Genkend metabolitter

Når stofferne i en prøve skal adskilles, bliver en dråbe af prøven afsat på den ene ende af gelen. Ved at lade en væske – den mobile fase – trække op igennem gelen, bevæger stofferne i prøven sig gennem gelen,. De enkelte molekyler i prøven bevæger sig gennem gelen med forskellige hastigheder, pga. de forskellige intermolekylære kræfter mellem for det første stofferne i prøven og den mobile fase samt mellem stofferne i prøven og den stationære fase.

Mulige intermolekylære interaktioner ved TLC:

Hvis nogle af stofferne i prøven er dipoler, kan der dannes dipol-dipol bindinger med gelen, fordi Si-O bindingen er polær. På den måde bliver molekylet bremset, når det bevæger sig gennem gelen sammen med den mobile fase. Da dipol-dipol bindingerne er ikke-permanente, bliver molekylet ikke stoppet fuldstændigt, men bremses gentagne gange på vej gennem gelen. Først dannes en dipol-dipol binding med én binding i gelen. Denne brydes, og molekylet kan bevæge sig lidt op gennem gelen. Så dannes der måske endnu en binding, der igen tilbageholder molekylet lidt tid, inden den brydes, og sådan fortsætter molekylets vej gennem gelen.

Elektronegative atomer fra visse komponenter i en prøve kan danne hydrogenbindinger med hydrogenatomerne på af silicagelen. Herved forsinkes molekylerne på vej gennem gelen, ligesom ved dipol-dipol bindingerne.

London-kræfter bidrager også til en svag forsinkelse af molekylerne gennem en silicagel.

Molekyler med mulighed for mange hydrogenbindinger vil naturligvis blive stærkere bremset end molekyler, der kun har mulighed for London-kræfter. Derfor skabes der et unikt mønster for hvert enkelt molekyle hvad angår bevægelsen.

Den specifikke mobile fase, der bruges i TLC’en, har også betydning for, hvordan stofferne i prøven bevæger sig. Forskellige løbevæsker (=den mobile fase) har forskellige grader af polaritet, og derfor vekselvirker de forskelligt med de forskellige stoffer i prøven. Det betyder, at det er individuelt for de enkelte prøver, hvilke blandinger der er bedst at benytte som mobil fase.

For at beslutte hvilken løbevæske der er bedst til at adskille stofferne i en prøve, kan man lave en række TLC-kørsler af prøven med forskellige blandinger af polære og ikke-polære opløsningsmidler, hvor graden af polaritet varierer.

Det er yderst usandsynligt at to stoffer har fuldstændig samme muligheder for hydrogen-, dipol-dipol- og London-bindinger. Da stofferne heller ikke vekselvirker på samme måde med solventen, bør der ikke være problemer i at adskille komponenterne på en TLC plade, hvis man har fundet den optimale løbevæske.

Da det ikke er alle molekyler, der kan ses på silicagelen med det blotte øje, er de fleste geler behandlet med et UV-fluorescerende stof. Når man lyser på pladen med UV-lys, vil stofferne ses som mørke pletter, der da kan afmærkes.

For at identificere de molekyler der er i prøven, og dermed hvilke molekyler der giver pletten på TLC pladen, måles den strækning, hver enkelt komponent har bevæget sig. Dette divideres med den afstand løbevæsken har bevæget sig, og giver da Rf-værdien (Retentions faktoren):

Den strækning en komponent har bevæget sig

Rf= Den strækning løbevæsken har bevæget sig

HPLC

I industrien bruger man ofte High-performance liquid kromatografi (HPLC). Koblet til en passende detektor (se herunder) er det ofte en meget følsom metode, og man kan derfor opdage og identificere meget små mængder af et enkelt stof i prøven. En simplificeret model af et HPLC-apparat kan ses på figur 4.

 

Den mobile fase er på væskeform, og den stationære fase er placeret i en kolonne, som er et rør, indeholdende den stationære fase.

Prøven, som man ønsker at analysere, bliver automatisk sprøjtet ind i apparatet, hvor den blandes med den mobile fase, Med et tryk på op til 400 atmosfære, bliver det hele derved presset gennem den stationære fase. I den stationære fase bliver de enkelte komponenter i prøven adskilt efter samme princip som i TLC. Endelig kommer stofferne gennem en detektor, der ved hjælp af UV-belysning skaber et unikt billede for alle de stoffer, som kan absorbere lyset. Stofferne kan således ses som en række toppe i et kromatogram. Den tid, det tager for hvert molekyle, fra det bliver sprøjtet ind, til der detekteres maksimalt signal for stoffet, kaldes retentionstiden.

Der findes to forskellige former for HPLC, ”Normal phase HPLC” og ”Reverse phase HPLC”. Reverse phase (omvendt fase) kromatografi er den mest benyttede, men her beskrives princippet bag dem begge.

