2. Myostatins proteininteraktioner og organismers slægtsskab

Introduktion

Myostatin, der også er kendt som Growth/Differentiation factor 8 (GDF8), er et protein fra TGF-β-familien (TGF = Transforming growth factor, se infoboks 1). Proteinet har en negativ virkning på muskelvækst og inhiberer dermed både muskeldifferentiering og -vækst ved at binde til receptorer på muskelceller.  En mangel på myostatin som f.eks. følge af en mutation i genet eller inhibering af proteinet vil således føre til øget muskelvækst.

For "hverdags"- eksempler på myostatin inhibitorer kan følgende artikler læses:

• Super Babies reveal the Key to Strength Gene, engelsk artikel fra singularityhub.com, 2009
• New Supertrout Set To Muscle Its Way Into Supermarkets, engelsk artikel fra slantedscience.com, 2010

Follistatin kodes af genet FST, og er et protein, der binder til proteiner fra TGF-beta-familien og derved inhiberer dem. Follistatin binder især til proteinet activin, men også til myostatin hvormed det blokerer for myostatins funktion. Follistatin vil således bevirke øget muskelvækst, da inhiberingsproteinet (myostatin) for muskelvækst selv bliver inhiberet.

Figur 1. Myostatin hæmmer transkription, så der er mindsket muskeldifferentiering. Follistatin inhiberer myostatin og vil dermed bevirke øget genudtrykkelse og dermed øget muskelvækst.

Øvelses oversigt 

Øvelse 2 er sat sammen af fire deløvelser (A-D). Nedenfor kan du se en grafisk oversigt over de forskellige øvelser.  

2.A. UniProt

Formålet med denne øvelse er at lære at søge efter og gøre sig bekendt med proteiner ud fra den information, der er tilgængelig gennem UniProt. Dette gøres ved at benyttefritekstsøgekriterier eller accessionnumre (se infoboks 2) og derefter undersøge UniProt-siderne for de proteiner, der blev fundet.

a)

Benyt den generelle guide til søgning i UniProt til at søge efter de ønskede proteiner. Du kan vælge enten at have to UniProt-sider åbne i hver sit vindue og foretage de to søgninger samtidig, eller du kan lave del 2.A.a og del 2.A.b for først myostatin og derefter gentage dem for follistatin.

Du skal søge efter: 

1. Myostatin, der skal komme fra mennesker.
2. Follistatin, der skal komme fra mennesker.

NB! Husk at proteiner ofte har både et populært navn (f.eks. myostatin) og et videnskabeligt navn (f.eks. differentiation factor 8 for myostatin).
Du kan gå til UniProt-databasen ved at klikke her. Husk eventuelt at åbne to vinduer, da du skal lave to søgninger.

1. Hvad er accessionnummeret for de to proteiner?

b)

Gå til de to proteiners UniProt-side og svar på nedenstående spørgsmål. Dette skal du gøre for at få et overblik over UniProt-siderne samt finde ud af, hvilke informationer man kan få omkring proteiner gennem UniProt.
De to første spørgsmål kan besvares ved at se øverst på proteinernes UniProt-side.

2. Hvad er proteinernes anbefalede navn (eng. recommended name) og deres gennavn (navnet på det gen der koder for proteinet)? 
3. Hvor lange er sekvenserne i aminosyrer (fork. AA)?
4. Gå til afsnittet "General annotation (Comments)".
   Hvad er deres funktion og subcellulære lokationer (se infoboks 3)? Follistatin har et bindingsdomæne specifikt for proteiner fra TGF. Hvilken proteinfamilie tilhører myostatin? Hvordan tror du, at det passer med follistatin (tror du, at proteinerne interagerer)? 
5. Hvad ville der ske, hvis der kun var myostatin i kroppen? Hvad vil der ske, hvis der både er myostatin og follistatin?
6. Gå til afsnittet "Sequence annotation (Features)".
   Follistatin binder som nævnt til proteiner fra TGF-β-familien, hvad hedder dette domæne på proteinsekvensen for follistatin, og på hvilke positioner kan det findes?
   NB! Se afsnittet Molecule processing under Sequence Annotation.

2.B PDB

Formålet med denne øvelse er at lære at finde relevant information om et protein gennem dets PDB-side, så de rette dele kan observeres gennem tredimensionel visualisering i PyMol. 

a)

Gå til PDB databasen og søg efter PDB-siden med id 3HH2. 

1. Hvilke molekyler kan man se i PDB id'et?
2. Hvor mange kæder indeholder id’et, og hvor mange af disse er identiske? Hvad er navnet på dem (A, B, C...)? Hvad koder de for (myostatin, follistatin...)?  
   NB! Dette kan findes under Sequence-fanen, se et billede af det her.
3. Hvor mange aminosyrer indeholder hver af kæderne, og hvilken position på kæden er henholdsvis den første og den sidste aminosyre på? Stemmer dette overens med længden af de færdige proteiner, som du fandt i 2.A.6 (109AA for myostatin og 315AA for follistatin)?  
   NB! Dette kan også ses vises gennem Sequence-fanen.

