3. Bioinformatisk analyse af antistoffer

Introduktion 

Antistoffer er en del af kroppens forsvar mod fremmede organismer. Antistoffer findes enten opløst i blodet eller på overfladen af B-celler. B-celler er en del af kroppens immunsystem og bekæmper bakterielle infektioner ved brug af antistoffer. Antistoffer kan bekæmpe fremmede organismer, da specifikke dele i antistoffet kan genkende peptidsekvenser som fremmede. Dermed startes en hurtig og effektiv immunrespons ved, at antistoffer binder til den fremmede organisme, så andre immunceller kan nedbryde den eller blokere det bundne proteins funktion.

Der findes fem forskellige typer af antistoffer. Ved typebestemmelse bruges antistoffers biokemiske navn immunglobuliner (Ig). De fem forskellige typer er IgA, IgD, IgE, IgG og IgM, hvoraf IgG er den mest udbredte (udgør 75 % af alle kendte typer antistoffer). Alle fem typer antistoffer har den samme "Y" grundstruktur, se figur 1, men varierer i antallet af kæder og mht. deres længde, samt hvor i kroppen antistofferne primært findes. Antistoffer er bygget op af tunge (eng. heavy) og lette (eng. light) kæder, og hver af disse er opdelt i konstante og variable domæner.

Figur 1. Opbygningen af et antistof. De lette kæder er vist med rød, og de tunge kæder er vist med blå. Desuden er de konstante domæner for hver kæde vist med en mørkere farve end de variable domæner. Bindingsstedet for proteiner fra? fremmede organismer er vist med trekanter og firkanter, hvilket indikerer at hver variable del genkender forskellige strukturer. Dog genkender hver kæde, f.eks. de to tunge kæder, i et antistof den samme struktur. Kæderne i et antstof er holdt sammen med svovlsulfid bindinger, hvilket er vist med de grå cirkler. 

De fem antistoffer har forholdsvis identiske konstante domæner, dvs. proteinsekvensen er den samme (se infoboks 1). De variable domæner er placeret i spidsen af antistoffets "Y" og er modsat de konstante domæner meget forskellige både mellem antistoftyperne, men også inden for de fem forskellige typer. Grunden til den store diversitet er, at de variable domæner er den del af antistoffet, der genkender proteinerne fra fremmede organismer. For at immunforsvaret kan genkende så mange forskellige fremmede organismer som muligt, skal der være mange forskellige antistoffer, der hver har et specifikt variabelt domæne, der genkender netop én fremmed organisme. Diversiteten i de variable domæner opstår ved mutationer samt genetisk rekombination (se infoboks 2), hvilke tilsammen giver de utallige antal af antistoffer, der fidnes.

De fem forskellige antistoftyper er inddelt i forskellige underklasser, der varier i forhold til deres fleksibilitet. Fleksibiliteten af et antistof har betydning for, hvilke fremmede organismer antistoffet kan binde, da strukturene er forskellige mellem de forskellige fremmede organismer. Des mere fleksibelt et antistof er, des mere komplekse strukturer kan det binde til. Fleksibiliteten af et antistof opstår i hængselsregionen, der er det sted i Y’et hvor de konserverede domæner på de tunge kæder knækker over i de konserverede dele på de lette kæder.

For mere information om antistoffer og immunsystemet anbefales det at læse Biotech Academy’s projekt om immunforsvaret. Projektet findes her.

Øvelses oversigt 

Øvelse 3 er sat sammen af tre deløvelser (A-C). Nedenfor kan du se en oversigt over de forskellige øvelser. 

3.A BLAST

Formålet med øvelsen er at blive bekendt og lære om BLAST, at kunne benytte BLAST til at bestemme hvilken superfamilie forskellige makromolekyler hører til (se infoboks 3), finde ud af hvor mange andre proteiner der ligner din sekvens samt finde PDB-siden for en given proteinsekvens.  

a)

Sekvensen for en tunge kæde fra et IgG antistof kan hentes her. Marker og kopier proteinsekvensen og gå derefter til BLAST hjemmesiden. Her skal du benytte proteinsekvensen til at lave en protein-BLAST (BLASTp) mod PDB-databasen (denne vælges under Choose search set, se mere her). Efterfølgende skal du besvare nedenstående spørgsmål. Som hjælp til udførslen af BLAST samt fortolkning af resultatet kan du anvende den generelle guide for BLAST, som du kan finde her.

1. Hvilken superfamilie hører sekvensen til?
   NB! Se på Specific Hits og Query sequence, se mere her.
2. Hvor mange sekvenser er næsten 100 % identiske (har ubrudte røde linier) med den anvendte IgG sekvens?

b)

Gå ned til området Descriptions og find de to resultatsekvenser, som du antager, er de bedste match til din IgG sekvens. Du skal tage højde for de elementer, der ifølge BLAST guiden er vigtige for et godt match.

3. Hvad er de to resultatsekvensers accessionnummer (se infoboks 4), max score, procent lighed (eng. query coverage) og e-værdi?
4. Hvorfor valgte du disse to sekevenser som de bedste? Argumenter for dit valg.