Normal fase HPLC:

I denne type HPLC, er solventblandingen en ikke-polær væske. Denne væske vekselvirker derfor kun med komponenter i prøven gennem London-kræfter. Den stationære fase derimod, består ofte af meget små polære silica-partikler, dvs. det stof der også benyttes som stationær fase ved tyndtlagskromatografi. Disse partikler er bygget op af atomer af grundstoffet silicium, der er sat sammen via oxygen atomer, i et kovalent bundet netværk. Silicium er i hovedgruppe 4 i det periodiske system, og har således fire elektroner i yderste skal. Atomet er derfor tetravalent og mangler fire elektroner for at opfylde oktetreglen. Den kan opfyldes ved binding til fire oxygenatomer. Opbygning af silicagelen kan ses på figur 3. Det øverste lag af oxygen er bundet til hydrogenatomer, se ligeledes figur 3, således at oktetreglen også er opfyldt for disse oxygenatomer.

Eftersom silica-partiklerne er polære, er det stoffernes molekylære egenskaber, der afgør, om de helst vil ”opholde sig” i den mobile fase eller bliver ”bremset” af den stationære. Det bestemmer, hvor hurtigt komponenter fra ens prøve bevæger sig gennem kolonnen.

Hydrogenatomerne på overfladen af silicagelen kan indgå hydrogenbindinger med elektronegative atomer fra visse komponenter, der er til stede i den analyserede prøve. Det forsinker også molekylerne på vej gennem kolonnen.

London-kræfter bidrager ligeledes til en svag forsinkelse af molekylerne gennem kolonnen.

Molekyler med mulighed for mange hydrogenbindinger vil naturligvis blive stærkere bremset end molekyler, der kun har mulighed for London-kræfter. Derfor vil retentionstiden være unik for hver enkelt komponent. Eventuelle vekselvirkninger mellem solventen og ens prøve vil også have indflydelse på retentionstiden for et stof, hvilket yderligere bidrager til unikke retentionstider for de forskellige molekyler.

Når stofferne er kommet gennem kolonnen, når de til slut til detektoren. Her benyttes ofte UV-bestråling til at detektere de komponenter, der passerer. En række organiske stoffer har den egenskab, at de kan absorbere UV-lys af forskellige bølgelængder. Egentlig er det ikke hele stoffet der absorberer UV-lys, men kun de forskellige funktionelle grupper molekylet indeholder. Således vil en carbonylgruppe (se figur 5) fra ét stof absorbere UV-lys ved samme bølgelængde som en carbonylgruppe siddende i et andet molekyle.

Rent praktisk foregår detekteringen ved at der udsendes UV-lys af en bestemt bølgelænge på den ene side af den passerende mobile fase. På den anden side er monteret en fotodetektor. Fotodetektoren måler, hvor meget lys der er tilbage, efter det har passeret prøven. Den bestememr således mængden af absorberet lys. Dette omsættes til signal-toppe på et kromatogram, hvor signal-toppen viser den pågældende retentionstid. Mængden af absorberet lys afhænger af, hvor mange molekyler der passerer til en given tid. Det kommer til udtryk ved arealet af den tegnede top. Der vil altså være en sammenhæng mellem dette areal og koncentrationen af stof i prøven. Det er som nævnt er de enkelte funktionelle grupper i et molekyle, der absorberer lys. Derfor kan det såkaldte UV-spektrum for det enkelte stof, sagtens være en række toppe af forskellig størrelse, placeret op af hinanden, såfremt molekylet indeholder flere funktionelle grupper. Unikke stoffer kan derfor give anledning til meget karakteristiske UV-spektre.

Man vælger bølgelængden for UV-strålingen, så den ”passer” med de funktionelle grupper, der findes i de stoffer, man forventer, er til stede i prøven. Da den mobile fase også absorberer UV-lys, skal man som minimum benytte en bølgelængde, der er højere end den, solventen absorberer.

Afhængigt af de substanser man ønsker at analysere, kan forskellige kolonner benyttes. Der findes dog en række forskellige måder at opbygge kolonner på, idet de kan variere i partikelstørrelse, kolonnediameter og længde, samt i det materiale der benyttes som stationær fase. Det samme gælder for solventer. Her kan også benyttes en række forskellige, og hvilken der er bedst for en specifik prøve, må bestemmes eksperimentelt. Retentionstiden for et givent molekyle varierer naturligvis, når der benyttes forskellige kolonner og solventer, samt forskellige temperaturer af kolonnen. Det er derfor ekstremt vigtigt at notere de betingelser ens HPLC-analyse er blevet udført under.

For visse stoffer kan man finde deres retentionstider i standardtabeller. Det er her vigtigt at benytte en tabel, der knytter sig til den type HPLC, man ønsker at bruge. Det er dog altid en god idé at lave en standardprøve med de rene stoffer af de komponenter, man forventer at finde i prøven. Standardprøven skal analyseres under de samme betingelser som prøven. Kun da kan man være helt sikker på den retentionstid og det mønster et givent stof giver. En standard kan også benyttes, hvis man ønsker at kende koncentrationen af et bestemt stof i prøven. Der forberedes da en række standardprøver med kendte koncentrationer, f.eks. 1, 2 og 10 mmol/L. Ved at udregne arealet under signal-toppene for dette stof kan der laves en korrelation mellem signal-toppens areal og koncentrationen af stof i standarden. Denne korrelation laves ved at tegne en standardkurve med arealet under toppen som funktion af koncentrationen. Dette kan nu sammenlignes med signal-toppens areal for det samme stof i prøven. Koncentrationen af stoffet kan derpå findes ved simpel forholdsregning.

