i cytoplasma. Det vil naturligt være sådan, at når proteinet er foldet, vil de hydrofile aminosyrer vende ud mod vandet. Inderst inde i proteinet vil de hydrofobe aminosyrer samles. Dette vil give den mest stabile struktur, idet de aminosyrer, der ikke kan ”lide” vand, er ”gemt” inde i proteinet. Nedenfor er omtalt to vidtforskellige eksempler på dette. Dels myoglobin, der er et iltbindende protein der findes i vores muskler (Figur 7), dels en aquaporin, der er en vandkanal, som sidder i cellemembranen og lader vand flyde ind og ud af cellen (Figur 8).  

Figur 7: På billedet af myoglobin ses, hvordan overfladen er dækket af de blå hydrofile aminosyrer. Man kan også se det iltbindende molekyle i rødt øverst på figuren. Holdes musen over billedet, skæres myoglobin midt over, og man kan se midten af proteinet.  Det ses, at kernen af proteinet udelukkende består af de gule hydrofobe aminosyrer.

Figur 8: På billedet ses en vandkanal, der sidder i cellemembranen. Det ses, at kanalen har et "bælte" af hydrofobe, gule aminosyrer. Grunden til dette er, at proteinet sidder i membranen og er omgivet af lipider, der også er hydrofobe. Toppen og bunden af kanalen stikker hhv. uden for og inden for cellen, hvor der begge steder er vand. Derfor er begge disse regioner besat med hydrofile aminosyrer. Holdes musen over billedet, kan man se en kanal af hydrofile aminosyrer inden i det overskårne protein. Det er pga. proteinets indre hydrofile aminosyrer, at vand kan slippe gennem denne kanal.

Nogle gange resulterer en aminosyrekæde i op til flere kompakte regioner, kaldt domæner. Der er stadig tale om en enkelt peptidkæde; men denne foldes altså som perler på en snor (Figur 9). Et domæne er et lokalt område på proteinet, der har en defineret struktur og måske en bestemt katalytisk eller substratbindende funktion. F.eks. kan et domæne binde substratet, mens et andet kan være dér, hvor selve reaktionen finder sted.  

Figur 9: Dette protein (CD4-receptor på T-hjælpeceller) er med til at aktivere immunforsvaret. Som det ses er der fire domæner (gult, rødt, grønt og blåt) på det samme protein.

Kvatenær struktur 

Den kvatenære struktur beskriver, hvordan de forskellige peptidkæder, også kaldt subunits, vekselvirkninger i et funktionelt proteinkompleks. Det er udelukkende svage typer af bindinger (Van der Waals, hydrogenbindinger, hydrofobe vekselvirkninger osv.) samt svovlbroer, der holder proteiner med kvatenær struktur sammen. Man vil ofte se, at en subunit er den regulatoriske subunit, mens en anden er den katalytiske, afhængigt af hvilken funktion proteinet har. En regulatorisk subunit er den del af proteinkomplekset der regulere aktiviteten af proteinet.  

Figur 10: Her ses den cirkel som de fire subunits i hæmoglobin danner, når de sidder i hæmoglobins kvatenære struktur. De to gule og de to grønne subunits er identiske. Holder du musen over figuren, vil du se, at der kun er den ene gule subunit tilbage. Den er nærmest identisk med myoglobin (Figur 7). Altså er den funktion, man har i myoglobin (oxygentransport) brugt flere steder i naturen (menneskekroppen), men tilpasset de forskellige miljøer.

Proteinstruktur og Antimikrobielle Peptider

Som I vil se senere, er strukturen af antimikrobielle peptider afgørende for deres funktion, og opdelingen af antimikrobielle peptider i forskellige klasser. F.eks. vil AMP, der består af en α-helix, ofte virke ved at lave porer i mikrobernes membraner. De går sammen (ofte otte enkelte peptider) og danner tilsammen en kanel i membranen. Et eksempel på dette er Magainin. Nedenfor kan I se, hvordan de forskellige niveauer af proteinstruktur er afgørende for dette AMPs egenskaber. Læg mærke til, hvordan informationerne gemt i primærstrukturen (og derfor også i DNA-sekvensen) er helt afgørende for peptidets egenskaber.

