1. Aktin, fra mRNA til tredimensionelt protein

Introduktion

Aktin er et protein, som er højt konserveret på tværs af mange forskellige arter. Faktisk er der kun en variation på 20 % mellem aktin fra mennesker og det, der er fundet i alger.
Aktin er det protein, der danner grundlag for cytoskelettet i cellers cytoplasma, og det er en af byggestenene i muskler, hvor det danner en platform (eng. scaffold) for proteinet myosin. Platformen er det system, der kontrollerer muskelkontraktioner og dermed gør, at musklerne kan trække sig sammen (se infoboks 1).

Aktin dannes som et monomerisk molekyle, dvs. at det består af én enkelt subunit. For at aktin bliver funktionelt og derved opnår en struktur med en biologisk virkning, skal det danne en polymer (poly = mange). I muskler består aktin-platformen af mange aktin-molekyler, der er sat sammen til én lang kæde, der danner en funktionel struktur. 

Figur 1. Aktin og myosin i muskler. Et funktionelt aktin-molekyle er sat sammen af flere subunits (røde og blå cirkler), der holdes sammen ved hjælp af Tropomyosin og Troponin. Myosin-molekylerne bevirker, at aktin-komplekset kan glide frem og tilbage i en kontraherende bevægelse. Dette gøres ved, at myosin-hovederne binder til aktin, skubber det fremad og derefter slipper igen.  

Øvelses oversigt 

Øvelse 1 er sat sammen af fire deløvelser (A-D). Nedenfor kan du se en grafisk oversigt over de forskellige øvelser.

1.A Virtual Ribosome

Formålet med øvelsen er at blive bekendt med læserammer, strict/non-strict startcodon og betydningen af at vælge den rigtige læseramme. Dette er essentiel viden, når man skal anvende Virtual Ribosome til at translatere DNA-sekvenser korrekt. Du kan læse mere om læserammer her.

a)

Hent mRNA sekvensen for aktin her. Marker og kopier sekvensen. Gå herefter til Virtual Ribosome, der er et online translationsprogram, du kan finde her.

Translater sekvensen i Virtual Ribosome med standardindstillingerne, se guiden til Virtual Ribosome for programbrug.
Dan dig et overblik over outputtet ved at besvare følgende spørgsmål:

1. Hvad betyder tegnene >>> ))) og *** under sekvensen?
   NB! Du kan se et codon/translationsskema her.
2. Hvad er en læseramme, og hvilken er der blevet brugt til denne translation?
3. Kan det antages at dette er den rigtige læseramme for at få det korrekte protein, hvorfor/hvorfor ikke?

b)

Prøv at translatere sekvensen med hensyn til den mest almindelige startcodon ATG (se infoboks 2). Dette vil ikke ændre læserammen, dvs. translationen vil stadig starte på position 1 på den positive DNA-streng. Derimod vil translationen give det længste protein, der har ATG som startcodon, og ikke translatere hele sekvensen som før. Til denne søgning skal feltet Start codon: Strict ændres, se eventuelt guiden til Virtual Ribosome for program brug.  

4. Hvor langt er dette protein?
   Vil du (stadig) antage, at dette er det korrekte protein?

c)

Ved at vælge en strikt startcodon kan man nemt visualisere den længste aminosyresekvens (mellem start- og stopcodon) fra en given læseramme. Som regel vil man således hurtigt kunne danne sig et overblik over, hvorvidt det er en korrekt translation, da en peptidsekvens skal have en vis længde for at udgøre et funktionelt protein. Dog skal det påpeges, at der kan være pro-peptidsekvenser som f.eks. signalpeptider, der bliver kløvet af i det funktionelle protein, men vil være til stede, når DNA-sekvensen bliver translateret.
Prøv nu at translatere sekvensen med strikt startcodon på alle 6 læserammer, se guiden til Virtual Ribosome for hvordan dette gøres. 
Ved at kombinere alle 6 læserammer og have en strikt startcodon vil Virtual Ribosome finde den længste translaterede sekvens, der har ATG som startcodon på tværs af alle læseramerne.

5. Hvor langt er dette protein, og hvilken læseramme er blevet brugt til translationen?
6. Som nævnt finder Virtual Ribosome den længst translaterede sekvens, men kan det altid antages, at denne translation giver det korrekte protein, hvorfor/hvorfor ikke?

1.B UniProt

Formålet med denne øvelse er at lære at søge efter og gøre sig bekendt med proteiner ud fra den information, der er tilgængelig i UniProt. Dette gøres ved at benytte almene fritekstsøgekriterier eller accessionnumre og derefter undersøge UniProt-siderne for de proteiner, der findes gennem søgningerne.

a)

Benyt den generelle guide til søgning i UniProt til at søge efter det ønskede protein, når du ved at:

1. Det er aktin
2. Det skal komme fra mennesker
3. Det skal komme fra glat muskulatur (se infoboks 3) i en hovedblodåren (Aorta).