Ved at blaste din sekvens har du undersøgt databasen Protein Databank for proteinsekvenser, der er identiske med den proteinsekvens, du havde til at starte med. Udfra antallet af resultatsekvenser kunne du se, at der var mange sekvenser, der til en vis grad lignede din sekvens, men ved at se på e-værdier og antal sekvenser med ubrudte røde linier blev det klart, at kun få sekvenser egentlig matchede din sekvens.
Du skal nu videre til databasen Protein Databank og undersøge én af de to resultatsekvenser, du har fundet gennem BLAST.

3.B Protein Data Bank, PDB

Formålet med øvelsen er at lære at finde relevante informationer om et protein gennem dets PDB-side, der kan hjælpe til en optimal visualisering af proteinets tredimensionelle struktur. Den tredimensionelle struktur vil kunne visualiseres i programmet PyMol.

a)

Gå til PDB databasen og søg efter PDB-siden for det bedste hit fra 3.a. Hvis denne del ikke er lavet, søg da efter siden med PDB id 1IGY (se infoboks 5). Som hjælp til søgning samt guide til opbygning af proteiners PDB-side kan du bruge den generelle guide til PDB i denne øvelse. Guiden findes her.

1. Hvilken type immunoglobulin koder PDB id'et for (IgA, IgG etc.), og er det en bestemt subtype (1, 2, 3 etc.)?
   NB! Dette kan findes ved at se på PDB id'ets navn. 
2. Hvor mange kæder har antistoffet, hvor mange af disse er identiske, hvad er navnet på dem (A, B, C...), og hvilken type kæder er det (tunge, lette eller…)?
   NB! Dette kan findes under Sequence fanen, se en oversigt over området her.
3. Hvor mange aminosyrer indeholder hver af kæderne, og hvilke domæner er de delt op i (konstante, variable eller …)?
   NB! For hver kæde skal domæne og hvilke aminosyrerpositioner de dækker noteres, eksempelvis:
   Kæde A: position 1-100 er det variable domæne på den lette kæde, position 101-200 er det konstant domæne på den lette kæde.

Hvis der kigges på længden af den tunge kæde (434 aminosyrer) kan det ses, at længden ikke er den samme som den faktiske længde af kæden (474 aminosyre). Der mangler faktisk 40 aminosyrer. Manglen på aminosyrer kan skyldes fejlkilder forbundet med den eksperimentelle strukturbestemmelse. Fejlen er derfor ikke ensbetydende med, at de 40 aminosyrer mangler i kædens rigtige form. Man skal dog huske, at aminosyrerne mangler, hvis man skal arbejde videre med proteinet i f.eks. PyMol, da man ikke vil kunne visualisere de dele af strukturen, der mangler.

3.C PyMol

Formålet med øvelsen er at lære at benytte PyMol til tredimensionel visualisering af proteiner samt markere interessante kæder og dermed præsentere proteiner på en overskuelig måde.

a)

Åben PyMol og hent strukturen med PDB-id 1IGY. Benyt herefter den generelle guide til PyMol og kommandosiden for at lære PyMol og relevante kommandoer at kende så du kan gøre følgende: 

1. Vis alle molekylerne i tegningsstruktur.
   NB! Det anbefales først at gemme (hide) alting og derefter benytte vis (show) til at vise tegningsstrukturen.
2. Farv de fire forskellige kæder hver deres farve (kæde A + C en nuance fx blålige og kæde B + D en anden fx rødlige).
3. Har antistoffet den rette ”Y”-formede struktur og stemmer placeringen af de tunge og lette kæder overens med den forventede form?
   NB! Se eventuelt figur 1 for at se den ”Y”-formede opbygning af et antistof.
4. I øvelse 3.a.1 blev de to bedste resultater fra BLAST søgningen fundet, hvoraf det ene er det, der visualiseres i PyMol. Antistoffet fra det andet resultat skal hentes ind i det åbne PyMol vindue (hvis ikke 3.a.1 er lavet, hent da antistoffet med PDB id 1IGT). Antistoffet hentes til PyMol på samme måde som tidligere, nemlig ved brug af fetch.
   Rediger nu i det nyhentede antistof så det også kun bliver vist i tegningsstruktur. 
   NB! Det anbefales at de to antistoffer farves hver sin farve, dvs. alle kæderne i et antistof farves den samme farve.
5. Prøv nu at sammenlign (eng. align) de to antistoffer med hinanden og undersøg hvordan sammenligningen ser ud. Er de to antistoffer af samme type, f.eks. begge IgM? Hvis ja, tilhører de samme subklasse?
6. Udforsk selv PyMol og de forskellige måde antistofferne kan fremstilles på. Eksempelvis kan antistoffernes farve ændres, baggrundsfarven i PyMol vinduet kan skiftes, skyggerne kan justeres, måderne den sekundærstruktur bliver vist kan ændres og meget andet.