Primærstrukturen på magainin er sammensat, således at der midt i molekylet er en række positive basiske aminosyrer (arginin (R), histidin (H) og lysin (K)), hvilket giver en hydrofil og hydrofob overflade, når proteinet folder sammen til sin sekundærstruktur. 

GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS

Sekundærstrukturen – en α-helix – folder sammen, således at de basiske aminosyrer er på en side, mens de hydrofobe (grønne ovenfor) er på en anden. Dette kan man også se i sekvensen idet, der ifølge tabel 1 ovenfor, er ca. 3,5 aminosyrer pr. omdrejning i en α-helix. Med andre ord et amfipatisk molekyle. Den hydrofile del med de basiske aminosyrer er uhyre vigtig, da det er den, der gør, at AMPet kan bindes til den negativt ladede membran. Vigtigheden af membranens egenskaber vil blive beskrevet i næste artikel.

Figur 11: Model af magainin. Blåt = basiske aminosyrer (cationiske og hydrofile). Gult = hydrofobe aminosyrer. Læg mærke til, at der er en hydrofil overside og en hydrofob underside. Altså er magainin amfipatisk.

Kvarternærstrukturen opstår først, når de enkelte AMP sidder nede i membranen. Herefter finder de sammen og danner en pore i sæt af otte. I denne pore vil den hydrofobe del af hvert AMP vende ind mod membranen, mens den hydrofile del vil vende ud mod kanalen. Dermed er det sekundærstrukturen, der bestemmer, hvor godt de binder til membranen, men det er kvarternærstrukturen der gør det af med mikroben. Dette er et godt eksempel på, hvorfor det er vigtigt at snakke om proteinstruktur på flere niveauer. Se Figur 11 og 12 nedenfor.

Figur 11: På billedet ses den foreslåede struktur af et AMP kaldet trichotoxin når det sidder i en kvartenærstruktur i en membran. Det er 8 identiske trichotoxin peptider der er gået sammen i en kvartenærstruktur og har dannet en porer i membranen. Læg mærke til at "rummet" mellem inder- og ydersien af membranen ikke er tomt, men fyldt op af lipidkæder. De er her fjernet for at vise poren gennem membranen. Endvidere er der naturligvis vand på begge sider af membranen. Den valgte repræsentation af membranen er en stilistisk version af lipidernes hovedgrupper, og den er naturligvis væsentligt mere ujævn og irregulær i virkeligheden. 

Figur 12: Her ses kvarternærstrukturen fra oven. Her kan det tydeligt ses at de 8 identiske trichotoxin peptider danne en porer hvor igennem ioner kan løbe frit.

Læs mere

Om Christian Anfinsens Nobelpris i 1972

Biografi af Christian Anfinsen samt kort beskrivelse af hans arbejde til at bestemme forholdet mellem primær struktur og tertiær struktur. Anfinsen har to gange været ansat på Carlsbergs Forskningslaboratorium i København.

Om John B. Fenn, Koichi Tanaka (for Massespektrometri) og Kurt Wüthrichs (for NMR) Nobelpris i 2002

Giver en rigtig god introduktion til massespektrometri og NMR. NMR eller nuclear magnetic resonance er den teknik der bruges til at bestemme proteiners 3-D struktur. Gode illustrationer og rigtigt godt forklaret.

Kvatenær struktur

Gode illustrationer af kendte proteiner med kvatenære strukturer.

Proteinkemi

Utrolig god introduktion til basal proteinkemi. Gode illustrationer og animationer, der giver en god forståelse for den kemi, som giver proteinerne deres funktion.

Proteinstruktur (1)                            

Rigtig god introduktion til proteinstruktur. God grafik og illustrationer, men meget kort beskrivelse. For at kunne bruge siden skal man har CHIME installeret på sin PC. Du kan downloade CHIME her.

Proteinstruktur (2)

Også utrolig god introduktion til proteinstruktur, men kræver en større kemisk viden end Proteinstruktur (1). Mange flotte illustrationer illustrationer.

Proteinstruktur (3)

Omfattende side med en dybtgående forklaring på kemien bag proteinstrukturer. Der er meget om de fysisk/kemiske aspekter omkring peptidbindinger og sekundære strukturer. Siden er primært for elever med kemi på A-niveau.