Foretag maksimalt tre søgninger og tilføj et kriterium efter hver søgning (Eksempel: I første søgning, søges der på insulin, i søgning 2 på insulin AND human osv.). Besvar følgende spørgsmål efter hver søgning:

1. Hvor mange sekvenser svarer til kriteriet?
2. Hvilket søgekriterie vil du tilføje for at indsnævre resultatet? Vil du benytte et AND-, OR- eller NOT-kriterium, hvorfor/hvorfor ikke?

Fortag nu søgningen med de nye søgekriterier.
NB! Benyt eventuelt den udvidede søgning og specificer feltet Field som beskrevet i den generelle guide for UniProt.

b)

Hvert protein har et accession nummer (se infoboks 4). Benyt nu proteinets accessionnummer, P62736, til at finde UniProt-siden for det given protein.
Ved at benytte det unikke accessionnummer er det nemt at finde et protein og dermed undgå at skulle gennemse en masse søgeresultater for at finde det korrekte protein.
Dan dig et overblik over UniProt-siden for proteinet og find ud af, hvilke informationer man kan få omkring proteinet ved at besvare følgende spørgsmål:

3. Hvad er proteinets anbefalede navn (eng. recommended name) og dets gennavn (navnet på det gen der koder for proteinet)?
4. Hvor lang er sekvensen i aminosyrer (fork. AA)?
5. Hvad er dets funktion, subcellulære lokation (se infoboks 5), og er der forbundet nogle sygdomme med det? 
6. Er der nogle pro-peptiddele i den translaterede sekvens (pro-peptider er aminosyresekvenser, der ikke er findes i det færdige funktionelle protein)? 
   NB! Se afsnittet molecule processing under Sequence annotation domænet.

1.C PDB

Formålet med øvelsen er at lære at finde relevant information om et protein gennem dets PDB-side, så de rette dele af det kan observeres gennem tredimensionellevisualiseringer i PyMol.

a)
Gå til PDB databasen og søg efter PDB-siden med id 1M8Q (se infoboks 6).

1. Hvilke molekyler kan man se i PDB id'et?
2. Hvor mange kæder (subunits) indeholder id’et, hvor mange af disse er unikke, hvad er navnet på dem (A, B, C...) og hvillke proteiner tilhører de forskellige kæder (Myosin, aktin...)?
   NB! Dette kan findes under fanen Sequence, se en oversigt over siden her.
3. Hvor mange aminosyrer indeholder hver af de unikke kæder, og hvilke positioner på kæden er i id’et?  
   NB! Dette kan findes ved at trykke show unique chains only.

Viden omkring hvilke kæder (subunits) PDB id’et indeholder, hvilke proteiner der hører til de forskellige kæder, og hvilke dele af selve aminosyresekvensen id’et reelt set indeholder, kan benyttes i PyMol til at undersøge proteinerne i 3D, markere kæderne, markere interessante aminosyrer eller observere interaktioner når PDB id’et indeholder mere end et protein.

1.D PyMol

Formålet med øvelsen er at lære at benytte PyMol til tredimensionel visualisering af proteiner samt at markere relevante kæder og dermed præsentere proteiner på en måde, der er overskuelig.

a)

Åben PyMol og hent aktin-myosin komplekset med PDB-id 1M8Q. Benyt herefter den generelle guide til PyMol og kommandosiden for at lære PyMol og relevante kommandoer at kende, så du kan gøre følgende:

1. Vis alle molekylerne i båndstruktur.
   NB! Det anbefales først at gemme (hide) alting og derefter benytte vis (show) til at gøre dette.  

2. Farv henhodsvis myosin- og aktin-kæderne hver deres farve og gem et billede af komplekset.
   NB! Du kan gemme ved enten at taget et screen shot eller filer → Save Image As → PNG. 
3. Aktin-myosin komplekset består af mange kæder, og det kan derfor forstyrre det overordende billede af komplekset og aktin-myosin interaktionen, når det vises som pinde-, bånd- eller tegningsstruktur. For at præsentere komplekset på en mere overskuelig måde kan man vælge kun at vise overfladen af proteinerne.
   Vis overfladen af alle proteinerne i komplekset og sammenlign med strukturen fra spørgsmål 2. Synes du, det er blevet nemmere at visualisere protienerne som en helhed?
4. I 4.A fandt du ud af, hvilke kæder aktin er kodet på. Benyt denne viden til at finde ud af, hvor mange aktin-proteiner der interagere med et myosin-molekyle, når du ved, at myosin-kæde P interagerer med aktin.
   NB! Start med at lokalisere kæde P ved farvning og zoom. Herefter kan kæde-specifik-farvning anvendes til undersøgelsen.  
5. Udforsk selv PyMol og de forskellige måder molekylerne kan fremstilles på. Eksempelvis kan baggrundsfarven ændres, skyggerne kan justeres, måderne, hvorpå α-helix og β-plader i den sekundære struktur bliver vist, kan ændres og meget andet.