Når resultatet af HPLC skal læses, ses der altså på kromatogrammet, som indeholder signal-toppene. Der sammenlignes med HPLC-resultater af prøver med rene stoffer, og man kan – ved at sammenligne retentionstid og mønster af toppene – nu identificere ønskede stoffer og mængder i ens prøve.

Tabel: http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/Detectors/det_uvab.html

Det signal, der kommer når et stof observeres, viser sig som en række signal-toppe, der opstår på bestemte tidspunkter. Herved bestemmes den tid, der er gået fra prøven blev injiceret til den blev detekteret. Den tid kaldes også retentionstiden.

 

Kolonnen:

Kolonnen er et langt, fleksibelt rør med en længde på et par meter. Røret indeholder den stationære fase. De kolonner, der oftest benyttes, kaldes kapillærkolonner.

Der findes to former for kapillærkolonner: wall-coated open tubular (WCOT) og support-coated open tubular (SCOT). I begge tilfælde er kolonne-diameteren et par tiendedele mm. En WCOT består af et rør, hvis inderside er dækket med den flydende stationære fase. En SCOT er ligeledes et langt rør, men her er indersiden først belagt med et tyndt lag materiale, f.eks. silica, på hvilket den flydende stationære fase er adsorberet. Kolonnen ligger rullet op inde i kolonneovnen, som vist på figur 6. Her kan temperaturen kontrolleres.

Når en prøve bliver ”båret ind” i kolonnen af den mobile fase, er der en række faktorer, der medvirker til separationen af de enkelte komponenter.

Først og fremmest er der opløseligheden af en komponent i den flydende stationære fase. Hvis komponenten er letopløselig, vil den befinde sig i væskefasen, og dermed ikke bliver båret med af gassen ligeså nemt som uopløselige stoffer. Dette vil resultere i en lang retentionstid.

Også kogepunktet af en komponent er af betydning for retentionstiden. Hvis et stofs kogepunkt ligger over kolonnens temperatur, vil stoffet kondensere, når det kommer ind i kolonnen. Dermed vil stoffet være sværere at transportere med gassen, og derfor vil retentionstiden blive længere.

Under en analyse er den typiske fremgangsmåde, at kolonnetemperaturen øges undervejs. Dermed får man først de stoffer igennem, som er svært opløselige i væskefasen, og som har lave kogepunkter. Senere kan man nå til en temperatur, hvor stoffer, der før var kondenserede, nu går på gasform, og derfor bæres igennem kolonnen. Desuden kan stoffer, der før var i væskefasen, opnå så høj en energitilstand ved forhøjet temperatur, at vekselvirkingerne med væsken ikke længere består, og de derfor vil bevæge sig over i gasfasen.

Efter prøvekomponenterne har passeret kolonnen, når de til detektoren. Der findes en række forskellige detektorer, der alle benyttes ved forskellige formål. Nogle detektorer ødelægger komponenterne i prøven, hvilket ikke er så hensigtsmæssigt, hvis man gerne ville analysere videre på prøven, f.eks. ved massespektroskopi. Andre detektorer bevarer prøven. Der er også forskel på, hvor præcise forskellige detektorer er til at bestemme koncentrationer. Valget af detektor afhænger således af de krav man har til analysen.

Fælles for mange detektorer er, at de reagerer ved at danne en strøm. Størrelsen af denne strøm vil afhænge af, hvor meget stof der er i prøven. Når der observeres en strøm i systemet, giver det udslag i form af en signal-top på et diagram, på tidspunktet for detekteringen. Dette signal kan enten vises via online måling på en computer, eller på en gammeldags grafskriver. Resultatet af gaskromatografien er derfor et diagram, hvorpå man kan aflæse retentionstider for detekterede stoffer. Ved hjælp af toppens størrelse kan man bestemme koncentrationen af et stof. Ved at sammenligne med en standardprøve indeholdende udelukkende det eller de stoffer, man ønsker at analysere for, kan sammensætningen af ens prøve bestemmes.

Hvis man vil bestemme, hvor meget der er til stede i prøven af et specifikt molekyle, kan der analyseres en række standardprøver med varierende koncentrationer. Ønskes det at bestemme hvor meget ethanol, der er til stede i en prøve, laves først en standardrække, hvor prøver med f.eks. 1, 2, 5 og 10 mmol/L rent ethanol analyseres. For hver prøve vil der dannes en top på et diagram af en bestemt størrelse. Arealet under hver signal-top udregnes, og en korrelationmellem koncentration og signal-top arealet kan da findes. Dernæst analyserer man prøven, hvori man forventer at finde ethanol. Arealet af signal-toppen ved retentionstiden for ethanol udregnes. Via koncentration/areal-korrelationen kan koncentrationen af ethanol i prøven nu bestemmes ved simpel forholdsregning.