Viden omkring hvilke kæder PDB id’et indeholder, hvad disse koder for og hvilke dele af selve aminosyresekvensen id’et indeholder, kan benyttes i PyMol til at undersøge proteinerne tredimensionelt, markere kæderne og interessante aminosyrer eller observere interaktioner når PDB id’et indeholder mere end et protein.

2.C PyMol

Formålet med øvelsen er at lære at benytte PyMol til tredimensionel visualisering af proteiner samt at markere relevante kæder og dermed præsentere proteiner på en overskuelig måde.

a)

Åben PyMol og hent aktin-DNAaseI komplekset med PDB-id 1ATN. Benyt herefter den generelle guide til PyMol og kommandosiden for at lære PyMol og relevante kommandoer at kende så du kan gøre følgende:

1. Vis alle molekylerne i tegningsstruktur.
   NB! Det anbefales først at gemme (hide) alting og derefter benytte vis (show).
2. Farv de fire forskellige kæder hver deres farve (kæde A+B en nuance fx blålige og kæde C+D en anden fx rødlige).  
3. Visualiser TB-domænet (TGF- β -familiens bindingsdomæne) på follistatin-molekylet (kæde C og D). Det skal vises med både sidekæde og separat farve. Via deløvelse 2.a fandt man ud af, hvor TB-bindingsdomænet på follistatin-molekylet sidder. Hvis ikke denne øvelse er udført, sp , udgør dette domæne aminosyrerne i intevallet 30-103 på det ikke-færdige protein og dermed aminosyrerne 1-74 på det færdige. 
   NB! Vælg først aminosyrerne, vis sidekæder og farv dem til slut.
4. Visualiser kun én myostatin- og én follistatin-kæde, fx kæde A og C. Med en generel viden omkring protein interaktioner, vil du så antage, at det er det korrekte domæne, der på follistatin interagerer med myostatin?  
   NB! Vurderingen kan foretages ved at benytte hide og derefter den kæde man ikke vil se.
5. Udforsk selv PyMol og de forskellige måder, som molekylerne kan fremstilles på. Eksempelvis kan baggrundsfarven ændres, skyggerne kan justeres, måderne, hvorpå α-helix og β-plader i den sekundære struktur bliver vist, kan ændres og meget andet.

2.D FigTree

Formålet med øvelsen er at blive bekendt med FigTree og at kunne benytte programmet til at visualisere et evolutionært slægtskab mellem forskellige organismer.

a)

Hent filen myostatin_alignment.ph her. Filen er lavet ved sekvens alignments (læs mere her) i programmet ClustalX, og det er en træ-fil af formaten Newick. Newick formatet bruges til træ-filer, og i formatet bliver det evolutionære slægtskab mellem træets arter angivet som distancen mellem arterne.

Marker al teksten i myostatin_alignment.ph og kopier den over i en tekst editor som f.eks. Notepad på Windows computere eller TextEdit på Apple computere. Gem filen som en almindelig tekstfil som myostatin_alignment.ph. Det er vigtigt, at filen ender på .ph, da dette specificer, at filen er i et format kaldet phylip. Denne type fil bruges nemlig som input i programmet FigTree.

Åben FigTree og åben derefter myostatin_alignment.ph i programmet. Svar herefter på følgende spørgsmål: 

1. Er der en overordnet tendens til en gruppering (dannelse af clades, se infoboks 4) af de forskellige organismer? 
2. Hvilken organisme adskiller sig mest fra de andre, se her både på grenlængden og hvilken der intuitivt set (på baggrund af din viden om organismerne) adskiller sig mest?

b) 

For at kunne danne sig et overblik over et kronologisk slægtskab kan man lave en rod på træet. Roden laves ved at specificere ydergruppen (eng. outgroup, se infoboks 5), som er den organisme, der først divergerede væk fra de andre arter, som samlet kan betegnes som ingroup. Således kan der dannes en evolutionær tidshorisont.

3. Hvilken organisme vil du vælge som ydergruppe og hvorfor?

Lav nu træet med rod, dvs. lav en rod således at ydergruppen kommer tættest på roden og dermed længst væk fra de andre arter, benyt den generelle guide til FigTree for at se, hvorledes det gøres.

4. Er der sket nogle ændringer i de observerede grupperinger fra spørgsmål 1? Hvorfor/hvorfor ikke? 
5. Stemmer grupperingerne overens med din logiske viden omkring arterne og det slægtskab omkring dem, som du kender til?  
   NB! Benyt eventuelt funktionen Rotate til at vende grenene, dette ændrer ikke på selve slægtskabet, men kun på visualiseringen af træet.

Hvis der er tid, kan træet sammenlignes med et træ lavet fra den taxonomiske database hos NCBI.  Hent først listen med de arter, der ingår i træet her. Gem den i en tekst fil på din computer som myostatin_arter. Gå herefter til den taxoniske database ved at klikke her.

Benyt filen myostatin_arter i Choose file og vælg derefter choose subset. Boksen animals tjekkes af, og choose vælges for at visualisere træet. Arter med fed skrift er dem, der indgår i træet. De latinske navne for arterne skal kendes for at forstå træet, disse kan ses her.